熟地黃微生物限度檢查方法適用性研究

葉寶玉 莫小丹 李 蔚 劉俊文

中藥飲片微生物限度檢查法系2020 年版《中華人民共和國藥典》通則1108 新增[1-2]，該方法可用于檢查中藥材、中藥飲片微生物污染情況[3]。熟地黃性微溫，味甘，可補益肝腎，滋陰養(yǎng)血，是治療痹證的經(jīng)典藥物[4]，藥用歷史久遠，是我國廣泛使用的養(yǎng)生保健、防病治病的中藥材。熟地黃富含氨基酸、糖類、地黃素、梓醇等多種微量元素，具有提高機體免疫力、抗氧化、抗衰老、促進造血等作用[5-6]。也有相關研究顯示其具有抑制氧化應激、細胞凋亡的特性[7-9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃的主要作用成分為天然大分子化合物熟地黃多糖，其在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、治療心血管疾病、降血糖、提高免疫力、抗炎、鎮(zhèn)咳、抗真菌等方面具有良好的效果[10]。本研究旨在通過對熟地黃微生物限度方法適用性研究，并建立相應的微生物限度檢查方法，防止因檢驗方法的不科學造成錯檢或誤判[11-12]，確保有關熟地黃飲片藥物生物安全性評價的可靠性。

1 儀器與樣品

1.1 儀器

電子天平 MP500B（1/100，上海恒平科學儀器有限公司），高壓滅菌器 GF88DX（致微廈門儀器有限公司），SW-CJ 系列潔凈工作臺SW-CJ-2FD（蘇州安泰空氣技術有限公司），生化培養(yǎng)箱HPX-Ⅱ-250（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），霉菌培養(yǎng)箱HMJ-Ⅲ-250（上海躍進醫(yī)療器械有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082B（上海一恒溫培養(yǎng)箱），移液器（Thermo Scientific）。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門氏菌[CMCC（B）50094]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。本實驗用的菌種均為第三代工作菌株。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號200909），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號191112），pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋液）（批號220113），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號210617），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號200308），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號200815），RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號200116），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號200904），腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號191231），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號211125），均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.4 樣品

熟地黃，購自江西樟樹成方中藥飲片有限公司，批號20120101。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

根據(jù)2020 版《中華人民共和國藥典》四部通則1105 及1006 要求，將各試驗菌制成菌懸液，濃度在50～100 cfu/ml。

2.2 供試液的制備

稱取75 g 熟地黃，利用GF88DX 高壓滅菌器進行常規(guī)滅菌處理，其中用于沙門菌檢查的20 g 熟地黃未做滅菌處理。

取已滅菌處理的熟地黃25 g，加稀釋液至250 ml，充分振搖15 min，制成1∶10 供試液。取1∶10 供試液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷卻，制成1∶10 耐熱菌檢查供試液。

取已滅菌處理的熟地黃25 g，加稀釋液至500 ml，充分振搖15 min，制成1∶20 供試液。取1∶20 供試液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷卻，制成1∶20 耐熱菌檢查供試液。

取1∶10 供試液20 ml，加稀釋液至100 ml，混勻，制成1∶50 供試液。取1∶50 供試液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷卻，制成1∶50 耐熱菌檢查供試液。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 第一次微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1.1 需氧菌總數(shù)試驗試驗組：取9.9 ml 的1∶10 的供試液各5 份，分別加入5 種試驗菌0.1 ml 混勻，取1 ml 注入培養(yǎng)皿中，分別傾注TSA，平行制備2 皿。供試品對照組：取1∶10 供試液，用稀釋液代替菌液，其他試驗操作同試驗組。菌液對照組：取9.9 ml 的稀釋液5 份，分別加入0.1 ml 各菌液，其他試驗操作同試驗組。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌總數(shù)試驗取9.9 ml 的1∶10的供試液各5 份，分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml 混勻，取1 ml 注入培養(yǎng)皿中傾注SDA，其他操作同需氧菌總數(shù)試驗。

2.3.1.3 耐熱菌總數(shù)試驗分別取5 支1∶10 耐熱菌檢查供試液9.9 ml，其他操作同需氧菌總數(shù)試驗。

依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020 版四部準則1108，回收率（%）=（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)×100%，平皿傾注法中所有試驗菌的回收率應在50%～200%。由表1 可知，枯草芽孢桿菌的回收率小于50%，不符合標準要求，故常規(guī)法供試液（1∶10）不適用于檢測熟地黃中需氧菌、耐熱菌總數(shù)。霉菌和酵母菌所對應的兩種試驗菌回收率在59%～113%，符合《中華人民共和國藥典》2020 版四部要求。

表1 1∶10 供試液組的需氧菌總數(shù)、酵母菌總數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

