基于表型性狀的新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)構(gòu)建

于秀明,杜 雨,汪 鵬,李 倩,王玉祥,張 博

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)具有耐鹽堿、抗旱和抗寒等優(yōu)良抗逆性狀,廣泛分布于我國北方地區(qū),在新疆北疆地區(qū)分布尤為廣泛。黃花苜蓿也是進(jìn)行苜蓿育種改良重要基因源,種群間存在著廣泛的遺傳多樣性,可以與紫花苜蓿進(jìn)行自然雜交[3-5]。

中國的黃花苜蓿資源豐富、分布廣泛且形態(tài)變異大,隨著地理環(huán)境和生態(tài)條件的不同,植株的高矮、葉片形狀和大小、莢果形狀和大小都有很大差異[6],形態(tài)差異是種質(zhì)篩選的重要依據(jù)。黃花苜蓿種群間、種群內(nèi)表型性狀差異大,具有豐富的遺傳多樣性[3,4,7]。相關(guān)研究結(jié)果表明,苜蓿類群間表型性狀的多樣性程度與生境呈正相關(guān)關(guān)系[5,8-10],同時(shí),黃花苜蓿的遺傳多樣性不僅存在于種群間,不同雜交種之間以及不同個(gè)體之間也具有豐富表型性狀差異[11]。

核心種質(zhì)的概念最早是由Frankel等[12]提出的,是以最少數(shù)量的遺傳資源最大限度的保存整個(gè)資源群體的遺傳多樣性和整個(gè)群體的地理分布,以此來提高種質(zhì)資源的利用和基因挖掘的效率。目前已經(jīng)在許多植物上應(yīng)用,如玉米[13]、番茄[14]、菠菜[15]、大豆[16]等作物中,1995年Diwan通過從3 159份一年生苜蓿材料中選出211份材料作為核心種質(zhì),構(gòu)建了一年生苜蓿的核心種質(zhì)[17],同年,Basigalup等[18]從1 100份多年生苜蓿材料中選出200份材料作為多年生苜蓿核心種質(zhì)。

為了鑒定出優(yōu)質(zhì)的新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)資源,本研究選擇70份黃花苜蓿種質(zhì),對(duì)其遺傳多樣性分析并抽取核心種質(zhì),以期為新疆黃花苜蓿育種和新品種選育提供材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草種質(zhì)資源與育種團(tuán)隊(duì)提供,來自哈密地區(qū)：巴里坤縣、阿格喜沃巴村和伊吾縣等地共23份,伊犁地區(qū)：特克斯縣、尼勒克縣兩地共4份,昌吉地區(qū)：瑪納斯縣、奇臺(tái)縣等地共14份,阿勒泰地區(qū)：布爾津縣、哈巴河縣、富蘊(yùn)縣、吉木乃縣等地共20份,塔城地區(qū)：額敏縣、西戈壁縣、裕民縣等地共9份。

2021年7月在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院人工氣候室育苗,育苗袋尺寸為10 cm×9 cm×8.5 cm;溫度白天25℃,夜間20℃。選擇籽粒飽滿的種子并將種皮劃破從而破除休眠,播種深度為1 cm;萌發(fā)期3 d澆水一次,出苗之后5～7 d天澆水一次,生長4周之后進(jìn)行倍性檢驗(yàn)試驗(yàn),后繼續(xù)生長2周,于初霜期之前移入新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪教學(xué)實(shí)踐基地,株行距均為60 cm,次年初花期值成熟期進(jìn)行形態(tài)數(shù)據(jù)采集。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1性狀調(diào)查方法 在黃花苜蓿初花期(50%開花)進(jìn)行數(shù)據(jù)測量,測量項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)如下：

株高(Plant height,PH)：從地表到植株頂部的絕對(duì)高度(cm);

節(jié)間長(Internode length,IL)：由地面向上第4個(gè)節(jié)間長度(cm);

莖粗(Stem diameter,ST)：測定節(jié)間長的同時(shí)測定基部粗度(mm);

