RT-PCR 技術(shù)在新型冠狀病毒核酸檢測的應(yīng)用及質(zhì)量評價分析

李澤銳 高靜 劉興旺

2019 年12 月新型冠狀病毒肺炎疫情大暴發(fā), 雖然目前我國對新型冠狀病毒疫情的防控取得了階段性勝利, 但全球疫情仍極為嚴(yán)峻, 嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全和社會繁榮穩(wěn)定。我國疫情防治工作的重點已轉(zhuǎn)向境外輸入病例的預(yù)防控制、冷鏈進(jìn)口商品的控制和人與人之間的密切接觸污染。臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病防治部門新型冠狀病毒檢測已成為常態(tài), 應(yīng)該大幅改進(jìn), 具備隨時應(yīng)對新一波疫情能力［1］。新型冠狀病毒具有較強(qiáng)的傳染性和致死性, 采取快速、準(zhǔn)確、方便的診斷方法對其進(jìn)行檢測是發(fā)現(xiàn)傳染源、阻斷疾病傳播鏈、防控疫情的關(guān)鍵。常見的病原體檢測方法有病原體培養(yǎng)、血清抗體檢測、核酸檢測等。病原體培養(yǎng)法的病毒培養(yǎng)時間長、效率低。血清抗體檢測的特異性較低。核酸檢測方法具有時間短、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。RT-PCR技術(shù)是目前最可靠和準(zhǔn)確的核酸檢測方法, 檢測結(jié)果準(zhǔn)確率在98.7%～99.5%［2］。RT-PCR 技術(shù)通過高溫變性、低溫退火、引物延伸的多次循環(huán)可將靶標(biāo)擴(kuò)增上萬甚至上億倍, 能有效區(qū)分病毒類型和亞型。本文對RT-PCR 技術(shù)在新型冠狀病毒核酸檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測的特點

PCR 可用于擴(kuò)增某些DNA 片段, 也被認(rèn)為是體外特殊的DNA 復(fù)制。PCR 技術(shù)的基本原理類似于DNA的自然復(fù)制過程, 其特異性取決于寡核苷酸引物, 寡核苷酸引物與靶序列的兩端互補(bǔ)［3,4］。由于逆轉(zhuǎn)錄過程導(dǎo)致額外步驟和可能造成的損壞, 除目前已經(jīng)被國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)的熒光PCR 法, 一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR 法也會開發(fā)用于實驗室診斷新型冠狀病毒［5］。一步法熒光PCR 法的建立能夠縮短檢測時間成本、人力成本和誤差。PCR 技術(shù)具有許多技術(shù)優(yōu)勢,因為存在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)抑制劑, 所以它受到的影響較小, 有更高的靈敏度。PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的, 能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=10-6)水平, 能在100 萬個細(xì)胞中可以檢測到1 個目標(biāo)細(xì)胞。對于病毒檢測, PCR 能夠達(dá)到3 個空斑形成單位(RFU)；在細(xì)菌學(xué)中最低檢測率為3 個細(xì)菌。PCR 使用耐高溫的Taq DNA 聚合酶, 一次性地將反應(yīng)液加好后, 即在DNA 擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng), 一般在2～4 h 完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析, 不一定要用同位素, 無放射性污染、易推廣。PCR 產(chǎn)品對樣品純度要求低, 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞, DNA 粗制品及RNA 均可作為擴(kuò)增模板, 可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA 擴(kuò)增檢測。直接PCR 具有很高的重復(fù)性, 并且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可提供絕對定量。PCR 技術(shù)可將極其微量的DNA 擴(kuò)增放大數(shù)百萬倍, 極大地提高了DNA 檢測靈敏度, 理論上可檢測到每個細(xì)胞分子DNA 的水平, 這一方法被廣泛應(yīng)用于病毒的檢測中。PCR 技術(shù)可對任何雙鏈DNA 進(jìn)行定量, 不需要探針, 因此減少了實驗設(shè)計及運(yùn)轉(zhuǎn)成本, 適合于大量基因的分析, 簡單易用。實時熒光PCR 法采用熱半導(dǎo)體加熱制冷技術(shù), 熱均勻性好, 且升降溫可達(dá)到3.5℃/s, 孔間溫度≤0.2℃, 充分保證了PCR 擴(kuò)增的重現(xiàn)性, 能產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線, 保證了擴(kuò)增有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性, 并且具有可實時監(jiān)測擴(kuò)增全過程,也不受非特異性擴(kuò)增影響等優(yōu)點。

2 核酸檢測注意事項及生物安全要求常見問題

2. 1 核酸檢測注意事項

2. 1. 1 樣本采集注意事項 普通篩查、發(fā)熱門診、疾病中期推薦采集鼻咽拭子；而處于疾病中后期除了鼻咽拭子外, 可采集下呼吸道樣本等。重癥患者優(yōu)先采集下呼吸道樣本, 陽性轉(zhuǎn)為陰性患者推薦采集鼻咽拭子；環(huán)境檢測需要根據(jù)地方政策混合采樣。

