新型二維色譜系統(tǒng)建立重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者中替加環(huán)素含量的測定方法研究

劉曉芹 李濤 董華 李文

替加環(huán)素屬于新型靜脈注射用抗生素, 抗菌效果顯著, 對重癥感染患者有良好的臨床效果, 能夠有效消除感染指征［1-3］。對于重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者, 替加環(huán)素是重要的治療藥物, 但血藥濃度個體差異明顯, 少數(shù)患者使用后可能出現(xiàn)生命危險, 監(jiān)測血藥濃度以嚴格控制劑量十分關(guān)鍵［4］?；诖? 本次研究一種測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者體內(nèi)替加環(huán)素含量的新型二維色譜系統(tǒng)方法, 旨在確保用藥安全。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 將2020 年1 月～2022 年6 月接收的60 例重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者視為研究對象, 醫(yī)院倫理會批準研究實施。納入標準：①參照《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018 年版)》［5］, 診斷為重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者；②均接受替加環(huán)素治療。排除標準：①院前感染；②合并肺癌等惡性腫瘤；③存在其他感染性疾??；④對替加環(huán)素過敏。

1. 2 方法

1. 2. 1 儀器 全自動二維液相色譜系統(tǒng)(ALK-108, 湖南德米特儀器有限公司)；第一維色譜系統(tǒng)用于樣品預(yù)分離, 第二維色譜系統(tǒng)用于樣品分離監(jiān)測, 包括高壓輸液泵、自動進樣器、四元低壓色譜泵等, 均來自湖南德米特科技有限公司；電子分析天平(FA1004, 鶴壁精中科技有限公司)；旋渦混合器(XW-80A, 上海琪特分析儀器有限公司)；離心機(MINI-15K, 杭州奧盛儀器有限公司)。

1. 2. 2 試劑 一維試劑為TGCL-1A(500 ml/瓶, 批號：20210915, 成分為甲醇、乙腈、水、磷酸氨)；二維試劑為TGCL-2B(500 ml/瓶, 批號：20211123, 成分為甲醇、乙腈、水、磷酸氫二鈉)；輔助試劑為超純水, 乙腈、甲醇(色譜純)；高氯酸(批號：7601-90-3, 成都中錦隆科技發(fā)展有限公司, 純度76%)。

1. 2. 3 色譜條件 第一維色譜系統(tǒng)中一維液相色譜柱為(SX15-1A 3.5 mm×50 mm, 5 μm), 流動相：乙腈∶甲醇∶磷酸鹽=10∶5∶9(V/V/V), pH 為5, 中間色譜柱為雙通柱, 二維色譜柱為(SCB-2A 4.6 mm×250 mm,5 μm), 流動相：乙腈∶甲醇∶磷酸氫二鈉=7∶22∶16(V/V/V)。流速設(shè)置為1 ml/min, 柱溫45℃, 檢測波長CH1: 340 nm CH2: 269 nm, 進樣體積200 μl。

1. 2. 4 溶液制備 溶液制備包括調(diào)試液、質(zhì)控品與校準品, 其中調(diào)試液為替加環(huán)素凍干調(diào)試液(5×1 ml/盒,批號：20200407)；質(zhì)控品為TGCL-1FA 質(zhì)控品(1 ml/支,批號：20211026)；校準品為TGCL-1FA 校準品(1 ml/支,批號：20211026)。

1. 2. 5 血清樣本處理 嚴密采集血清樣本0.5 ml, 將其放在EP 管中, 加入對應(yīng)質(zhì)量濃度的替加環(huán)素溶液35 μl, 旋渦振蕩30 s, 再加入0.4 mol/L 高氯酸180 μl, 旋渦振蕩60 s, 以14500 r/min 的速度離心8 min, 取上清液1 ml, 進樣250 μl。

1. 3 觀察指標 觀察新型二維色譜系統(tǒng)測定替加環(huán)素的效果, 指標包括運行時間、標準曲線與線性范圍、絕對回收率、精密度與準確度、穩(wěn)定性, 并觀察臨床測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者血清中替加環(huán)素的效果。

2 結(jié)果

2. 1 運行時間 在規(guī)定的色譜條件下, 替加環(huán)素的色譜峰總運行時間為10.0 min, 保留時間為6.9 min, 其中第一維工序和捕獲工序時間為3.5 min, 第二維分離時間為5.5 min, 且色譜峰在該階段沒有干擾峰和受其他因素干擾。

2. 2 標準曲線與線性范圍 用替加環(huán)素標準儲備溶液配制成濃度分別為50、550、950、1500、2500 ng/ml的含藥血清樣本, 根據(jù)上述血清樣本處理方法, 處理后實施進樣分析, 獲得色譜圖。將濃度視為自變量(X), 峰面積視為因變量(Y), 展開回歸計算, 替加環(huán)素濃度在1500～2500 ng/ml 的線性關(guān)系最好, 標準曲線為Y=aX+b(a=81.9350, b=-497.920), r=0.999。

2. 3 絕對回收率 嚴密稱取950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 與相應(yīng)濃度的替加環(huán)素對照品工作液峰面積比較, 發(fā)現(xiàn)絕對回收率分別為94.9%、95.3%、96.2%, 符合轉(zhuǎn)移回收率要求(90%～110%)。

