日糧添加丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊脂肪酸代謝和肉品質(zhì)的影響

王威皓，竇 露，康樂(lè)天，王宏迪，段 艷，蘇 琳，趙麗華，武海峰，靳 燁,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.察哈爾右翼中旗農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 013550）

羊肉具有肉嫩味鮮、低脂肪和高蛋白等特點(diǎn)，隨著生活水平的提升和健康意識(shí)的增強(qiáng)，人們對(duì)肉類食品的食用品質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的追求越來(lái)越高。肉中的脂肪酸不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可以影響肉類食品的風(fēng)味。前人研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)化合物（如磷脂酰膽堿、甘油三酯、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸）是肉類風(fēng)味形成中重要的前體物質(zhì)，多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生醛、醇、酮及酯類等揮發(fā)性物質(zhì)在適宜范圍內(nèi)能提高肉質(zhì)的香味[1]。在肌肉中，脂肪酸主要存在于肌內(nèi)脂肪，與肉質(zhì)的多汁性、適口性及嫩度密切相關(guān)，因此提高肌內(nèi)脂肪沉積也成為高檔羊肉生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)和突破點(diǎn)[2]。

反芻動(dòng)物產(chǎn)品中的脂肪酸組成及含量主要受日糧營(yíng)養(yǎng)、瘤胃微生物代謝以及脂肪代謝相關(guān)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，其中瘤胃微生物可通過(guò)生物氫化作用和瘤胃發(fā)酵影響肌肉的脂肪酸組成[3]。Gillis等[4]研究發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物可將68%～84%的不飽和脂肪酸氫化為飽和脂肪酸。Dai Xiaoxia等[5]研究發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)Selenomonas_l屬的豐度與α-亞麻酸的含量呈負(fù)相關(guān)，該菌屬通過(guò)參與琥珀酸-丙酸途徑產(chǎn)生ATP，為氫化α-亞麻酸提供能量。因此調(diào)控瘤胃微生物結(jié)構(gòu)組成可以促進(jìn)肌肉中有益脂肪酸的沉積。已有研究發(fā)現(xiàn)益生菌在調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能和提高肉品品質(zhì)方面均具有良好的特性[6]。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是一種革蘭氏陽(yáng)性益生菌，能夠在機(jī)體中發(fā)揮免疫、抗氧化以及抑制致病菌的作用。此外，丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸-乙酸和丁酸是肌內(nèi)脂肪合成過(guò)程中重要的前體物質(zhì)[7]。Cai Qiaoli等[8]在環(huán)江小型豬日糧中添加丁酸梭菌，發(fā)現(xiàn)環(huán)江小型豬肌肉中非必需氨基酸含量、單不飽和脂肪酸含量和大理石紋評(píng)分顯著提高。Tian Zhimei等[9]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌能促進(jìn)育肥豬肌肉中硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）基因表達(dá)，提高肌內(nèi)脂肪的含量。以上研究證明益生菌能影響機(jī)體脂肪酸代謝和肌肉品質(zhì)，但通過(guò)飼喂益生菌建立反芻動(dòng)物瘤胃微生物和脂肪代謝相關(guān)基因與脂肪酸代謝的關(guān)系，進(jìn)而改善肉品質(zhì)的研究相對(duì)較少。因此本實(shí)驗(yàn)基于宏基因組測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析日糧添加丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊脂肪酸代謝和肉品質(zhì)的影響，為改善羊肉品質(zhì)提供新的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)策略。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

3 月齡小尾寒羊共24 只（體質(zhì)量（28.85±2.01）kg）選取自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣牧場(chǎng)。