2. 1. 2 樣本轉(zhuǎn)運(yùn)注意事項 樣本直立存放在轉(zhuǎn)運(yùn)箱中, 3 層包裝, 即內(nèi)層、第二層、外層, 且包裝需要符合B 類標(biāo)準(zhǔn), 密封轉(zhuǎn)運(yùn)。樣本采集后室溫放置時間應(yīng)≤4 h, 需要在2～4 h 轉(zhuǎn)送到實驗室。如果沒有及時轉(zhuǎn)運(yùn),4℃儲存時間應(yīng)≤24 h。如果需要長途轉(zhuǎn)運(yùn)則采取干冰等進(jìn)行低溫保存, 樣本轉(zhuǎn)運(yùn)需要專人專車。

2. 1. 3 樣本接收注意事項 在生物安全柜內(nèi)接收樣本并核對樣本信息。不合格樣本, 比如：滲漏、無標(biāo)識等, 需要登記后及時反饋到臨床或者樣本采集點, 重新采集。不合格的樣本按照生物污染垃圾處理。核酸提取注意事項：在生物安全二級以上實驗室進(jìn)行, 有條件單位可采取負(fù)壓實驗室。手工提取需要嚴(yán)格按照規(guī)定進(jìn)行, 避免污染樣本。自動化提取則需要根據(jù)規(guī)定嚴(yán)格消毒設(shè)備, 維護(hù)設(shè)備［6］。

2. 1. 4 PCR 擴(kuò)增和報告解讀 陰性對照、陽性對照信號合格, 則可發(fā)布報告。根據(jù)樣本信號值和試劑產(chǎn)品說明書閾值對結(jié)果進(jìn)行分析。

2. 1. 5 醫(yī)療垃圾處理注意事項 感染性廢液化學(xué)或物理徹底消毒后排入實驗室處理系統(tǒng)；固體廢物分類收集；實驗室內(nèi)的感染性垃圾不允許堆積存放, 應(yīng)當(dāng)及時壓力蒸汽滅菌處理。

2. 2 核酸檢測生物安全要求

2. 2. 1 樣本采集要求 醫(yī)務(wù)人員需要嚴(yán)格按照國家有關(guān)規(guī)定進(jìn)行全程防護(hù), 采集時注意避免與患者交叉感染。采集后立即插入含有病毒保存液的樣本管中, 裝入密封袋。制作樣本時灑漏需要立即對周圍環(huán)境進(jìn)行封閉, 采取含氯消毒液消毒, 并上報, 禁止人員流動。工作結(jié)束后, 利用紫外線照射。

2. 2. 2 樣本轉(zhuǎn)運(yùn)要求 轉(zhuǎn)運(yùn)容器采取含氯消毒液消毒。轉(zhuǎn)運(yùn)過程注意平穩(wěn), 避免樣本箱墜落導(dǎo)致致病性樣本暴露在空氣中。

2. 2. 3 樣本接收要求 生物安全柜使用前消毒, 利用紫外線照射；采取含氯消毒液對樣本管外表進(jìn)行消毒；實驗室空氣利用紫外線照射消毒, 必要時采取核酸清除試劑［7,8］；工作臺面采取含氯消毒劑消毒；生物安全柜采取酒精消毒。

2. 2. 4 PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增過程PCR 管密封, 對PCR 室進(jìn)行消毒。

2. 2. 5 醫(yī)療垃圾處理要求 醫(yī)療垃圾使用雙層醫(yī)療垃圾袋鵝頸式扎口, 并粘貼新型冠狀病毒相關(guān)醫(yī)療廢物標(biāo)識后進(jìn)行壓力蒸汽滅菌［9］。通過醫(yī)療廢物通道轉(zhuǎn)運(yùn)垃圾。

3 核酸檢測結(jié)果解讀

3. 1 核酸檢測結(jié)果解讀問題及對策 對于感染風(fēng)險較低的人, 如果抗體檢測結(jié)果呈弱陽性或陽性, 建議結(jié)合核酸檢測等結(jié)果進(jìn)行解讀, 或者可以使用其他非常特殊的方法或重新測試?？贵w檢測結(jié)果為陰性, 核酸檢測結(jié)果也為陰性, 但臨床上懷疑感染新型冠狀病毒肺炎時, 建議使用另一種高敏感度的方法或試劑盒進(jìn)行重新測試。如果考慮到干擾, 應(yīng)將樣品處理為風(fēng)濕因子吸附, 以便禁用和重新測試。以下情況建議重新檢查：①樣品PCR 擴(kuò)增后, 靶基因的CT 值大于試劑規(guī)定的閾值, 但是在原始峰圖存在信號［10,11］；②結(jié)果為陽性, 但原始峰值圖不是典型的“S”曲線；③雙靶點試劑檢測結(jié)果不一樣；④兩種試劑的檢測結(jié)果不一樣；⑤檢測結(jié)果與臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)不一樣, 根據(jù)病情發(fā)展階段核酸檢測結(jié)果發(fā)生變化時, 應(yīng)連續(xù)多次采樣；⑥在大規(guī)模集體篩查流行率極低(＜0.1%)的情況下, 出現(xiàn)陽性結(jié)果時, 應(yīng)使用更敏感、擴(kuò)增區(qū)域不同的1～2 種試劑進(jìn)行復(fù)檢［12］。

