HPLC 法測(cè)定復(fù)方賴氨酸顆粒中鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣的含量

李 昭，鄭金鳳，石笑弋，劉 軼，李昌亮，劉雁鳴，李曉燕

1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410001；3.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001

復(fù)方賴氨酸顆粒收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》（化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，第16 冊(cè)）[1]，是由鹽酸賴氨酸、葡萄糖酸鈣、維生素B1、維生素B6等組成的復(fù)方制劑，主要用于改善賴氨酸缺乏引起的小兒食欲不振和營(yíng)養(yǎng)不良，亦用于補(bǔ)充賴氨酸、維生素和鈣質(zhì)。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用一階導(dǎo)數(shù)紫外法測(cè)定鹽酸賴氨酸含量，原子吸收法測(cè)定葡萄糖酸鈣的含量。但該檢測(cè)方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、效率較低，且重復(fù)性差，增大了生產(chǎn)及質(zhì)量控制的難度。本文將參考有關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，建立一種能快速、準(zhǔn)確且同時(shí)測(cè)定復(fù)方賴氨酸顆粒中鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣含量的方法，以期為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供更好的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent1260 II 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，UV 紫外檢測(cè)器）；XP205 型電子天平（瑞士梅特勒公司，精密度：1/100000）。

1.2 材料與試劑

樣品：復(fù)方賴氨酸顆粒（四川某制藥公司，批號(hào)：190201，190202，190203）；鹽酸賴氨酸對(duì)照品（來源：中檢院；批號(hào)：140673-201207；含量：99.8%）；葡萄糖酸鈣對(duì)照品（來源：中檢院；批號(hào)：100082-201803；含量：100%）；水為超純水；乙腈（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司，批號(hào)：TIDA1H）；磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190328）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（60∶40）；檢測(cè)器：UV 檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 制備溶液

對(duì)照品溶液：精密稱取鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣對(duì)照品適量，加溶劑溶解并稀釋制成約含鹽酸賴氨酸5.4 mg/mL 和葡萄糖酸鈣0.3mg/mL 的溶液。

供試品溶液：取出10 袋本品的內(nèi)容物，精密稱定，研磨，再精密稱取細(xì)粉適量，加溶劑溶解并稀釋制成約含鹽酸賴氨酸5.4 mg/mL 和葡萄糖酸鈣0.3 mg/mL 的溶液。

陰性樣品溶液：精密稱取除鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣以外的其余原輔料，按處方比例配制。

精密稱取鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣對(duì)照品適量，加溶劑溶解并稀釋制成含鹽酸賴氨酸1.346 0、2.692 0、4.038 0、5.384 1、6.057 1、6.730 1 和7.403 1 mg/mL，葡萄糖酸鈣0.075 9、0.151 8、0.227 7、0.303 6、0.341 5、0.379 5 和0.417 5 mg/mL 的系列溶液。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.3.3 進(jìn)行試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)的供試品（批號(hào)190201）6 份，按1.3.2 項(xiàng)的操作制備供試品溶液。

精密度試驗(yàn)：取重復(fù)性項(xiàng)下的樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。

回收率試驗(yàn)：精密稱取9 份不含鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣的其余原輔料，分別置于100 mL 量瓶中，分別按低、中、高三種濃度加入3 份鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣，按1.3.2 項(xiàng)的操作制備供試品溶液。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液，分別于配制0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

專屬性試驗(yàn)：結(jié)果表明，陰性樣品溶液主峰位置無干擾，該方法專屬性良好。詳見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖（1：葡萄糖酸鈣；2：鹽酸賴氨酸）

線性試驗(yàn)：鹽酸賴氨酸線性方程為A=441.08C+11.83，r=0.999 9；葡萄糖酸鈣線性方程為A =751.41C-3.93，r=0.999 8。試驗(yàn)結(jié)果表明：鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度在1.346 0～7.403 1 mg/mL 范圍內(nèi)，葡萄糖酸鈣質(zhì)量濃度在0.075 9～0.417 5 mg/mL 范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

重復(fù)性試驗(yàn)：6 次測(cè)定鹽酸賴氨酸的平均含量為97.74%，SRSD為0.23%（n=6）；葡萄糖酸鈣的平均含量為98.46%，SRSD為0.38%（n=6）。試驗(yàn)結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：鹽酸賴氨酸峰面積的SRSD為0.03%（n=6）；葡萄糖酸鈣峰面積的SRSD為0.73%（n=6）。試驗(yàn)結(jié)果表明，精密度良好。

回收率試驗(yàn)：鹽酸賴氨酸平均回收率為99.32%，SRSD為0.27%（n=9）；葡萄糖酸鈣平均回收率為100.51%，SRSD為0.71%（n=9）。試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：鹽酸賴氨酸峰面積的SRSD為0.23%（n=6）；葡萄糖酸鈣峰面積的SRSD為1.13%（n=6）。試驗(yàn)結(jié)果表明：溶液24 h 內(nèi)保持在穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-047-2000 測(cè)定結(jié)果比較

將按照上述方法測(cè)得的結(jié)果與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)收載的復(fù)方賴氨酸顆粒含量測(cè)定方法測(cè)得的結(jié)果相比較，比較結(jié)果見表1。由表可知，該方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的結(jié)果基本一致。

表1 不同方法測(cè)定鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣含量的比較（單位：%）

3 討論與結(jié)論

復(fù)方賴氨酸顆粒現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第十六冊(cè)WS1-XG-047-2000，其中鹽酸賴氨酸含量測(cè)定采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法，葡萄糖酸鈣含量測(cè)定采用原子吸收法，但使用該方法操作較為繁瑣。對(duì)此，本文采用了較為簡(jiǎn)便的高效液相色譜法，直接測(cè)定鹽酸賴氨酸和葡萄糖酸鈣兩種組分含量，有助于提升檢測(cè)效率。

鹽酸賴氨酸屬于末端吸收，文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法測(cè)定賴氨酸大多采用的是衍生法，操作繁瑣，增加了分析步驟和成本。而本研究提出的方法不經(jīng)衍生，操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、分離效果好、準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性都比較理想，符合分析工作的要求，值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。