丁酸梭菌 山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司。 E.Z.N.A.D N A 試劑盒 美國(guó)Omega 公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；RNAiso Plus總RNA提取試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTMII qPCR試劑盒 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；TCP2全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì) 上海生物生化實(shí)驗(yàn)儀器公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；8890氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；LightCycler?480 qPCR儀羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；pH-STAR型胴體直測(cè)式pH計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)制備。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素隨機(jī)設(shè)計(jì)，將24 只小尾寒羊分為對(duì)照組和丁酸梭菌組，公母各半，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4 只。對(duì)照組每日8∶00和15∶00提供基礎(chǔ)日糧（青貯33.4%（以體系質(zhì)量計(jì)，下同）、玉米46.6%、豆粕15.7%、石粉1.1%、食鹽0.8%、磷酸氫鈣0.4%、礦物質(zhì)2%），丁酸梭菌組每只羊在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，參考Tian Zhimei等[9]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行飼喂，每天添加5 g丁酸梭菌于晨飼前與精料混合?；A(chǔ)日糧營(yíng)養(yǎng)成分含量（以干質(zhì)量計(jì)）為粗蛋白35.6 g/100 g、粗灰分24.8 g/100 g、粗纖維7.6 g/100 g、鈣1.13 g/100 g、磷0.67 g/100 g、氯化鈉0.9 g/100 g、賴氨酸0.6 g/100 g、增重凈能9.62 MJ/kg，除增重凈能為計(jì)算值外，其余均為實(shí)測(cè)值。丁酸梭菌由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司提供，活菌數(shù)為5×108CFU/g。實(shí)驗(yàn)期間自由采食和飲水，并定期清理羊舍。預(yù)試期7 d，正試期90 d。

1.3.2 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)期結(jié)束禁食禁水12 h，屠宰后每組取6 只羊的瘤胃內(nèi)容物，用4 層紗布過(guò)濾出瘤胃液，分裝于無(wú)菌無(wú)酶的5 mL凍存管中，置于液氮中存放。屠宰后每只羊采集10～13 根肋間背最長(zhǎng)肌2 份，每份約150 g，其中一份沿肌纖維方向進(jìn)行分割處理，取3 塊1 cm2肉塊置于無(wú)菌無(wú)酶管于液氮中存放，用于脂肪酸代謝相關(guān)基因測(cè)定，剩余肉樣在宰后1 h內(nèi)用于肌肉色澤、蒸煮損失率和嫩度等品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。另一份肉樣在-20 ℃條件下冷凍運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，用于脂肪酸分析。

1.3.3 肉品質(zhì)的測(cè)定

pH值的測(cè)定：用pH-STAR型胴體直測(cè)式pH計(jì)測(cè)定肌肉45 min和4 ℃排酸24 h的pH值（pH45min和pH24h），每塊樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

色澤的測(cè)定：使用TCP2全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)對(duì)背最長(zhǎng)肌色澤進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3 次后取平均值，L*值表示亮度，a*值表示紅度，b*值表示黃度，飽和度按照公式（1）計(jì)算。

蒸煮損失率的測(cè)定：取100 g左右的肉樣記錄煮前質(zhì)量（m1/g），肉樣中心插入溫度計(jì)，放入85 ℃水浴鍋中加熱40 min，待肉樣中心溫度達(dá)到70 ℃后取出冷卻至室溫，擦干表面水分記錄煮后質(zhì)量（m2/g），蒸煮損失率按照公式（2）計(jì)算。

剪切力的測(cè)定：將測(cè)定蒸煮損失剩余肉樣沿肌纖維方向切成3 cm×1 cm×1 cm的肉條，使用C-LM3B型嫩度儀測(cè)定6～8 次，以剪切力表征嫩度。

肌內(nèi)脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[10]中索氏抽提法測(cè)定樣品中肌內(nèi)脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每塊樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.4 脂肪酸組成測(cè)定

