紅芪多糖對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞焦亡的影響

仲倩利，李榮科，萬(wàn)生芳，張倩，魏昭暉，郭倩，馬欣欣，張磊，楊雅麗，張亞男

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見的消化系統(tǒng)并發(fā)癥之一，以非梗阻因素所致的胃排空延遲為特點(diǎn)[1]，主要表現(xiàn)為早飽、惡心、嘔吐、腹脹、厭食等，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量。DGP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有研究指出，細(xì)胞焦亡與糖尿病及其并發(fā)癥進(jìn)展有關(guān)[2]，細(xì)胞焦亡引起的大量炎癥因子釋放是DGP重要病理環(huán)節(jié)。DGP屬中醫(yī)學(xué)“痞滿”“嘔吐”等范疇，其病機(jī)以脾虛為本，治當(dāng)健脾益氣，用藥以補(bǔ)氣健脾類藥物為主[3]。紅芪是補(bǔ)氣中藥，其主要活性成分紅芪多糖有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及延緩糖尿病并發(fā)癥等作用[4]。課題組前期研究表明，紅芪多糖能降低DGP大鼠血糖，調(diào)節(jié)血脂代謝，促進(jìn)胃排空，增加胃激素含量，修復(fù)胃腸組織損傷，提高胃腸動(dòng)力[5-7]。本實(shí)驗(yàn)觀察紅芪多糖對(duì)DGP大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞焦亡的影響，深入探討紅芪多糖提升胃動(dòng)力、促進(jìn)胃排空的分子機(jī)制，為開發(fā)治療DGP藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí) 雄性Wistar 大鼠60 只，6 周齡，體質(zhì) 量（180±20）g，北京斯貝福生物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度45%～50%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（2021-804）。

1.2 藥物及制備

紅芪多糖，陜西省寶雞市方晟生物開發(fā)公司制備，純度72.4%，批號(hào)20200315。枸櫞酸莫沙必利分散片，成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，5 mg/片，批號(hào)190614。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，德國(guó)VETEC 公司，批號(hào)WXBD4971V），蘇木素-伊紅染液（江蘇艾迪生物，批號(hào)B1003），TUNEL 試劑盒（瑞士Roche，批號(hào)11684817910），RNA提取試劑盒（上海翌圣生物，批號(hào)19221ES50），NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）抗體（美國(guó)ImmunoWay公司，批號(hào)YT5328），胱天蛋白酶-1（Caspase-1）抗體（美國(guó)ImmunoWa 公司，批號(hào)YT5743），焦孔素D（GSDMD）抗體（武漢三鷹，批號(hào)20770-1-AP），白細(xì)胞介素（IL）-1β 抗體（美國(guó)ImmunoWay公司，批號(hào)YT5201），GAPDH一抗（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)AF7021），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（美國(guó)Affinity 公司，批號(hào)S0001），Super ECL Plus超敏發(fā)光液（北京普利萊，批號(hào)P10100）。血糖儀（羅氏卓越金采，型號(hào)Accu-Chek Performa），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，型號(hào)FRESCO 21），離心機(jī)（常州市金壇恒豐，型號(hào)XYJ80-2），包埋機(jī)（武漢俊杰，型號(hào)JB-P5），病理切片機(jī)（上海徠卡，型號(hào)RM2016），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號(hào)Nikon Eclipse CI），倒置熒光顯微鏡（日本尼康，型號(hào)Nikon Eclipse Ti-SR），顯微鏡相機(jī)控制器（日本尼康，型號(hào)Nikon DS-U3），多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司，型號(hào)Infinite M200 Pro），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)Varioskan Lux），搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號(hào)TS-92），凝膠電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)PowerPoc Basic），多功能分子成像系統(tǒng)（美國(guó)Azure Biosystems公司，型號(hào)c600）。

