高效液相色譜法快速測(cè)定醬油中四種防腐劑

馬曉年，陳俊秀，農(nóng)蕊瑜，李 潔，李 怡

（昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228）

醬油主要是以大豆、小麥、淀粉等為原料，經(jīng)預(yù)處理、制曲、發(fā)酵及配制等工藝［1］生產(chǎn)的具有特殊色香味的液體調(diào)味品，以咸味為主，亦有鮮味、香味等，能增加和改善菜肴的口味，是日常餐桌上不可或缺的調(diào)味品。研究表明，醬油具有抗氧化、降血壓、降低膽固醇、抗癌、抗過(guò)敏、降血脂等功能［2］，且富含多種人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖類(lèi)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等［3，4］。

醬油在長(zhǎng)期存儲(chǔ)中易受微生物污染而發(fā)生變質(zhì)，在醬油中添加食品防腐劑可抑制微生物的繁殖，改善其質(zhì)量，延長(zhǎng)保質(zhì)期。化學(xué)防腐劑因經(jīng)濟(jì)、有效、便捷等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于醬油防腐。因丙酸及其鹽類(lèi)毒性低，苯甲酸在酸性環(huán)境下對(duì)多種微生物有抑制作用且溶解性好，山梨酸能與微生物酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，從而破壞許多重要酶系的作用，達(dá)到抑制微生物增殖及防腐的目的，脫氫乙酸對(duì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制力［5］，故這些物質(zhì)被廣泛用作醬油防腐［6，7］。但化學(xué)防腐劑對(duì)人體有不同程度的損害［8-10］，只能限量使用［11，12］。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于防腐劑使用的控制具有重要意義。有學(xué)者對(duì)這4 種防腐劑進(jìn)行了研究，廖敏等［13］采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了醬油中的苯甲酸及山梨酸；王蘭等［14］采用高效液相色譜法測(cè)定了黃豆醬油、白樺樹(shù)汁飲料、薄荷糖、月餅及牛肉醬中苯甲酸及山梨酸的含量；周純潔等［15］建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醬油中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測(cè)方法；張小芳等［16］建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醬油和食醋中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測(cè)方法；夏靜等［17］將醬油樣品經(jīng)Oasis HLB 柱進(jìn)行固相萃取凈化，利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醬油中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的含量。梁立廣等［18］建立了頂空技術(shù)串聯(lián)氣相色譜法檢測(cè)醬油中丙酸鹽的含量。賴(lài)國(guó)銀等［19］利用凱氏定氮蒸餾裝置，建立了同時(shí)檢測(cè)蠔油、醬油、魚(yú)露中丙酸鈉（鈣）的高效液相色譜法；李霞等［20］采用氫火焰離子化檢測(cè)器-氣相色譜測(cè)定食品中丙酸及丙酸鹽的含量。本研究建立了高效液相色譜檢測(cè)方法，可以同時(shí)測(cè)定醬油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸含量，以期為這方面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000 型高效液相色譜儀（附二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛公司）；電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；賽多利斯Arium? pro DI 超純水系統(tǒng)（德國(guó)賽多利斯公司）。

丙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；乙腈（色譜純，美國(guó)JT Baker 公司）；磷酸二氫鉀（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水。

樣品為市購(gòu)醬油。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合應(yīng)用液的配制 準(zhǔn)確量取丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋定容至100 mL，得到500.0 mg/L 的丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸混合應(yīng)用液?；旌蠎?yīng)用液于4 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g 試樣于50 mL 有蓋離心管中，加25 mL 超純水渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用超純水潤(rùn)洗離心管至容量瓶，定容至刻度，混勻。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為室溫。洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參考國(guó)標(biāo)GB 5009.28—2016［21］在230 nm 波長(zhǎng)處對(duì)苯甲酸和山梨酸進(jìn)行測(cè)定，參考國(guó)標(biāo)GB 5009.120—2016［22］在214 nm 波長(zhǎng)處對(duì)丙酸進(jìn)行測(cè)定，參考國(guó)標(biāo)GB 5009.121—2016［23］在293 nm 波長(zhǎng)處對(duì)脫氫乙酸進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 流動(dòng)相的選擇 在國(guó)標(biāo)方法GB 5009.28—2016 及GB 5009.121—2016 中，采用乙酸銨水溶液為水相分離苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸，也有研究［24］采用磷酸鹽體系為水相分離苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸。在國(guó)標(biāo)方法GB 5009.120—2016 中采用磷酸氫二銨水溶液為水相分離丙酸，對(duì)以上水相體系對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的分離效果進(jìn)行分析。