參照Floch等[11]與GB 5009.168—2016的方法制備脂肪酸甲酯，采用氣相色譜儀分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2 次。氣相色譜條件：使用Rt-2560石英毛細(xì)管色譜柱（100 m×250 μm，0.20 μm），程序升溫分3 步：溫度由100 ℃升高至180 ℃，速率為10 ℃/min，穩(wěn)定6 min后繼續(xù)將溫度提高至200 ℃，速率為1 ℃/min，穩(wěn)定20 min后繼續(xù)升溫至230 ℃，速率為4 ℃/min，穩(wěn)定20.5 min后結(jié)束升溫。離子源溫度和傳輸線溫度分別為250 ℃和280 ℃。通過(guò)Sigma-Aldrich混合標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間確定各峰對(duì)應(yīng)脂肪酸，根據(jù)峰面積對(duì)單個(gè)脂肪酸進(jìn)行量化，并表示為總脂肪酸的相對(duì)含量。

1.3.5 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

參照王柏輝[12]的方法，稱取約150 mg的肉樣提取RNA。提取后的RNA樣品測(cè)定吸光度及RNA濃度，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，然后將RNA樣品質(zhì)量濃度稀釋至500 ng/μL，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR染料法和LightCycler?480系統(tǒng)進(jìn)行qPCR分析，每個(gè)基因重復(fù)測(cè)定2 次。相關(guān)引物的設(shè)計(jì)如表1所示，均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，以β-actin為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.6 瘤胃宏基因組測(cè)序分析

將采集好的瘤胃液樣品取出，按照E.Z.N.A.DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品總DNA，選取樣品DNA經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳后，選取條帶較好、無(wú)明顯降解、OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間的DNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行Illumina PE150平臺(tái)測(cè)序。

下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)采用Readfq（version 8）軟件（https://github.com/cjf!elds/readfq）進(jìn)行預(yù)處理，得到Clean Data，參考文獻(xiàn)進(jìn)行基因組裝[13]、開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)[14]、去冗余基因[15]等信息處理，獲得最終用于后續(xù)分析的Unigenes。將Unigenes與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的NR數(shù)據(jù)庫(kù)（version 2018-01-02）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對(duì)，獲得各個(gè)分類層級(jí)上的豐度信息表。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用R v3.6.3軟件中Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析，使用Prism 8.0軟件作圖。宏基因組原始數(shù)據(jù)已上傳https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/（查詢號(hào)PRJNA882361）。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊肉品質(zhì)的影響

pH值是影響肉質(zhì)的重要因素，畜禽屠宰后肌肉pH值下降會(huì)降低蛋白質(zhì)在肌肉中的溶解度，對(duì)肉質(zhì)產(chǎn)生不利影響。由表2可知，兩組的初始pH值（pH45min）無(wú)顯著差異（P＞0.05），靜置排酸24 h后，丁酸梭菌組的pH24h顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明日糧添加丁酸梭菌能夠顯著減緩宰后肌肉的糖酵解進(jìn)程，這與白艷蘋(píng)等[16]的研究結(jié)果一致。肉色是確保消費(fèi)者滿意度的重要感官指標(biāo)，飽和度越大表明肉的色澤越飽滿。先前的研究表明日糧添加益生菌可以增強(qiáng)肌肉氧化穩(wěn)定性，減緩組織內(nèi)氧合肌紅蛋白被氧化為高鐵血紅蛋白的速率，保持肉紅度穩(wěn)定[17]。本研究中，對(duì)照組的L*值、a*值和飽和度均顯著低于丁酸梭菌組（P＜0.05），說(shuō)明丁酸梭菌對(duì)改善小尾寒羊肉色具有積極作用。Liu Yanhan等[18]也同樣證實(shí)了日糧添加丁酸梭菌能顯著提升鴨肉的紅度。剪切力能客觀反映嫩度，剪切力越小肉質(zhì)越嫩。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組的剪切力顯著高于丁酸梭菌組（P＜0.05），這與董改香等[19]的研究結(jié)果一致，即用益生菌發(fā)酵飼糧可以顯著降低綿羊肌肉的剪切力。研究表明，肌內(nèi)脂肪沉積在肌束之間，與肌肉中的膜蛋白緊密結(jié)合，其含量與肉質(zhì)多汁性、嫩度及風(fēng)味呈顯著正相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)中丁酸梭菌組的肌內(nèi)脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明丁酸梭菌的添加可促進(jìn)脂肪在肌肉中的沉積，這也為益生菌改善羊肉嫩度提供了合理解釋。