1.4 分組、造模及給藥

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只作為空白組，剩余50只禁食不禁水24 h，一次性腹腔注射1%STZ溶液（溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.5）50 mg/kg，空白組注射等體積檸檬酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖，≥16.7 mmol/L且維持1周以上為糖尿病造模成功[5]。DM大鼠予高脂高糖飼料不規(guī)則喂養(yǎng)（單日上午進(jìn)食、雙日下午進(jìn)食），連續(xù)喂養(yǎng)4周后檢測(cè)隨機(jī)血糖，≥16.7 mmol/L并伴有腹部脹大、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)，隨機(jī)抽取空白組和造模大鼠各2只處死，檢測(cè)胃肌電活動(dòng)，造模大鼠胃自主收縮頻率較空白組顯著降低提示DGP模型制備成功。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、莫沙必利組及紅芪多糖低、中、高劑量組，每組分別為11、8、9、9、8只。實(shí)驗(yàn)第6周開始給藥，根據(jù)體表面積法及紅芪多糖純度計(jì)算等效劑量，莫沙必利組予枸櫞酸莫沙必利分散片3.5 mg/kg灌胃，紅芪多糖低、中、高劑量組分別予紅芪多糖50、100、200 mg/kg灌胃（灌胃時(shí)將所需用量枸櫞酸莫沙必利分散片和紅芪多糖分別溶于2 mL純凈水），灌胃體積均為2 mL，空白組和模型組予等體積純凈水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。給藥期間空白組予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，每2周尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖并測(cè)量體質(zhì)量。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 胃排空率檢測(cè)

給藥結(jié)束后，大鼠禁食24 h、禁水2 h，予50 mg/dL酚紅溶液2 mL灌胃，20 min后10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，剖腹結(jié)扎賁門和幽門，取出整胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物，定容至20 mL，加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL攪拌均勻，室溫靜置1 h，取5 mL上清液，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去蛋白，3 500 r/min離心15 min，取上清液。另取酚紅溶液2 mL，依次加入生理鹽水18 mL、0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL、三氯乙酸溶液4 mL，攪拌均勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品。多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560 nm 處測(cè)定吸光度（A值），計(jì)算胃排空率。胃排空率（%）=（標(biāo)準(zhǔn)品A值-樣品A值）÷標(biāo)準(zhǔn)品A值×100%。

1.5.2 HE染色

取相同部位胃竇組織，放入固定液中固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無(wú)水乙醇Ⅰ10 min、無(wú)水乙醇Ⅱ10 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，蒸餾水洗。Harris蘇木素染6 min，自來(lái)水洗，1%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染液染色3 min，切片依次放入95%乙醇Ⅰ5 min、95%乙醇Ⅱ5 min、無(wú)水乙醇Ⅰ5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，圖像采集分析。

1.5.3 TUNEL染色

石蠟切片脫蠟至水，加蛋白酶K工作液（用PBS以1∶9稀釋），37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，加破膜工作液，常溫孵育20 min，PBS 洗滌5 min×3次，取TUNEL 試劑盒內(nèi)試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按2∶29混合，覆蓋組織，切片放于濕盒內(nèi)，37 ℃孵育2 h，PBS 洗滌5 min×3 次，加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次，切片甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)200倍視野拍照，綠色熒光細(xì)胞核為DNA損傷陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞核為活細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞損傷率。細(xì)胞損傷率（%）=DNA損傷陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.4 RT-qPCR檢測(cè)

稱取大鼠胃竇組織100 mg于無(wú)酶EP管中，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將所得cDNA樣品分別配制RT-qPCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由上海翌圣生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.5.5 Western blot檢測(cè)

取胃竇組織100 mg于EP管中，預(yù)冷生理鹽水清洗，剪碎，加入蛋白裂解液，勻漿機(jī)70 Hz、180 s研磨，置于冰上裂解，每15 min進(jìn)行一次反復(fù)晃動(dòng)，2 h后，低溫離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜6 min×4次，加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗（均為1∶500）、GSDMD 一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜6 min×4 次，滴加二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜6 min×4次，ECL發(fā)光液顯色，多功能分子成像系統(tǒng)成像。采用Image J 1.4.8軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

造模時(shí)大鼠死亡3只，給藥過(guò)程中模型組和紅芪多糖低、中劑量組各死亡3、1、1只，最終空白組、模型組及紅芪多糖各劑量組均剩余8只大鼠?？瞻捉M大鼠活躍，毛色光澤，墊料干燥；模型組大鼠懶動(dòng)，喜臥扎堆，毛色黯淡，墊料潮濕；隨著給藥時(shí)間增加，各給藥組大鼠一般狀況逐漸好轉(zhuǎn)，以紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組較為明顯。

2.2 紅芪多糖對(duì)模型大鼠隨機(jī)血糖和體質(zhì)量的影響

與空白組比較，給藥各時(shí)點(diǎn)模型組大鼠隨機(jī)血糖顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組大鼠隨機(jī)血糖顯著降低（P＜0.05），給藥8周后紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠隨機(jī)血糖顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)隨機(jī)血糖比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)隨機(jī)血糖比較（±s，mmol/L）