3. 2 核酸檢測結(jié)果假陰性、假陽性分析 假陰性檢測結(jié)果的可能原因：①抗體表達(dá)窗口期；②測試工具的靈敏度有限；③樣品存放不好；④實驗室不健全；⑤樣品失活引起的抗體降解。假陽性檢測結(jié)果的可能原因：①各種冠狀病毒N 或S 蛋白間存在免疫交叉反應(yīng)；②患者體內(nèi)的類風(fēng)濕因子和抗核抗體等免疫干擾；③實驗室和工具包被污染；④檢查前的復(fù)活會導(dǎo)致熒光免疫層析的假陽性結(jié)果；⑤陽性判斷值設(shè)定：陽性呈弱陽性, 部分可能為假陽性, 因此, 最好在3～5 d 后對出現(xiàn)弱陽性結(jié)果的患者進(jìn)行再檢查；⑥樣品溶血、血液樣品不完全凝固或黃疸可引起假陽性結(jié)果［13-16］。

4 核酸檢測在不同病程階段的臨床應(yīng)用及其意義分析

新型冠狀病毒是一種單股正鏈RNA 病毒, 屬于冠狀病毒科, β 病毒屬。新型冠狀病毒可發(fā)生人際傳播,人群普遍易感, 其主要傳播方式為接觸傳播和飛沫傳播, 也可能通過氣溶膠傳播, 無癥狀病毒攜帶者也可以傳播。新型冠狀病毒感染患者表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀［17-19］。病發(fā)1 周后, 多數(shù)患者會有呼吸困難表現(xiàn), 嚴(yán)重情況下會發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、凝血功能障礙等。除上述癥狀表現(xiàn)外還有部分重癥、危重癥患者有中低熱, 無明顯發(fā)熱表現(xiàn)。核酸檢測結(jié)果是判斷患者有無新型冠狀病毒感染的直接證據(jù)。在不同病程階段, 核酸檢測靈敏度也不同, 特別是在感染中后期, 核酸檢出率會降低?？贵w檢測能夠作為輔助判斷證據(jù)。感染中后期抗體檢出率會增高。將核酸和抗體聯(lián)合檢測對臨床診斷具有重要意義, 診斷效果將會大大提高。在潛伏期或者感染早期, 人體免疫系統(tǒng)已產(chǎn)生抗體, 水平未達(dá)到檢測下限, 需要3～5 d 后再進(jìn)行核酸檢測。感染期免疫球蛋白M(IgM)降低, 免疫球蛋白G(IgG)增高。感染早期, IgM 產(chǎn)生, 但是IgG 未產(chǎn)生,未達(dá)到檢測下限。未感染或者感染潛伏期, 建議采用不同試劑或者窗口復(fù)查。既往感染或者已經(jīng)接種疫苗,建議1～2 周復(fù)查核酸和抗體。感染急性期或者接種疫苗早期, 建議復(fù)查核酸和抗體。感染恢復(fù)期, 建議復(fù)查核酸和抗體。

綜上所述, 進(jìn)一步提升檢測能力、擴(kuò)大檢測范圍是常態(tài)化防控下重要的一環(huán), 使用快速、準(zhǔn)確、便利的診斷方法對其進(jìn)行檢測是發(fā)現(xiàn)傳染源、阻斷疾病傳播鏈進(jìn)而防控疫情的關(guān)鍵。通過新型冠狀病毒核酸檢測中的質(zhì)量控制評價, 認(rèn)識不足, 持續(xù)加以改正, 從而更好、更準(zhǔn)地進(jìn)行精準(zhǔn)疫情防控, 有利于社會安定。以有效、簡捷、快速的SARS-CoV-2 核酸檢測服務(wù),獲取個體和社會健康效益最大化的新型醫(yī)學(xué)模式, 這對打造“健康中國”并推動經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型升級具有重要戰(zhàn)略意義。目前RT-PCR 技術(shù)作為病毒臨床檢測的重要方法, 成為病毒性疾病確診的首要標(biāo)準(zhǔn), 在新型冠狀病毒疫情防控過程中起著重要作用。