云南黑松露醇提物對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用

蘇銀芳,徐梓涵,袁雨欣,李干鵬,祁艷艷,王芳,蔡正達(dá)

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500;2.云南省科學(xué)技術(shù)院,昆明 650500)

免疫是人體維持健康的重要生理機(jī)能。免疫力低下時(shí),機(jī)體對(duì)外來(lái)入侵物質(zhì)識(shí)別及防御能力降低,可引發(fā)多種疾病。因此,借助增強(qiáng)機(jī)體免疫能力控制疾病發(fā)生、發(fā)展一直是醫(yī)學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)[1]。免疫系統(tǒng)功能主要涉及免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫自穩(wěn)三個(gè)方面,三者對(duì)機(jī)體的整體免疫功能十分重要[2]。T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓多能干細(xì)胞,分布于外周免疫器官的胸腺依賴區(qū),發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。功能性T細(xì)胞中輔助性T細(xì)胞包括Th1和Th2細(xì)胞,Th1細(xì)胞代謝產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子主要有白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-12以及γ干擾素(IFN-γ),而這些細(xì)胞因子在介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[3]。天然產(chǎn)物中多糖成分具有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用,多糖及多糖肽可以通過(guò)激活T細(xì)胞和B細(xì)胞,促使其增殖及提高對(duì)不同免疫細(xì)胞的分泌,因此受到免疫藥理學(xué)研究者關(guān)注[4]。

松露學(xué)名黑孢塊菌(Tuber melanosporum),屬真菌門(mén)子囊菌綱塊菌目塊菌屬食用真菌[5]。云南黑松露常被稱為“豬拱菌”,是一種可以藥食兩用十分稀有珍貴的野生食用菌,但目前其調(diào)節(jié)免疫作用的研究筆者較少見(jiàn)到報(bào)道。筆者在本研究通過(guò)小鼠脾淋巴細(xì)胞炎癥模型,觀察云南黑松露醇提物對(duì)小鼠T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)活性,以期為進(jìn)一步研究其免疫調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c純系小鼠,雌性,6～7周齡,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008,飼養(yǎng)于云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房,保持光照、黑暗各12 h恒定循環(huán),自由活動(dòng)、進(jìn)食、飲水。環(huán)境溫度25 ℃,相對(duì)濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)操作符合《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》要求。

1.2藥品與試劑 云南黑松露購(gòu)自云南省昆明市中藥材市場(chǎng),經(jīng)云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院孫靜賢副教授鑒定為黑松露(Tuber melanosporum)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)均購(gòu)自BI公司(批號(hào)分別為2210060,2144324);無(wú)菌紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司(批號(hào):20160418);IFN-γ與IL-2酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司(批號(hào)分別為219145-008,222653-005);IFN-γ蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司(批號(hào):11p5029);聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro-phoresis,SDS-PAGE)凝膠快速配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào):051722220526);化學(xué)發(fā)光底物(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色試劑盒購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司(批號(hào):ZN18A01);Mouse TH1/TH2 Staining Kit 購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司(批號(hào):A11015);色譜級(jí)甲醇購(gòu)自美國(guó)Fisher scientific公司;娃哈哈純凈水;氘代-甲醇(批號(hào):1455-13-6)、氘代三氯甲烷(批號(hào):865-49-6)、氘代-二甲亞砜(DMSO,批號(hào):2206-27-1)等試劑購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3儀器與設(shè)備 Shimadzushim-pack GIS-C18型反相半制備柱(250 mm×10 mm,5 μm,日本島津公司);Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱(美國(guó)安捷倫儀器分析有限責(zé)任公司);EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社);ZF-7暗箱式三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);Multiskan Go多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo-fisher);5417R高速離心機(jī)(Eppendorf);SDS-凝膠電泳體系(美國(guó)Bio-RAD公司);CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.4云南黑松露的提取分離 取云南黑松露30 g,分別用75%和95%乙醇熱浸超聲提取7 次(42 ℃),每次8 h,每次用量12 L,合并提取液濾過(guò)、減壓濃縮后各得浸膏4和3.6 g,以乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部分和水相部分。取1 g兩種比例乙醇提取物的水相部分浸膏分別經(jīng)Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱進(jìn)行梯度洗脫、分離。分離體系為:10%,30%,60%,80%甲醇-水溶液和100%甲醇,依據(jù)薄層色譜分析結(jié)果將相同成分段進(jìn)行合并。取兩種比例乙醇提取物的乙酸乙酯部分1 g經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜(100%甲醇)進(jìn)行分離。