1.2.6 pH 的優(yōu)化 pH 對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)丙酸得到的峰型影響較大，測(cè)定不同pH（分別為3.40、3.98、4.31、4.41、5.87、6.33、6.92）對(duì)4 個(gè)待測(cè)組分分離效果的影響，選擇最適宜pH。

1.2.7 校準(zhǔn)曲線及檢出限 用超純水將混合應(yīng)用液配制成濃度分別為1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在確定的分析條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g 醬油樣品9 份，分別加入一定量的防腐劑待測(cè)組分。加標(biāo)樣品溶液按“1.2.2”的方法制備，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，因丙酸的響應(yīng)值較低，為了兼顧苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸的響應(yīng)情況，試驗(yàn)最終選擇214 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明，在乙酸銨體系下，丙酸不出峰，而在磷酸鹽體系有較好的分離效果。綜合考慮，采用磷酸二氫鉀溶液為水相，乙腈為有機(jī)相分離丙酸、苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸。有機(jī)相比例增大時(shí)，4 種防腐劑的峰型均較好，且保留時(shí)間提前，但苯甲酸和山梨酸無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離。有機(jī)相比例減小時(shí)，4 種防腐劑的峰分離度有所改善，但峰型展寬嚴(yán)重，故本試驗(yàn)采用0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

2.3 pH 的優(yōu)化

pH 較低時(shí)，丙酸峰型收窄，響應(yīng)值增大。增大pH，苯甲酸和山梨酸分離度增加，而苯甲酸和丙酸分離度減小。圖1 為不同pH 下4 種防腐劑相應(yīng)的保留時(shí)間。由圖1 可知，pH 在4.0 以下時(shí)，山梨酸、苯甲酸的保留時(shí)間接近，無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離。pH 大于5.0 時(shí)，苯甲酸峰型前移，于山梨酸之前出峰，與丙酸的保留時(shí)間接近，無(wú)法和丙酸實(shí)現(xiàn)基線分離。考慮各待測(cè)組分的分離度及峰型，試驗(yàn)最終采用pH為4.4。

圖1 pH 對(duì)4 種防腐劑保留時(shí)間的影響

2.4 校準(zhǔn)曲線及檢出限

采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算定量，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表2。由表2可知，丙酸的方法檢出限為0.100 mg/g，定量限為0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的方法檢出限均為0.005 mg/g，定量限均為0.010 mg/g。圖2 為標(biāo)準(zhǔn)品色譜，由圖2 可見(jiàn)，在15 min 內(nèi)4 個(gè)防腐劑均實(shí)現(xiàn)了基線分離，且峰型窄、對(duì)稱(chēng)度高，分離效果較理想。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜

表2 4 種防腐劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 回收率試驗(yàn)

由表3 可知，醬油中不同防腐劑的檢測(cè)，3 個(gè)水平的平均加標(biāo)回收率為65.5%～110.0%。圖3 為加標(biāo)樣品色譜。由表3、圖3 可知，在醬油樣品中，4 個(gè)防腐劑組分均無(wú)基質(zhì)干擾，加標(biāo)平行試驗(yàn)RSD在3.6%～7.4%，說(shuō)明該方法可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確定量。

圖3 加標(biāo)樣品色譜

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果

3 小結(jié)

該研究建立了同時(shí)檢測(cè)醬油中防腐劑丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品直接混勻、過(guò)濾后上機(jī)分析，前處理操作簡(jiǎn)單。樣品加水渦旋混勻，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，以乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離，采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。丙酸的方法檢出限為0.100 mg/g，定量限為0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的方法檢出限均為0.005 mg/g，定量限均為0.010 mg/g；4 種防腐劑3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率為65.5%～110.0%。試驗(yàn)結(jié)果具有較高的回收率及精密度，可滿(mǎn)足醬油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的測(cè)定要求。