莖節(jié)數(shù)(Number of stem nodes,NS)：測定節(jié)間長的同時(shí)測定莖節(jié)數(shù)(個(gè));

單枝花序數(shù)(Single branch flower ordinal number,BFON)：主枝上開放的花序以及未開放的花蕾的總數(shù)(個(gè));

單序小花數(shù)(Number of florets in single order,NFSO)：開花期測定主枝上開放花序的小花總數(shù)(個(gè));

花序長(Inflorescence length,IL)：測定花序基部至頂端之間的距離(mm);

花序?qū)?Inflorescence width,IW)：測定花序中間部位的寬度(mm);

小花長(Floret length,FL)：小花花萼基部到花冠頂端之間的垂直距離(mm);

葉長(Leaf length,LL)：主莖上從上向下數(shù)第四個(gè)葉片中間小葉長度(mm);

葉寬(Leaf width,LW)：主莖上從上向下數(shù)第四個(gè)葉片中間小葉寬度(mm);

葉面積(Leaf area,LA)：主莖上從上向下數(shù)第四個(gè)葉片中間小葉面積(mm)。

在成熟期(莢果成熟70%)進(jìn)行下列數(shù)據(jù)的測量：

莢長(Pod length,PL)：隨機(jī)選取30個(gè)成熟莢果,測量莢長(mm);

莢寬(Pod width,PW)：隨機(jī)選取30個(gè)成熟莢果,測量莢寬(mm);

莢厚(Pod thickness,PT)：隨機(jī)選取30個(gè)成熟莢果,測量莢厚(mm);

單莢種子數(shù)(Number of seeds per pod,NSPP)：測定 100 粒莢果含種子數(shù),相差小于 5%時(shí),取平均值(粒);

種子長(Seed length,SL)：隨機(jī)選取100個(gè)成熟飽滿種子,測量種子長(mm);

種子寬(Seed width,SW)：隨機(jī)選取100個(gè)成熟飽滿種子,測量種子寬(mm);

種子厚(Seed thickness,ST)：隨機(jī)選取100個(gè)成熟飽滿種子,測量種子厚(mm);

指標(biāo)測量方法參考李志勇等[19]指定的《苜蓿種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2種質(zhì)資源的遺傳多樣性 計(jì)算所有性狀的均值(Mean,X)、極大值(Max.)、極小值(Min.)、極差(Range)、表型方差(Phenotypic variance)、變異系數(shù)(CV)和標(biāo)準(zhǔn)差(Standard deviation,s)等。根據(jù)計(jì)算結(jié)果將所有材料每個(gè)性狀劃分為10個(gè)等級(jí),按第1級(jí)[Xi<(X-2 s)]到第10級(jí)[Xi≥(X+2 s)],每0.5 s為1級(jí),每1級(jí)的相對(duì)頻率(Pi)用于計(jì)算多樣性指數(shù)。遺傳多樣性指數(shù)即Shannon-Wiener index(H’)信息指數(shù)。Xi為第i級(jí)別中的數(shù)據(jù)[20-22]。

1.2.3核心種質(zhì)庫的構(gòu)建 對(duì)新疆野生黃花苜蓿的表型性狀進(jìn)行主成分分析和聚類分析。聚類分析中遺產(chǎn)距離為歐式距離(Euclidean distance),聚類方法采用離差平方和法(Ward’s method)[23]。

根據(jù)各子集的遺傳多樣性分別采用隨機(jī)、位點(diǎn)優(yōu)先和偏離度取樣策略,在聚類方法和取樣策略的基礎(chǔ)上選取5個(gè)抽樣比例(10%,15%,20%,25%,30%),對(duì)以上取樣策略進(jìn)行檢驗(yàn),比較選擇出構(gòu)建新疆野生黃花苜蓿核心種質(zhì)的最終策略。

1.2.4核心種質(zhì)代表性評(píng)價(jià) 利用均值差異百分率(Mean difference percentage,MD%)、方差差異百分率(Variance difference percentage,VD%)、極差符合率(Coincidence rate of range,CR%)和變異系數(shù)變化率(Variable rate in C.V.,VR%)作為評(píng)價(jià)參數(shù)[24],利用均值、極值、極差、表型方差、變異系數(shù)等評(píng)價(jià)核心種質(zhì)的代表性[25]。