1.5實(shí)驗(yàn)試劑的制備 ①取云南黑松露樣品100 mg,溶于DMSO 1 mL,配制成100 mg·mL-1母液。使用時(shí),依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需,以含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至目標(biāo)濃度。②ConA的配制:取ConA 3 mg,溶解于RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL,配制成30 mg·mL-1母液,使用時(shí)以相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋成0.3 μg·mL-1液體,濾過(guò),分裝備用。③Anti-CD3采用滅菌PBS 緩沖液配制成2 mg·mL-1母液,終濃度2 μg·mL-1。④噻唑藍(lán)(MTT)溶液的配制:取MTT50 mg,溶解于PBS緩沖液10 mL,母液濃度5 mg·mL-1,濾過(guò)除菌后-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 取BALB/c雌性小鼠1或2 只,處死,75%乙醇浸泡后超凈工作臺(tái)取脾臟,置10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基3 mL充分研磨,200目金屬網(wǎng)過(guò)濾到EP 管,1200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm)。去上清液,加入紅細(xì)胞裂解液1～2 mL混勻,室溫靜置2 min,再次過(guò)濾、離心,冰浴備用。

1.7MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率 以含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液調(diào)整為5×106個(gè)·mL-1,接種于96 孔板,每孔100 μL。設(shè)置陰性對(duì)照組、ConA 組和不同濃度云南黑松露分段樣品組。陰性對(duì)照組加10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL,ConA組加10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和ConA溶液各50 μL,不同濃度云南黑松露分段樣品組加待測(cè)樣品和ConA溶液各50 μL,每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。將加樣后的96孔板置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。48 h后每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h,離心,棄去上清液,每孔加DMSO150 μL,震蕩、溶解,570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A值),計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對(duì)照組A值)/陰性對(duì)照組A值×100%。

1.8ELISA法檢測(cè)IL-2與IFN-γ 取24孔板,除陰性對(duì)照組外,每孔加入Anti-CD3試劑300 μL,置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,吸去Anti-CD3試劑;陰性對(duì)照組與Anti-CD3組加入10% FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基500 μL,樣品處理組加入待測(cè)樣品500 μL。將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2×106個(gè)·mL-1,每孔加入脾淋巴細(xì)胞懸液500 μL。每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集培養(yǎng)上清液,依據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IL-2與IFN-γ細(xì)胞因子含量測(cè)定。

1.9Western blotting法測(cè)定小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ蛋白表達(dá)量 重復(fù)“1.8”項(xiàng)操作,收集細(xì)胞,裂解蛋白。用10%SDS分離膠體系進(jìn)行蛋白電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h,在相應(yīng)條帶分別加入IFN-γ及β-actin一抗(1：1000),4 ℃搖床孵育過(guò)夜。PBS/T洗3次,每次5 min,加相應(yīng)二抗(1：4000 ),室溫孵育2 h。PBS/T洗3次,每次5 min,加ECL顯影。圖像經(jīng)Image J軟件測(cè)定灰度值,依據(jù)內(nèi)參β-actin灰度值標(biāo)準(zhǔn)化分析IFN-γ,得到各待測(cè)蛋白樣品IFN-γ相對(duì)表達(dá)值。

1.10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3、CD4淋巴細(xì)胞 重復(fù)“1.8”項(xiàng)操作,培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞懸液至流式管,加入PMA /Ionomycin /BFA /Monensin Mixture(250x)1 μL。以只含細(xì)胞懸液的樣本為對(duì)照。混勻,37 ℃孵育4～6 h,每隔1～2 h取出震蕩混勻。從樣本管和對(duì)照管中取細(xì)胞懸液100 μL至新流式管,加入5 μL鼠抗CD3抗體,FITC和5 μL鼠抗CD4抗體,PerCP-Cy5.5。震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入FIX &PERM MediumA 100 μL,震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入預(yù)冷1×流式染色緩沖液2 mL,1 200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm),棄去上清液。每管加入FIX &PERM Medium B100 μL、Anti-Mouse IFN-γ和PE5 μL,Anti-Mouse IL-4 5 μL,APC。震蕩混勻,室溫避光孵育15 min。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 2 mL,1200 r·min-1離心5 min(r=7.25 cm),棄去上清液。每管加入1x Flow Cytometry Staining Buffer 500 μL重懸,上機(jī)檢測(cè);或者加入1%～4 %多聚甲醛500 μL重懸,2～8 ℃避光,24 h檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1云南黑松露醇提物樣品組分分離提取結(jié)果 按“1.4 ”項(xiàng)方法,提取得到云南黑松露醇提物水相部分和乙酸乙酯部分。水相部分經(jīng)過(guò)Zorbax Eclipse XDB-C18型分析柱分離得到樣品8個(gè),記作1-8號(hào)組分;乙酸乙酯部分經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20凝膠柱色譜洗脫分離得到樣品9個(gè),記作A-I號(hào)組分。

