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    基于芳香烴受體探討青黛及其主要成分緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

    2023-11-03 06:27:12高陽(yáng)顧思臻薛艷劉曉雯竇丹波
    中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志 2023年11期
    關(guān)鍵詞:色胺靛玉青黛

    高陽(yáng) ,顧思臻 ,薛艷 ,劉曉雯 ,竇丹波

    1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203; 2.同濟(jì)大學(xué)附屬養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院,上海 201619

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種局限于黏膜及黏膜下層的非特異性腸道炎癥性疾病,具有慢性、難治性、復(fù)發(fā)性的特點(diǎn),臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重及不同程度的全身癥狀[1]。UC全球發(fā)病率有逐年升高趨勢(shì)[2]。目前其發(fā)病機(jī)制尚未明確,主要與遺傳、環(huán)境、感染、免疫等因素有關(guān)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療UC存在療效不穩(wěn)定、不良反應(yīng)較多等問題[3]。

    研究顯示,口服青黛治療活動(dòng)期UC臨床療效顯著[4],基礎(chǔ)研究表明,青黛發(fā)揮作用可能與激活A(yù)HR/CYP1A1通路有關(guān)[5]。課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出青黛治療UC的9個(gè)主要成分,包括靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮等,并通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮均為芳香烴受體(AHR)的配體[6]。因此,本研究以AHR及其下游關(guān)鍵分子為切入點(diǎn),采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠UC模型,明確青黛及其主要成分靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮對(duì)UC的影響及作用機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物

    SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠42只,體質(zhì)量18~25 g,上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2022-0009。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,溫度22~25 ℃,濕度50%,自由攝食飲水。每日清潔飼養(yǎng)籠,隔日更換墊料,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批(PZSHUTCM200821015)。

    1.2 藥物及制備

    建青黛[7],為爵床科植物馬藍(lán)Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.的葉或莖葉經(jīng)加工制成的干燥粉末,購(gòu)于福建省德龍藥業(yè),批號(hào)FJ20180005,中國(guó)GMP藥品證書FJ20180005;靛藍(lán),北京索萊寶公司,貨號(hào)SI8050,純度≥98%;靛玉紅,北京索萊寶公司,貨號(hào)SI8060,純度≥98%;色胺酮,上海源葉公司,貨號(hào)S31557,純度≥98%。以上藥物分別用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解,制成建青黛、靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮濃度分別為0.06、0.03、0.001、0.03 g/mL溶液。

    1.3 主要試劑與儀器

    羧甲基纖維素鈉,北京索萊寶公司,貨號(hào)c8621;多聚甲醛固定液,北京索萊寶公司,貨號(hào)p1110;細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)抗體,美國(guó)Proteintech,貨號(hào)13241-1-AP;AHR 抗體,美國(guó)CST 公司,貨號(hào)83200S;白細(xì)胞介素(IL)-10抗體,美國(guó)Proteintech公 司, 貨 號(hào)20850-1-AP; IL-22 抗 體, 美 國(guó)Proteintech,貨號(hào)13462-1-AP;TB Green qPCR 試劑盒,日本TAKARA,貨號(hào)RR420A。

    蛋白電泳儀(上海天能,型號(hào)VE-180),蛋白轉(zhuǎn)膜儀(上海天能,型號(hào)VE-186),5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司,型號(hào)5417R),電熱恒溫水浴鍋(上海精宏,型號(hào)DK-S26),分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo,型號(hào)NanoDrop 2000),PCR儀(德國(guó)Analytik Jena公司,型號(hào)SL96),qPCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào)Stepone plus),凝膠成像系統(tǒng)(上海天能,型號(hào)GIS2009)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組及造模

    按隨機(jī)區(qū)組法將42只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組,每組7只??瞻捉M正常飲水,其余各組飲用4%DSS溶液(將DSS用純水溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用)制備急性UC模型,連續(xù)10 d。

    2.2 給藥

    造模第4日開始,青黛組予青黛溶液600 mg/kg灌胃,靛藍(lán)組予靛藍(lán)溶液300 mg/kg灌胃[8],靛玉紅組予靛玉紅溶液10 mg/kg灌胃[9],色胺酮組予色胺酮溶液300 mg/kg灌胃[10-11],均相當(dāng)于臨床成人等效劑量。空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃,連續(xù)7 d。

    2.3 取材

    末次給藥后小鼠禁食24 h,2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,75%乙醇消毒腹部,沿腹部中線剪開,充分暴露腹膜和腹腔,用鑷子分離結(jié)腸和回腸,將結(jié)腸置于冰上,PBS沖洗結(jié)腸組織,剝離多余脂肪,用標(biāo)尺測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。縱剖結(jié)腸,取出結(jié)腸內(nèi)容物,PBS沖洗,濾紙吸去多余水分,用剪刀剪取病變最明顯處結(jié)腸組織,置于4%多聚甲醛中固定。其余結(jié)腸組織放于EP管內(nèi),置于-80 ℃冰箱保存。