2.3.2 第二次微生物計數(shù)方法適用性試驗需氧菌總數(shù)試驗：取5 份9.9 ml 的1∶20 供試液于試管中，其他操作同2.3.1 需氧菌總數(shù)試驗。耐熱菌總數(shù)試驗：分別取1∶20 耐熱菌總數(shù)檢查供試液9.9 ml，裝于5支試管中，其他操作與需氧菌總數(shù)試驗相同。由表2可知枯草芽孢桿菌的回收率均小于50%，不符合《中華人民共和國藥典》2020 版四部的標準要求，說明熟地黃對枯草芽孢桿菌具有一定抑制作用，因此將供試品進一步稀釋，進行回收率試驗。

表2 1∶20 供試液組的方法適用性試驗結(jié)果(需氧菌/耐熱菌)

2.3.3 第三次微生物計數(shù)方法適用性試驗需氧菌總數(shù)試驗：取9.9 ml 的1∶50 供試液5 份，其他操作同2.3.1 需氧菌總數(shù)試驗。耐熱菌總數(shù)試驗：分別取1∶50 耐熱菌總數(shù)檢查供試液9.9 ml，裝于5 支試管中，其他操作與需氧菌總數(shù)試驗相同。5 種計數(shù)菌的回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中華人民共和國藥典》2020 版四部要求，即采用該方法進行需氧菌總數(shù)試驗。見表3。

表3 1∶50 供試液組的方法適用性試驗結(jié)果(需氧菌/耐熱菌)

2.4 控制菌方法適用性試驗

2.4.1 試驗組大腸埃希菌：取1∶10 供試液10 ml，大腸埃希菌液1 ml 加入100 ml TSB，充分搖勻，30～35 ℃培養(yǎng)24 h。取1 ml 上述培養(yǎng)物接種在麥康凱液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，觀察與記錄指示結(jié)果并進行鑒定。

沙門菌：取制備好的供試品10 g，沙門菌液1 ml加入100 ml TSB 混勻，30～35 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 ml上述培養(yǎng)物，加入9.9 ml 的RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后接種劃線于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板，觀察與記錄指示結(jié)果并進行鑒定。

耐膽鹽革蘭陰性菌：取在23 ℃培養(yǎng)2 h 的1∶10 供試液20 ml，用TSB 稀釋成1∶100 和1∶1 000供試液。取培養(yǎng)2 h 后的1∶10 供試液1 ml 兩份，接種于兩管10 ml 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，分別加入大腸埃希菌液（不大于100 cfu/ml）和銅綠假單胞菌液（不大于100 cfu/ml）。取1∶100 和1∶1 000供試液同法操作。將以上6 支試管在33 ℃下培養(yǎng)48 h，劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h，查看平板是否有菌落生長并進行鑒定。

2.4.2 對照組供試品對照組以稀釋液代替菌液，其他操作與2.4.1 試驗組相同。陰性對照組以10 ml稀釋液代替供試品，不加菌液，其他操作與2.4.1 試驗組相同。陽性對照組不加入供試品，其他操作與2.4.1 試驗組相同。

2.4.3 試驗結(jié)果試驗組、陽性對照組的指示結(jié)果為菌生長且鑒定為大腸埃希菌，而供試品對照組、陰性對照組指示結(jié)果無菌生長。見表4。

表4 大腸埃希菌試驗結(jié)果

試驗組、陽性對照組的指示結(jié)果為菌生長且鑒定為有沙門菌，而供試品對照組、陰性對照組指示結(jié)果無菌生長。見表5。

表5 沙門菌試驗結(jié)果

熟地黃耐膽鹽革蘭陰性菌檢查試驗中EE 體積為10 ml，3 個樣品試驗組的3 個稀釋級（1∶10、1∶100、1∶1 000）均有菌生長，且鑒定為大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。供試品對照組、陰性對照組均無菌生長，結(jié)果表明熟地黃耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查可采用直接接種法。見表6。

表6 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗結(jié)果

3 討論

中藥飲片是中藥材通過炮制加工而成的，可直接用于中醫(yī)臨床的產(chǎn)品，是初級加工產(chǎn)物，也是一類特殊的藥品，其微生物限度檢查方法是標準制定過程中的重要環(huán)節(jié)。不同廠家同品種的中藥飲片由于生產(chǎn)工藝的不同，其抑菌活性也會有差別，生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管單位應根據(jù)實際情況對微生物限度檢驗方法進行相應調(diào)整[10-11]，以提高檢驗方法的可靠性。

本研究中發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)法1∶10、1∶20 供試液對熟地黃飲片進行微生物限度檢查適用性試驗，枯草芽孢桿菌的回收率小于50%，不符合藥典要求，說明熟地黃對枯草芽孢桿菌具有一定抑制作用。為降低供試液單位體積抑菌成分濃度，達到消除干擾的目的，最終采用溶液稀釋法將熟地黃進行1∶50稀釋后進行供試品需氧菌總數(shù)檢查，常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數(shù)試驗，直接接種法開展控制菌試驗，大腸埃希菌和沙門菌均為試驗組和陽性對照組存在有關菌落生長，供試品對照組和陰性對照組不存在有關菌落生長，說明該控制菌檢查方法適用于熟地黃飲片，保證了對熟地黃中藥產(chǎn)品的客觀評價。