Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化楓香樹葉總酚酸提取工藝

周燕霞,雷英,樂志艷

(江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院,江西 上饒 334000)

楓香樹葉(Liquid-ambarformosanaHance)為金縷梅科楓香屬植物楓香的干燥葉片,早在《唐本草注》《南方草木狀》《蜀本草圖經(jīng)》《本草綱目》等均有記載,現(xiàn)收載于《江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1996年版)[1]。楓香樹葉多在秋天采收,性辛;味苦;有小毒,歸脾;腎;肝經(jīng),具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、行氣止痛、消炎殺菌之功效,主要用于治療急性胃腸炎、痢疾、癰腫瘡瘍、產(chǎn)后風(fēng)、小兒臍風(fēng)、創(chuàng)傷出血等病癥[2-3]。化學(xué)成分研究顯示,楓香樹葉中主要含有酚酸、黃酮、揮發(fā)油、萜類以及黑色素等成分[4-8],其中酚酸類成分主要包括沒食子酸、沒食子酸乙酯、原兒茶酸等,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗突變、抗自由基、保護(hù)肝臟等多種生物學(xué)活性[9],已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品生物等領(lǐng)域,也可能是楓香樹葉發(fā)揮消炎殺菌、行氣止痛作用的主要有效成分。目前,對(duì)于楓香樹葉中酚酸類成分的研究報(bào)道相對(duì)較少,僅有學(xué)者對(duì)楓香樹葉中沒食子酸的含量進(jìn)行了測(cè)定研究[10],對(duì)其酚酸類成分的提取工藝及藥理活性研究還未見報(bào)道。Box-Behnken響應(yīng)面法是一種通過非線性數(shù)學(xué)模型連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì),再通過對(duì)回歸方程的精確分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的優(yōu)化方法,可有效考察影響因素之間的交互作用,具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精密度高、預(yù)測(cè)性能好等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化[11]。為進(jìn)一步深入研究楓香樹葉中酚酸類成分的開發(fā)價(jià)值,本研究以總酚酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用Box-Behnken響應(yīng)面法篩選楓香樹葉總酚酸的最佳提取工藝,以期為楓香樹葉質(zhì)量評(píng)價(jià)、藥理作用、資源開發(fā)等研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

HAD-752N型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);KQ5200B型超聲機(jī)(昆山超聲儀器公司);MeilenMCS220型電子天平(深圳美孚電子科技有限公司);RT-08型粉碎機(jī)(北京開創(chuàng)同和發(fā)展有限公司);EPED-10TH超純水儀(易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。對(duì)照品沒食子酸(批號(hào)111081-20191102,純度99.2%)購自曼斯特科技有限公司。楓香樹葉藥材購買于揭陽中藥市場(chǎng),經(jīng)江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥鑒定教研室黃平藥師鑒定為金縷梅科楓香屬植物楓香樹(Liquid-ambarformosanaHance)的干燥葉,無水乙醇、三氯化鐵、濃鹽酸均為分析純,水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對(duì)準(zhǔn)品5.0 mg,加入到100 mL容量瓶中,加入無水乙醇至刻度線,配成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎后的楓香樹葉1.0 g,置50 mL的具塞錐形瓶中,加入一定量的提取溶劑,在一定條件下超聲提取,過濾,定容至50 mL,取1 mL濾液置100 mL容量瓶中,定容,得供試品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[12],精密吸取上述配置質(zhì)量濃度50 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.25,0.50,1.00,2.50,5.00,10.00 mL分別置于25 mL的容量瓶中,分別依次加入4.0 mL的無水乙醇溶液、2.0 mL的0.3%十二烷基硫酸鈉以及1.0 mL的0.6% FeCl3和0.9%K3[Fe(CN)6]的混合溶液,搖勻,在黑暗處放置5 min,隨后再加入0.1 mol/L的HCl至刻度,搖勻顯色,繼續(xù)在黑暗處放置20 min后,在最大吸收波長720 nm處測(cè)定吸光度,設(shè)置空白對(duì)照。以沒食子酸濃度C為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A= 0.264 7C+0.015 2(R2= 0.999 5),表明沒食子酸在質(zhì)量濃度為0.50～20.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素考察