    2.4 一般狀況觀察

    造模及給藥期間,每日記錄各組小鼠體質(zhì)量、精神活動(dòng)狀態(tài)、毛發(fā)色澤、進(jìn)食量和飲水量、大便性狀及存活情況。

    2.5 結(jié)腸組織病理觀察

    結(jié)腸組織置于多聚甲醛溶液中固定24 h,石蠟包埋,制成5 μm切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)變化。

    2.6 Western blot檢測(cè)

    取結(jié)腸組織,加入適量RIPA 裂解液(含1%PMSF)提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,10%電泳分離90 min,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(300 mA、60 min),用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,滴加CYP1A1 一抗(1∶1 000)、AHR一抗(1∶1 000)、IL-10一抗(1∶1 000)、IL-22一抗(1∶2 000),4 ℃孵育過夜。PBST洗膜4次,每次8 min,加二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h。PBST洗膜4次,超敏ECL液顯影。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度值。

    2.7 RT-PCR檢測(cè)

    參照總RNA提取試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA,測(cè)定RNA濃度后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)條件:95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

    表1 各基因PCR引物序列

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示,符合正態(tài)分布且方差齊組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠一般狀況的影響

    空白組小鼠毛色光澤,活動(dòng)靈敏,飲食量、飲水量及糞便情況正常。模型組小鼠毛發(fā)粗糙,活動(dòng)量減少,體質(zhì)量下降,飲食量減少,出現(xiàn)肉眼可見的肛周血便、稀便;青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠毛色、體質(zhì)量、精神狀態(tài)和血便等情況較模型組有不同程度改善。與空白組比較,模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.01)。見表2。

    表2 各組小鼠體質(zhì)量比較(±s,g)

    表2 各組小鼠體質(zhì)量比較(±s,g)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    體質(zhì)量22.37±0.67 15.16±0.63**19.99±0.23##20.09±1.15##20.04±0.63##20.06±0.62##組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍(lán)組色胺酮組只數(shù)7 7 7 7 7 7

    4.2 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸形態(tài)的影響

    與空白組比較,模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.01);與模型組比較,青黛組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加(P<0.01,P<0.05)。見表3。

    表3 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較(±s,cm)

    表3 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較(±s,cm)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

    結(jié)腸長(zhǎng)度6.91±0.24 4.76±0.59**5.70±0.54##6.11±0.32##5.11±0.40 5.30±0.44#組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍(lán)組色胺酮組只數(shù)7 7 7 7 7 7

    HE染色顯示,空白組小鼠結(jié)腸黏膜、腺體完整,隱窩正常,無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠結(jié)腸黏膜缺損,腺體不完整,隱窩縮短或消失,杯狀細(xì)胞減少,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及黏膜下層水腫等變化;青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織潰瘍及黏膜損傷程度明顯減輕,水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有不同程度改善。見圖1。

    圖1 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)(HE染色,×200)

    4.3 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織芳香烴受體、細(xì)胞色素P4501A1、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-22蛋白表達(dá)的影響

    與空白組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);與模型組比較,各給藥組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、圖3。

    圖2 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白免疫印跡

    圖3 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達(dá)比較(±s,每組7只)

    4.4 青黛及其主要成分對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織芳香烴受體、細(xì)胞色素P501A1、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-22 mRNA表達(dá)的影響

    與空白組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織AHR、IL-10、IL-22 mRNA 表 達(dá) 明 顯 降 低(P<0.01),CYP1A1 mRNA表達(dá)有降低趨勢(shì)(P>0.05);與模型組比較,靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01),靛藍(lán)組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-22 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01),青黛組小鼠結(jié)腸組織AHR、IL-10 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見表4。

    表4 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較(±s)

    表4 各組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較(±s)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    組別空白組模型組青黛組靛藍(lán)組靛玉紅組色胺酮組IL-22 73.12±19.76 3.56± 2.27**19.97± 6.94 34.56± 3.18##143.46± 8.62##207.05±13.02##只數(shù)7 7 7 7 7 7 AHR 3.31±0.25 0.46±0.06**2.14±0.64##1.78±0.18##3.42±1.01##5.59±0.53##CYP1A1 69.18±15.36 22.89± 3.30 36.20± 4.78 166.96±85.04##117.42±17.09##259.51± 6.17##IL-10 53.59± 2.81 11.87± 1.58**69.53± 7.42##19.65± 0.71 85.28± 6.94##126.50±25.48##