表2 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊肉品質(zhì)的影響Table 2 Effect of Clostridium butyricum on meat quality of small-tailed Han sheep

2.2 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊脂肪酸組成的影響

肌肉中的脂肪酸組成可決定肌肉的氧化穩(wěn)定性和硬度，進(jìn)而影響其風(fēng)味、嫩度和色澤[21]。反芻動(dòng)物由于瘤胃中不飽和脂肪酸的高度生物氫化，導(dǎo)致肉類中飽和脂肪酸含量較高，而人體攝入過(guò)量的飽和脂肪酸則會(huì)增加血液膽固醇含量，從而危害身體健康[22]。丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊飽和脂肪酸組成的影響如表3所示，對(duì)照組總飽和脂肪酸的相對(duì)含量顯著高于丁酸梭菌組（P＜0.05）。飽和脂肪酸中的硬脂酸是形成羊肉膻味的主要物質(zhì)，其含量越高，膻味越大[23]。本研究中，丁酸梭菌組小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中硬脂酸的相對(duì)含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），可能的原因是硬脂酸主要來(lái)源于不飽和C18脂肪酸的生物氫化，日糧添加丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸等代謝產(chǎn)物降低了瘤胃pH值，導(dǎo)致聚離子脂肪酸的生物加氫活性降低，進(jìn)而減少C18:0脂肪酸的沉積[24]。與丁酸梭菌組相比，對(duì)照組棕櫚酸的相對(duì)含量顯著更高（P＜0.05），而月桂酸和棕櫚酸攝入過(guò)高容易引起血清低密度脂蛋白水平升高，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[25]。

表3 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中脂肪酸的影響Table 3 Effect of Clostridium butyricum on fatty acid composition in Longissimus dorsi muscle of small-tailed Han sheep

油酸是羊肉中主要的不飽和脂肪酸，對(duì)降膽固醇和調(diào)節(jié)血脂有明顯的改善作用[26]。本研究中丁酸梭菌組小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中油酸的相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這與Tang Xiaopeng等[27]的研究結(jié)果相一致。有研究表明益生菌的添加有利于增加肌肉組織中Δ9-去飽和酶活性，促進(jìn)機(jī)體將硬脂酸內(nèi)源性轉(zhuǎn)化成油酸[28]。肉類中功能性脂肪酸多為不飽和脂肪酸，其中亞麻酸作為中長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的底物，對(duì)羊肉風(fēng)味的形成起重要作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丁酸梭菌組α-亞麻酸相對(duì)含量顯著升高（P＜0.05），亞油酸和γ-亞麻酸的相對(duì)含量降低，但差異不顯著（P＞0.05）。二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸屬于功能性長(zhǎng)鏈脂肪酸，具有促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)健康的作用，有利于抗衰老和維持認(rèn)知功能[30]。本研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌干預(yù)顯著提高了小尾寒羊肌肉的二十碳五烯酸相對(duì)含量（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明益生菌能提高小尾寒羊肉的保健功效。研究表明，當(dāng)n-6多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）/n-3 PUFA的比值處于4～10時(shí)，更符合人們的食用健康標(biāo)準(zhǔn)[31]，本實(shí)驗(yàn)中丁酸梭菌組n-6 PUFA/n-3 PUFA的比值顯著低于對(duì)照組，更加符合推薦標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