2. 4 精密度與準確度 配制替加環(huán)素定量下限質(zhì)量濃度50 ng/ml 血漿樣品, 嚴密稱取950、1500、2500 ng/ml低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 連續(xù)測定3 d, 每個濃度各取6 份樣本評估, 獲得替加環(huán)素的日內(nèi)與日間精密度、準確度。日間、日內(nèi)精密度均＜3%。見表1。

表1 替加環(huán)素的日內(nèi)與日間精密度、準確度(%)

2. 5 穩(wěn)定性 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品, 分別在室溫條件下放置0、4、8、12 h, 反復(fù)凍融2 次, 在-20℃環(huán)境下儲存0、10、20、30 d 后, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理和“1.2.3”項下色譜條件進樣, 測定各濃度水平數(shù)值的精密度均＜7.6%, 表明該實驗條件下的血清中的替加環(huán)素穩(wěn)定性好。

2. 6 臨床應(yīng)用 用本方法測定重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者血清中的替加環(huán)素質(zhì)量濃度, 給藥方式均為靜脈滴注, 維持劑量為50 mg 或100 mg, 在藥物濃度達到穩(wěn)定狀態(tài)12 h 后采集靜脈血, 經(jīng)“1.2.5”項方法下處理血清樣本和“1.2.3”項下色譜條件進樣分析, 顯示用藥后血藥濃度范圍在0.113～0.824 μg/ml, 滿足血清中替加環(huán)素濃度檢測標準。見表2。

表2 臨床應(yīng)用分析

3 討論

醫(yī)院作為主要的診療場所, 每天接收大量患者,各種藥物與醫(yī)療器械使用頻繁, 極易出現(xiàn)院內(nèi)接觸傳播的病原菌, 如部分患者不注重手衛(wèi)生導(dǎo)致病原菌傳播, 加上患者自身免疫力低下, 醫(yī)院獲得性肺炎發(fā)生率高［6］。老年患者因為合并糖尿病等慢性疾病, 同時可能留置尿管、氣管插管, 是發(fā)生多重耐藥鮑曼不動桿菌肺部感染的高危人群, 替加環(huán)素是治療院內(nèi)感染的有效藥物, 效果優(yōu)于單純頭孢哌酮舒巴坦, 能夠快速減輕機體炎癥反應(yīng)［7-9］。

不過隨著臨床耐藥性的提高, 合理應(yīng)用替加環(huán)素具有重要意義, 且任何藥物均存在一定毒性作用, 如何在保證安全的前提下最大化增強藥物療效是臨床需重點關(guān)注的問題, 而血藥濃度是調(diào)整用藥方案的重要依據(jù), 有必要提高血藥濃度監(jiān)測精確度［10］。目前監(jiān)測血藥濃度方法有質(zhì)譜分析、高效液相色譜檢測等。馬霖等［11］在研究中發(fā)現(xiàn), 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)同時測定人血漿中伏立康唑和替加環(huán)素的濃度效果令人滿意, 精密度控制在6.48%～14.37%, 準確度在85.20%～107.08%, 平均提取回收率超過90.50%, 穩(wěn)定性好, 不僅樣本處理簡便, 且靈敏度高, 專屬性強。但高效液相色譜存在“柱外效應(yīng)”, 在進樣到檢測器之間, 若流動相的流型發(fā)生變化, 被分離物質(zhì)的任何擴散與滯留都將造成色譜峰加寬, 柱效率下降［12,13］。二維色譜是最早用于紙色譜和薄層色譜的化學(xué)分析方法,由于二維電泳在蛋白組學(xué)研究中十分活躍, 能夠檢測存在差異化的蛋白［14］。血藥濃度監(jiān)測精確度主要受干擾峰影響, 本次研究提出一種新型二維色譜血藥濃度監(jiān)測方法, 結(jié)果色譜峰未出現(xiàn)干擾峰, 950、1500、2500 ng/ml 低、中、高質(zhì)量濃度的替加環(huán)素質(zhì)控樣品絕對回收率符合轉(zhuǎn)移回收率要求(90%～110%), 日內(nèi)與日間精密度＜3%, 同時穩(wěn)定性好, 在具體臨床應(yīng)用中精準測得替加環(huán)素血藥濃度, 提示該種方法具有較高的應(yīng)用價值。這是因為新型二維色譜系統(tǒng)運用三根色譜柱, 分別為一維色譜柱、中間色譜柱與二維色譜柱, 依次對血樣實施富集、轉(zhuǎn)移與分離, 去掉大量雜質(zhì), 改善分離能力, 減少其他干擾, 提高精密度［15］。另外, 利用聚焦體系在規(guī)定時間內(nèi)改變流動相比例, 讓藥物呈點狀進入色譜柱, 避免體積過大進樣應(yīng)藥物分散造成擴散誤差［16］。

綜上所述, 新型二維色譜系統(tǒng)是一種可靠的重癥醫(yī)院獲得性肺炎患者中替加環(huán)素含量測定方法, 操作簡便, 精密度高, 但由于替加環(huán)素血液中濃度較低, 對臨床治療效果預(yù)測作用仍需進一步研究。