注：與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，##P＜0.01；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組給藥8周5.81±1.30 32.24±0.81##25.95±2.14**25.29±4.38**23.45±6.68**22.03±6.78**只數(shù)8 8 8 8 8 8給藥2周5.76±1.29 31.50±1.13##31.10±1.70 30.95±0.35 29.25±1.06 29.15±3.75給藥4周5.70±1.28 32.60±0.21##28.18±1.41 29.48±0.84 27.57±3.99*27.50±5.09*給藥6周5.75±1.28 32.30±0.14##28.18±1.41 28.03±3.10 25.75±6.63**25.50±4.69**

與空白組比較，給藥各時(shí)點(diǎn)模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕（P＜0.01）；與模型組比較，給藥2周后紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），給藥4周后紅芪多糖中、高劑量組和莫沙必利組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），給藥8周后紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s，g）

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組同一時(shí)點(diǎn)比較，##P＜0.01；與模型組同一時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05，**P＜0.01

給藥8周480.84±47.79 229.51± 8.20##283.78±30.83**316.25±32.94**340.13±43.60**374.69±45.64**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數(shù)8 8 8 8 8 8給藥2周429.56±44.93 278.81±25.10##291.08±12.22 317.49± 9.42 329.68±20.37**364.30±35.67**給藥4周445.84±46.48 264.15±11.39##268.26±31.48 308.08±25.72*307.39±25.10*351.14±37.86**給藥6周463.23±47.28 246.99±16.35##263.29±31.48 310.71±26.73**327.65±30.23**366.41±39.87**

2.3 紅芪多糖對(duì)模型大鼠胃排空率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠胃排空率顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠胃排空率比較（±s，%）

表4 各組大鼠胃排空率比較（±s，%）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

胃排空率77.72±3.01 30.46±5.47##44.51±4.33**52.29±4.82**65.06±1.78**73.67±2.81**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數(shù)8 8 8 8 8 8

2.4 紅芪多糖對(duì)模型大鼠胃竇組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠胃竇組織腺體結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞未見明顯變性脫落，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠胃竇組織腺體結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞膜完整性喪失，大面積黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組大鼠胃竇組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，以莫沙必利組和紅芪多糖高劑量組作用較顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠胃竇組織形態(tài)（HE染色，×100）

2.5 紅芪多糖對(duì)模型大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞DNA損傷的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞損傷率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖中、高劑量組和莫沙必利組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞損傷率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表5。

圖2 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞DNA損傷情況（TUNEL染色，×200）

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞損傷率比較（±s，%）

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌細(xì)胞損傷率比較（±s，%）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

細(xì)胞損傷率1.94±0.02 18.87±4.96##9.76±9.28 7.27±1.97*3.69±1.47**3.42±0.42**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數(shù)8 8 8 8 8 8

2.6 紅芪多糖對(duì)模型大鼠胃竇組織焦亡相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。見表6。

表6 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組IL-1β 1.00±0.05 1.55±0.21##0.96±0.12**0.88±0.12**0.68±0.13**0.49±0.09**只數(shù)8 8 8 8 8 8 NLRP3 1.13±0.67 1.71±0.33##0.77±0.09**0.65±0.07**0.60±0.16**0.46±0.03**Caspase-1 1.00±0.10 1.48±0.33#0.88±0.01**0.57±0.03**0.45±0.02**0.20±0.01**GSDMD 1.00±0.08 1.47±0.21#0.80±0.15**0.52±0.03**0.27±0.05**0.21±0.05**

2.7 紅芪多糖對(duì)模型大鼠胃竇組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表7。

圖3 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

表7 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組IL-1β 0.29±0.11 0.51±0.16##0.23±0.08**0.21±0.08**0.17±0.06**0.14±0.04**只數(shù)8 8 8 8 8 8 NLRP3 0.17±0.03 0.32±0.05#0.13±0.03*0.12±0.03*0.09±0.02**0.08±0.02**Caspase-1 0.30±0.06 0.48±0.06#0.21±0.08**0.19±0.05**0.15±0.01**0.09±0.02**GSDMD 0.20±0.07 0.39±0.11#0.19±0.04*0.14±0.01**0.09±0.02**0.08±0.01**