脂肪沉積是多種基因、蛋白以及多條信號(hào)通路共同作用調(diào)控的結(jié)果，相關(guān)基因表達(dá)可調(diào)控與脂肪代謝相關(guān)的物質(zhì)，最終影響脂肪的沉積與降解。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C（sterol regulatory element binding protein 1C，SREBP-1C）是細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控膽固醇和脂肪酸的合成。SREBP-1C通過(guò)激活SCD的表達(dá)來(lái)調(diào)控下游過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）基因[32]。PPARγ進(jìn)一步調(diào)控乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）和脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）來(lái)誘導(dǎo)骨骼肌中脂滴的積累，進(jìn)而增加肌內(nèi)脂肪的含量[33]。

由圖1 可知，丁酸梭菌組小尾寒羊背最長(zhǎng)肌的SREBP-1C、SCD、PPARγ和ACC基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。Hsieh等[34]在對(duì)雄性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌能激活SREBP-1C，從而促進(jìn)大鼠脂肪組織中脂肪的沉積。SCD能催化飽和脂肪酸脫氫生成單不飽和脂肪酸，如硬脂酸轉(zhuǎn)化成油酸，并且與前體脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)[35]。本研究中丁酸梭菌組的SCD基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，并且丁酸梭菌組背最長(zhǎng)肌中油酸的相對(duì)含量更高，可見(jiàn)日糧添加丁酸梭菌能夠改變小尾寒羊背最長(zhǎng)肌SCD基因表達(dá)水平，進(jìn)而影響肌肉組織中脂肪酸的組成。基因可以調(diào)控脂肪酸代謝，而脂肪酸也會(huì)對(duì)基因產(chǎn)生影響，如油酸會(huì)促進(jìn)PPARγ的表達(dá)[36]。PPARγ是核受體超家族成員之一，能促進(jìn)機(jī)體內(nèi)脂肪的分化和積累，在調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪代謝過(guò)程中起核心作用[37]。本研究中丁酸梭菌組小尾寒羊背最長(zhǎng)肌的PPARγ基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其原因可能與丁酸梭菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸——丁酸有關(guān)，該脂肪酸通過(guò)調(diào)控PPARγ信號(hào)通路影響脂肪的生成[38]。Ma Jie等[39]在沙子嶺豬的飼糧中補(bǔ)充約氏乳桿菌，發(fā)現(xiàn)沙子嶺豬腹部脂肪組織中PPARγ基因表達(dá)量顯著上調(diào)，促進(jìn)了腹部脂肪的積累。ACC是催化長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶，還可催化乙酰輔酶A縮合為丙二酸單酰輔酶A，進(jìn)而調(diào)控脂肪酸的氧化進(jìn)程[40]。因此，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示丁酸梭菌組ACC相對(duì)表達(dá)量（1.15）顯著高于對(duì)照組（0.81）（P＜0.05），ACC的高表達(dá)能增加丙二酸單酰輔酶A活性，促進(jìn)小尾寒羊肌內(nèi)脂肪的沉積。張?jiān)碌萚41]利用乳酸菌飼喂蘇尼特羊發(fā)現(xiàn)，乳酸菌通過(guò)抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，提高ACC基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸沉積。

圖1 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.1 Effect of Clostridium butyricum on expression levels of genes associated with fatty acid metabolism in small-tailed Han sheep

2.4 脂肪酸相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量與脂肪酸組成相關(guān)性分析

動(dòng)物脂肪代謝是脂肪合成和脂肪分解動(dòng)態(tài)博弈的結(jié)果，受脂肪酸代謝相關(guān)基因的調(diào)控，因此對(duì)小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量與脂肪酸組成進(jìn)行Person相關(guān)性分析。由圖2可知，PPARγ基因相對(duì)表達(dá)量與α-亞麻酸和二十二碳六烯酸相對(duì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），ACC和SREBP-1C基因相對(duì)表達(dá)量與α-亞麻酸和二十碳五烯酸相對(duì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），推測(cè)PPARγ、SREBP-1C和ACC基因的高表達(dá)有利于不飽和脂肪酸的沉積。張秋旭[42]的研究表明n-3 PUFA能提高PPARγ基因的表達(dá)水平，活化的PPARγ通過(guò)調(diào)控LPL、ACC、SREBP-1C等靶基因，上調(diào)脂肪酸去飽和程度，從而促進(jìn)肉中不飽和脂肪酸的沉積。SCD基因相對(duì)表達(dá)量與飽和脂肪酸相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），但與油酸、α-亞麻酸和二十碳五烯酸相對(duì)含量呈顯著或極顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），Li Changxi等[43]研究發(fā)現(xiàn)，SCD基因的高表達(dá)有助于不飽和脂肪酸的沉積以及調(diào)控棕櫚酸和硬脂酸的去飽和化過(guò)程，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量與脂肪酸組成相關(guān)性熱圖Fig.2 Heatmap showing correlation between expression of fatty acid metabolism-related genes and fatty acid compositions