    5 討論

    青黛有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效。口服青黛方藥多用于治療血證,包括血熱吐衄、胸痛咳血、溫毒發(fā)斑等,如《端效方》青金散治吐血不止,“青黛二錢,新水調(diào)下”;《本經(jīng)逢原》謂其能“散郁火,治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”;《本草求真》言:“青黛,大瀉肝經(jīng)實(shí)火及散肝經(jīng)火郁……痢血等癥。”UC發(fā)作以便膿血為主,鏡下表現(xiàn)為腸黏膜潰瘍、糜爛、出血等,屬中醫(yī)學(xué)“久痢”“血證”等范疇。臨床研究顯示,口服青黛對(duì)UC患者有良好的治療效果[12],對(duì)于中度UC活動(dòng)期患者病情緩解效果顯著[4],不同劑量青黛聯(lián)合西藥治療后,其臨床有效率、緩解率和黏膜愈合率均顯著高于安慰劑組[13]。實(shí)驗(yàn)研究表明,青黛能下調(diào)UC模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)[14],抑制小鼠炎癥反應(yīng)并促進(jìn)黏膜修復(fù)[15],升高短鏈脂肪酸受體GPR41、GPR43表達(dá),調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡,發(fā)揮治療UC作用[16];體外實(shí)驗(yàn)顯示,青黛能通過降低炎癥因子IL-6表達(dá)發(fā)揮抗炎效果[17]。以上結(jié)果均提示青黛具有治療UC潛能,但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

    AHR是由805個(gè)氨基酸組成的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子[18],非活性狀態(tài)的AHR可被其配體激活,活化的AHR從復(fù)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài),進(jìn)一步與細(xì)胞核內(nèi)AHR核轉(zhuǎn)位蛋白結(jié)合為二聚體,從而促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄[19]。AHR可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗炎作用[20]。研究顯示,UC患者AHR mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,使用AHR拮抗劑后,UC小鼠結(jié)腸炎癥程度進(jìn)一步加重;AHR基因敲除UC小鼠出現(xiàn)不同程度的結(jié)腸組織損害、隱窩結(jié)構(gòu)變形、上皮細(xì)胞壞死水腫及中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[22],提示上調(diào)AHR表達(dá)能緩解結(jié)腸炎癥狀態(tài)。AHR與配體結(jié)合后能上調(diào)CYP1A1 表達(dá),CYP1A1 表達(dá)升高是AHR 活化的標(biāo)志[5],激活A(yù)HR/CYP1A1信號(hào)通路可能是抑制UC炎癥的作用機(jī)制。IL-10作為一種抗炎因子,其表達(dá)水平與UC疾病進(jìn)展有關(guān)。AHR/CYP1A1信號(hào)通路活化后能促進(jìn)IL-10表達(dá)和分泌,進(jìn)而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IL-10受體(IL-10R1)表達(dá)[23]。IL-10 與IL-10R1 結(jié)合后,介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)磷酸化,p-STAT3通過上調(diào)抗凋亡和增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腸黏膜愈合。臨床研究發(fā)現(xiàn),中重度UC 患者結(jié)腸黏膜IL-10表達(dá)明顯低于輕度UC患者及正常組[24],而IL-10基因敲除小鼠可出現(xiàn)自發(fā)性腸炎[25]。IL-22在UC發(fā)病中起重要作用,可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗菌肽保護(hù)腸道上皮細(xì)胞屏障功能。IL-22由多種細(xì)胞產(chǎn)生,包括自然殺傷細(xì)胞、活化T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞17等。腸道中IL-22主要由維甲酸相關(guān)孤兒受體γt 相關(guān)的固有淋巴細(xì)胞ILC3產(chǎn)生[26]。此外,腸道微生物能通過激活A(yù)HR影響IL-22表達(dá)。

    本研究通過DSS自由飲用建立UC小鼠模型,并分別予青黛、靛藍(lán)、靛玉紅及色胺酮進(jìn)行干預(yù),結(jié)果表明,模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短和體質(zhì)量下降有所恢復(fù),同時(shí)結(jié)腸組織病理變化明顯減輕,黏膜損傷、水腫、潰瘍情況好轉(zhuǎn),炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)AHR/CYP1A1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá),青黛組、靛藍(lán)組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。PCR結(jié)果顯示,靛玉紅組和色胺酮組小鼠結(jié)腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)顯著升高。提示青黛及其主要成分靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮可能通過激活A(yù)HR/CYP1A1通路上調(diào)抗炎因子IL-10和IL-22表達(dá),進(jìn)而改善UC。其中以靛玉紅和色胺酮改善各項(xiàng)指標(biāo)作用最明顯。本研究對(duì)青黛及其主要成分治療UC的作用機(jī)制進(jìn)行探討,可為中醫(yī)藥治療UC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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