3 討論

糖尿病是一種復(fù)雜的非感染性炎癥性疾病，也是臨床常見代謝性疾病，我國(guó)2 型糖尿病患病率達(dá)11.2%[8]，其發(fā)病率高、并發(fā)癥多、危害嚴(yán)重。糖尿病患者多伴有消化系統(tǒng)功能異常，其中最常見的是DGP，發(fā)病率占糖尿病的60%以上[9]。由于其發(fā)病較為隱匿，且早期多以消化道癥狀為主，因而極易被忽視。目前DGP發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DGP是在高血糖基礎(chǔ)上由自主神經(jīng)病變、Cajal間質(zhì)細(xì)胞病變、胃腸激素分泌異常、胃腸平滑肌炎癥、免疫系統(tǒng)及其他因素導(dǎo)致，胃平滑肌細(xì)胞損傷、胃腸肌運(yùn)動(dòng)功能減弱是其關(guān)鍵機(jī)制[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，DGP患者胃腸組織存在廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥因子及炎癥反應(yīng)在DGP的發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[12-13]。

細(xì)胞焦亡是一種由Gasdermin蛋白介導(dǎo)的Caspase依賴的炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式，具有凋亡和壞死的特點(diǎn)，包括細(xì)胞核萎縮、DNA斷裂和TUNEL染色陽(yáng)性、細(xì)胞腫脹和破裂、炎癥反應(yīng)[14-15]。NLRP3、Caspase-1和GSDMD是細(xì)胞焦亡的核心因子，NLRP3能識(shí)別高糖、高脂等內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式，與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和Caspase-1前體組裝成多蛋白復(fù)合體即NLRP3炎性小體，進(jìn)而使Caspase-1活化，促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18加工和成熟，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，特異性切割GSDMD，產(chǎn)生具有細(xì)胞膜成孔活性的GSDMD-N片段，形成質(zhì)膜孔，釋放炎癥因子和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，引發(fā)細(xì)胞焦亡，激活下游炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓增加，致使細(xì)胞腫脹裂解，進(jìn)一步擴(kuò)大免疫炎癥反應(yīng)[16-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18]。高脂喂養(yǎng)小鼠Caspase-1、NLRP3 和GSDMD水平明顯升高，抑制脂肪細(xì)胞NLRP3炎性小體激活可改善胰島素抵抗[19]；Caspase-1 通過(guò)參與由NLRP3炎性小體調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)影響糖尿病患者腎臟結(jié)構(gòu)和功能[20]；GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡會(huì)加速胰島β細(xì)胞破壞，導(dǎo)致胰島素抵抗[21]。NLRP3炎性小體激活后釋放大量促炎因子IL-1β，導(dǎo)致胰島素分泌異常，最終引發(fā)糖尿病[22]?；诖?，可以認(rèn)為NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)。DGP是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，胃腸平滑肌炎癥是DGP 發(fā)生的重要機(jī)制，細(xì)胞焦亡的發(fā)生伴隨大量炎癥因子釋放及持續(xù)的炎癥反應(yīng)，因此推測(cè)糖尿病持續(xù)的高糖高脂狀態(tài)引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致胃竇平滑肌細(xì)胞損傷，細(xì)胞焦亡，使胃動(dòng)力減弱、胃排空減慢，進(jìn)而引發(fā)DGP。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠胃竇組織出現(xiàn)大面積黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)胃竇組織平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜完整性喪失、DNA損傷顯著增加，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，以上病理變化可能是導(dǎo)致大鼠血糖升高，體質(zhì)量、胃排空率顯著降低的原因；經(jīng)藥物干預(yù)后，各給藥組大鼠狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，血糖顯著降低，體質(zhì)量、胃排空率顯著升高，胃竇組織黏膜損傷程度減輕，胃竇組織平滑肌細(xì)胞DNA損傷減少，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低，提示胃平滑肌炎癥及損傷減輕，胃動(dòng)力有所恢復(fù)。

綜上，紅芪多糖能改善DGP大鼠一般狀況，提高胃排空率，一定程度上減輕胃平滑肌炎癥損傷、恢復(fù)胃動(dòng)力，其機(jī)制可能與下調(diào)胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)。關(guān)于紅芪多糖調(diào)控細(xì)胞焦亡的深層分子機(jī)制，課題組將從代謝組學(xué)角度進(jìn)一步研究。