2.5 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊瘤胃微生物組成的影響

瘤胃微生物是“第二基因組”，在調(diào)控肌肉脂肪酸組成和風(fēng)味物質(zhì)變化中發(fā)揮重要作用。由表4門水平上相對(duì)豐度（排名前6的菌門）可知，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）是瘤胃樣本中的優(yōu)勢(shì)菌門。其中丁酸梭菌組中厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而擬桿菌門的相對(duì)豐度在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。劉宇陽(yáng)[44]的研究也證實(shí)日糧添加復(fù)合益生菌能提高波爾山羊瘤胃中厚壁菌門的相對(duì)豐度。據(jù)報(bào)道，擬桿菌門和厚壁菌門均能調(diào)節(jié)宿主脂質(zhì)代謝，提高能量效率，其中擬桿菌門能促進(jìn)非纖維碳水化合物的消化，而厚壁菌門能促進(jìn)纖維物質(zhì)的分解[45]。本研究中，添加丁酸梭菌可以增加瘤胃中厚壁菌門的數(shù)量，對(duì)纖維物質(zhì)的分解有益。變形菌門中的細(xì)菌包括多數(shù)致病菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌[46]。本實(shí)驗(yàn)中丁酸梭菌組瘤胃中變形菌門的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），原因可能是丁酸梭菌能夠合成和分泌短鏈脂肪酸和細(xì)菌素，破壞致病菌的細(xì)胞膜，從而殺死或抑制致病菌生長(zhǎng)[47]。

表4 丁酸梭菌對(duì)小尾寒羊瘤胃微生物相對(duì)豐度的影響Table 4 Effect of Clostridium butyricum on the relative abundance of rumen microflora in small-tailed Han sheep %

從表4 中屬水平相對(duì)豐度排名前10 的菌屬可知，相對(duì)豐度最高的3 個(gè)菌屬分別為普雷沃氏菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）和梭菌屬（Clostridium）。最新的研究表明梭菌屬能夠利用纖維素、細(xì)胞壁多糖、木質(zhì)纖維素等原料，提高畜禽的纖維降解能力[48]。本研究中，丁酸梭菌組梭菌屬的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明丁酸梭菌成功定植于小尾寒羊瘤胃中，一定程度上提高了小尾寒羊瘤胃的纖維降解能力。纖維桿菌屬（Fibrobacter）可代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，通過(guò)三羧酸循環(huán)為宿主提供能量[49]。本研究中丁酸梭菌組纖維桿菌屬的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與Miguel等[50]的研究結(jié)果一致，即在奶牛日糧中添加丁酸梭菌能顯著增加瘤胃纖維桿菌的豐度。丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）是主要參與多不飽和脂肪酸生物氫化的瘤胃微生物，在共軛亞油酸和SFA合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[51]。本研究中丁酸梭菌組瘤胃中丁酸弧菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這可能有利于更多的多不飽和脂肪酸沉積在肉中。副擬桿菌屬（Parabacteroides）是擬桿菌門中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，代謝終產(chǎn)物主要是乙酸和琥珀酸，另外其代謝合成的主要脂肪酸為飽和直鏈脂肪酸和anteiso-甲基支鏈脂肪酸[52]。Young等[53]研究發(fā)現(xiàn)，甲基支鏈脂肪酸是造成羊肉中膻味的重要物質(zhì)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌會(huì)顯著降低副擬桿菌屬的相對(duì)豐度（P＜0.05），這可能對(duì)羊肉風(fēng)味的形成具有積極作用?？傮w而言，日糧添加丁酸梭菌后瘤胃中厚壁菌門、梭菌屬和纖維桿菌屬的相對(duì)豐度顯著提高，推測(cè)丁酸梭菌的添加可能會(huì)提高小尾寒羊?qū)w維素的分解效率，為肌肉脂肪酸合成提供更多的營(yíng)養(yǎng)和能量，有利于肌內(nèi)脂肪的沉積，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