以楓香樹葉總酚酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別對(duì)不同的提取溶劑濃度(50%,60%,70%,80%,90%乙醇),不同的提取時(shí)間(30,45,60,75,90 min),不同的提取溫度(40,50,60,70,80 ℃),不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)進(jìn)行考察比較。結(jié)果顯示,在60%乙醇濃度、45 min的提取時(shí)間,60 ℃的提取溫度,25∶1的液料比條件下楓香樹葉總酚酸的提取效率最佳。

2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比4個(gè)因素為指標(biāo),采用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)提取條件。具體的因素水平表見表1,中心組合設(shè)計(jì)和所得結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken方案設(shè)計(jì)因素和水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.3 方差分析

采用Design-Exper8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得楓香樹葉總酚酸對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比的二項(xiàng)多次回歸模型方程為:Y=0.26+0.026A+0.016B+0.027C+0.016D-0.003 5AB-0.015AC-0.026AD-0.007 2BC-0.009 7BD-0.02CD-0.024A2-0.03B2-0.042C2-0.016D2。式中Y代表?xiàng)飨銟淙~總酚酸得率。詳細(xì)的分析及方差結(jié)果見表3。由表3的結(jié)果可知,本試驗(yàn)所建立的Box-Behnken響應(yīng)面模型P=0.007 1,呈現(xiàn)出極顯著水平,失擬誤差P=0.176 2,呈不顯著水平,說明擬合較好,模型可靠,能較好地反映出楓香樹葉總酚酸得率與乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比的關(guān)系。單因素中乙醇濃度和提取溫度對(duì)總酚酸的影響最大,二次項(xiàng)中B2和C2的P值分別為0.017 8,0.002 1,均<0.005,呈現(xiàn)出顯著的水平,表明所建立的模型能夠較好地預(yù)測(cè)楓香樹葉總酚酸含量與各參數(shù)之間的變化關(guān)系。

表3 模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果

2.2.4 響應(yīng)面分析因素之間交互作用

根據(jù)上述模型方差分析結(jié)果及回歸方程,繪制Box-Behnken響應(yīng)面圖,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示,楓香樹葉總酚酸的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度66.7%、提取時(shí)間49.9 min、提取溫度62.5 ℃、液料比23.4,總酚酸的預(yù)測(cè)得率為0.183%。

圖1 各因素之間的響應(yīng)面圖

2.2.5 最佳提取工藝及試驗(yàn)驗(yàn)證

取楓香樹葉3份,每份約1.0 g,根據(jù)優(yōu)化所得的最佳提取工藝進(jìn)行提取?？紤]到實(shí)際的可操作性,將上述優(yōu)化得到的提取條件修正為:乙醇濃度67%、提取時(shí)間50 min、提取溫度63 ℃、液料比25,總酚酸的得率為0.187%,與預(yù)測(cè)得率0.183%較為接近,無顯著性差異,表明所建立的模型可行、所得的結(jié)果可靠。

3 小結(jié)

楓香樹葉具有清熱解毒、消炎殺菌、消腫止痛等多種功效,且入藥后有濃郁的香氣,既可以搗爛或研成粉末后可直接泡水飲用,還可作為臨床常用中成藥腸炎寧片的主要組成藥,是一味藥效確切、價(jià)值較高的中藥材。近年來,關(guān)于楓香樹葉的研究越來越多,但主要集中在藥理作用、化學(xué)成分、含量測(cè)定等方面[13-14],關(guān)于酚酸類成分的提取分離和工藝優(yōu)化研究還相對(duì)較少,有待于進(jìn)一步研究探討。本試驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法,在通過單因素確定影響楓香樹葉總酚酸提取主要因素的基礎(chǔ)上,選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、液料比4個(gè)因素為指標(biāo),建立了楓香樹葉總酚酸提取工藝優(yōu)化的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),最終優(yōu)化得到楓香樹葉總酚酸的最優(yōu)工藝參數(shù)為:乙醇濃度60%、液料比21∶1、超聲時(shí)間47 min,此條件下楓香樹葉總酚酸的提取率為96.78 μg/g,與預(yù)測(cè)值96.67 μg/g接近,無顯著性差異,表明方法可行,可為楓香樹葉資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。