2.2云南黑松露醇提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 對(duì)上述分離獲得的17個(gè)組分進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性影響檢測(cè)。結(jié)果顯示1號(hào)組分、2號(hào)組分、F號(hào)組分和G號(hào)組分在濃度為0.8～20 μg·mL-1范圍內(nèi)對(duì)該細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用,結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.云南黑松露醇提物水相部分;B.云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分。圖1 云南黑松露醇提物對(duì)ConA 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 A.Aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle;B.Ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle.Fig.1 Effect of alcohol extract of Yunnan black truffle on ConA-induced proliferation of mouse spleen lymphocytes

2.31、2、F和G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見(jiàn)表1與表2。結(jié)果顯示,1號(hào)組分在20 μg·mL-1時(shí)促增殖作用最佳[增殖率(86.11±3.12)%],2號(hào)組分在40 μg·mL-1下呈現(xiàn)出與1號(hào)組分相當(dāng)?shù)拇僭鲋匙饔肹增殖率(86.27±7.45)%];F和G號(hào)組分在0.8和4 μg·mL-1均呈現(xiàn)出一定促增殖作用,其中F號(hào)組分在0.8 μg·mL-1即呈現(xiàn)出較好促增殖活性,增殖率(88.81±0.49)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 云南黑松露醇提物水相部分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Tab.1 Effect of aqueous part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

表2 云南黑松露醇提物乙酸乙酯部分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Tab.2 Effect of ethyl acetate part in alcohol extract of Yunnan black truffle on the proliferation rate of mouse spleen lymphocytes

2.41、2、F和G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2的影響 采用ELISA 法檢測(cè)系列濃度1、2、F和G號(hào)組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2與IFN-γ 細(xì)胞因子的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2-3。在Anti-CD3刺激下,1號(hào)組分在80 μg·mL-1時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2促進(jìn)作用顯著高于Anti-CD3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IFN-γ濃度并未表現(xiàn)出明顯差異;2號(hào)組分則對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞因子均未顯示出促進(jìn)作用。

①與Anti-CD3 組比較,t=3.887,P<0.05。圖2 1號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=3.887,P<0.05.Fig.2 Effects of Component 1 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

圖3 2號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effects of Component 2 on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,F號(hào)組分在0.625～2.5 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ作用顯著高于Anti-CD3刺激組,且呈現(xiàn)較好的濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但對(duì)IL-2 分泌無(wú)明顯促進(jìn)作用(圖4)。

①與Anti-CD3組比較,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01。圖4 F號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=5.814,5.117,10.38,P<0.01.Fig.4 Effects of component F on cytokines in mouse spleen lymphocytes

在Anti-CD3刺激下,G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2作用未見(jiàn)明顯差異,而與Anti-CD3組相比,G號(hào)組分可顯著促進(jìn)IFN-γ分泌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著G號(hào)組分濃度增高,其對(duì)IFN-γ的作用有所降低(圖5)。

①與Anti-CD3組比較,t=4.012,P<0.05。圖5 G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的影響 ①Compared with Anti-CD3 group,t=4.012,P<0.05.Fig.5 Effects of component G on cytokines in mouse spleen lymphocytes