2.6 瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群與脂肪酸組成的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群與背最長(zhǎng)肌中脂肪酸組成之間的關(guān)系，以屬水平上相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢(shì)菌群與11 種脂肪酸進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。由圖3可知，副擬桿菌屬相對(duì)豐度與α-亞麻酸、二十碳五烯酸相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與飽和脂肪酸相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。瘤胃桿菌屬相對(duì)豐度與硬脂酸、亞油酸和γ-亞麻酸相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與α-亞麻酸和二十二碳六烯酸相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。而普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度與二十碳五烯酸和單不飽和脂肪酸相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與硬脂酸飽和脂肪酸相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。瘤胃桿菌屬和普雷沃氏菌屬主要參與纖維素的降解，可產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸，揮發(fā)性脂肪酸被瘤胃壁吸收，轉(zhuǎn)化生成脂肪酸，這可能是丁酸梭菌增加肌肉不飽和脂肪酸含量的內(nèi)在機(jī)制[49]。丁酸弧菌屬相對(duì)豐度與棕櫚油酸和多不飽和脂肪酸相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。此外，乳酸桿菌屬相對(duì)豐度與油酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸和單不飽和脂肪酸相對(duì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），但與亞油酸和飽和脂肪酸呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。劉婷等[54]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬的添加能顯著提高蘇尼特羊背最長(zhǎng)肌中油酸的含量，顯著降低亞油酸的含量，本研究結(jié)果與其相似。

圖3 瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群與脂肪酸組成相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Correlation network between predominant rumen flora and fatty acid composition

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，日糧添加丁酸梭菌提高了小尾寒羊背最長(zhǎng)肌中油酸、α-亞麻酸和二十碳五烯酸的相對(duì)含量，降低了棕櫚酸和硬脂酸的相對(duì)含量，提升了肌肉的肌內(nèi)脂肪含量、色澤和嫩度，延緩了宰后pH值的下降，對(duì)肉品質(zhì)有明顯的改善作用。通過(guò)脂肪代謝相關(guān)基因分析得出，丁酸梭菌組SREBP-1C、SCD、PPARγ和ACC基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，從分子水平證實(shí)了丁酸梭菌可以促進(jìn)機(jī)體脂肪沉積。進(jìn)一步研究瘤胃微生物對(duì)脂肪酸代謝的影響發(fā)現(xiàn)，飼喂丁酸梭菌提高了小尾寒羊瘤胃中厚壁菌門、梭菌屬和纖維桿菌屬的相對(duì)豐度，降低了變形菌門、丁酸弧菌屬和副擬桿菌屬的相對(duì)豐度。瘤胃微生物與脂肪酸的相關(guān)性分析中，瘤胃中瘤胃桿菌屬、普雷沃氏菌屬和乳酸桿菌屬相對(duì)豐度與不飽和脂肪酸相對(duì)含量呈正相關(guān)。綜上，通過(guò)飼喂益生菌調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃微生物影響機(jī)體脂肪酸代謝或是將來(lái)改善羊肉品質(zhì)的重要研究方向，可為微生物制劑改善肉質(zhì)性狀提供新的機(jī)理解釋。