2.51、2、F和G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)水平的影響 依據(jù) “2.3”和“2.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將黑松露醇提物1、2、F和G號(hào)組分進(jìn)行Western blotting 實(shí)驗(yàn),探討其對(duì)IFN-γ 蛋白表達(dá)是否有影響。如蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果所示:與Anti-CD3組相比,1號(hào)組分在20～80 μg·mL-1時(shí)對(duì)IFN-γ蛋白表達(dá)水平影響有一定趨勢(shì),濃度為80 μg·mL-1時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2號(hào)組分在在20～80 μg·mL-1時(shí)顯著提高IFN-γ蛋白表達(dá)水平,并且具有較好的濃度依賴性(P<0.05或P<0.01);F號(hào)組分在0.625 ～2.5 μg·mL-1范圍內(nèi)提高IFN-γ蛋白表達(dá)量,與Anti-CD3組相比,在2.5 μg·mL-1濃度下達(dá)到最大值(P<0.01);G號(hào)組分也與F號(hào)組分有類似趨勢(shì),與Anti-CD3組相比,G號(hào)組分在1.25～2.5 μg·mL-1濃度顯著提高IFN-γ 蛋白表達(dá)量(P<0.01)。見(jiàn)圖6。

①與Anti-CD3組比較,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②與Anti-CD3組比較,t=3.319,P<0.05。圖6 4種組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ蛋白表達(dá)水平的影響①Compared with Anti-CD3 group,t=3.931,6.992,6.831,5.992,3.857,6.138,P<0.01;②Compared with Anti-CD3 group,t=3.319,P<0.05.Fig.6 Effects of four components on IFN-γ expression in mouse spleen

①與Anti-CD3組比較,t=11.34,P<0.05(n=5)。圖7 5組小鼠脾淋巴細(xì)胞中表達(dá)情況①Compared with Anti-CD3 group,t=11.34,P<0.05(n=5).Fig.7

①與Anti-CD3組比較,t=17.36,10.23,P<0.01。圖8 5組小鼠脾淋巴細(xì)胞中表達(dá)情況①Compared with Anti-CD3 group,t=17.36,10.23,P<0.01.Fig.8

2.81、2、F和G號(hào)組分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞比例的影響 結(jié)果見(jiàn)圖9。1 號(hào)組分組Th1細(xì)胞比例高于Anti-CD3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、G和F號(hào)組分組Th1細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1號(hào)組分組Th2細(xì)胞比例低于Anti-CD3組,G號(hào)組分組Th2 細(xì)胞比例高于Anti-CD3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、F號(hào)組分組與Anti-CD3組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

①與Anti-CD3比較,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05。圖9 5組小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1 /Th2細(xì)胞表達(dá)情況①Compared with Anti-CD3 group,t=7.151,9.087,3.974,P<0.05.Fig.9 Expression of Th1 /Th2 cells in mouse spleen

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,從云南黑松露提取分離得到17個(gè)組分,建立BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖模型以0.8～100 μg·mL-1濃度梯度進(jìn)行活性篩選,1、2、F和G號(hào)4個(gè)組分在不同濃度下可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖,具有協(xié)同增強(qiáng)ConA對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的作用。研究表明,乙酸乙酯部分萃取樣品大多富含萜類化合物,而單萜烯可增強(qiáng)BALB/c小鼠的脾細(xì)胞增殖[12],與本研究結(jié)果相似。T細(xì)胞增殖作用對(duì)CTL、NK以及巨噬細(xì)胞增殖活化都具有一定促進(jìn)作用,從而使機(jī)體分泌出更多IL-2、IFN-γ 等細(xì)胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干擾素,同時(shí)也被稱為免疫干擾素,是一類具有較好抗病毒效果的生物活性物質(zhì),在免疫調(diào)節(jié)方面具有關(guān)鍵作用,并且還能促進(jìn)各種免疫細(xì)胞因子的表達(dá),從而達(dá)到提高機(jī)體分泌相關(guān)抗體的作用。本研究中,筆者通過(guò)ELISA 法檢測(cè)IFN-γ和IL-2水平,探討云南黑松露醇提物中1、2、F和G號(hào)組分對(duì)細(xì)胞因子的影響。結(jié)果顯示4 個(gè)組分在不同濃度下可促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2濃度,而IFN-γ和IL-2高分泌表達(dá)可以促進(jìn)Th1細(xì)胞活化,在營(yíng)養(yǎng)學(xué)抗癌免疫前沿中具有重要作用。筆者采用Western blotting實(shí)驗(yàn),繼續(xù)探討這4個(gè)組分對(duì)IFN-γ蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示2、F和G號(hào)組分在相應(yīng)濃度下可促進(jìn)IFN-γ蛋白表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了云南黑松露醇提物對(duì)Th1免疫反應(yīng)的促進(jìn)作用以及提高免疫調(diào)節(jié)活性作用[13]。