1.2.5倍性檢驗(yàn)方法 使用參照Sysmex Partec GmbH Arndtstraβe 11 a-b試劑盒使用方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析,利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類及方差分析。

H′=-∑Pi×LnPi

式中Pi為某形狀第i級(jí)別內(nèi)材料分?jǐn)?shù)占總份數(shù)的百分比,

其中St是核心子集與原始群體t檢驗(yàn)得到的均值差異顯著(P=0.05)的性狀數(shù),n是性狀總數(shù)。

其中SF是核心子集與原始群體F檢驗(yàn)得到的方差差異顯著(P=0.05)的性狀數(shù),n是性狀總數(shù)。

其中Rc為核心種質(zhì)庫性狀的極差,Ri是原有遺傳資源性狀的極差,n是性狀總數(shù)。

其中CVc為核心種質(zhì)庫性狀的變異系數(shù),CVi是原始群體的變異系數(shù),n是性狀總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝形狀的遺傳多樣性分析

70份黃花苜蓿種質(zhì)資源各性狀變異系數(shù)范圍為14.23%～34.66%,平均變異系數(shù)為24.05%(表1)。其中,單枝花序數(shù)的變異系數(shù)最大為34.66%,變異幅度為8.0～32.0個(gè),葉長的變異系數(shù)最小為14.23%,變異幅度為4.94～15.80 mm。19個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)分布在1.459 8～2.051 3之間,平均遺傳多樣性指數(shù)為1.924 6,遺傳多樣性指數(shù)最高的為葉寬2.051 3,最低的為單莢種子數(shù)1.459 8。材料具有較大的變異幅度、較高的遺傳多樣性,因此,本研究所選種質(zhì)資源間的遺傳差異大,資源類型豐富,利于特異種質(zhì)的篩選和核心種質(zhì)的抽提。

2.2 主要農(nóng)藝性狀主成分分析

對(duì)19個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析,提取到特征值大于1的主成分6個(gè),累計(jì)貢獻(xiàn)率為74.131%,反映出表型性狀的變異存在多向性,主成分的特征值分別為3.393,2.136,1.936,1.787,1.288,1.206,包含了19個(gè)主要農(nóng)藝性狀的絕大部分信息,表明這5個(gè)主成分能夠反映所調(diào)查性狀的基本特征(表2)。

其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為21.096%,其中株高、單枝花序數(shù)、花序長、花序?qū)捄蛦涡蛐』〝?shù)的特征向量絕對(duì)值較高,表明第1主成分主要反映花部性狀特征;第2主成分的貢獻(xiàn)率為14.856%,其中葉長、葉寬、葉面積的特征向量絕對(duì)值較大,表明第2主成分反映葉片性狀特征;第3主成分貢獻(xiàn)率11.24%,其中小花長、種子長、種子寬的特征向量絕對(duì)值較大,三者屬于結(jié)實(shí)特征因子;第4主成分貢獻(xiàn)率10.19%,其中種子寬和種子厚特征向量絕對(duì)值最高,二者為果實(shí)特征因子;第5主成分貢獻(xiàn)率9.404%,單莢種子數(shù)特征向量絕對(duì)值最高,此為種子產(chǎn)量特征因子;第6主成分貢獻(xiàn)率7.345%,莢長和莢厚特征向量絕對(duì)值相對(duì)較高,二者可稱為莢果特征因子。

表1 黃花苜蓿種質(zhì)資源性狀的一般性描述及變異情況Table 1 General description and variation of traits of Medicago falcata L. germplasm resources

表2 黃花苜蓿種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀的主成分分析Table 2 Principal component analysis of major agronomic traits of M. falcata L.germplasm resources

2.3 構(gòu)建核心種質(zhì)的取樣策略

3種取樣策略和5取樣比例中,所得種質(zhì)資源庫的均值差異百分率均低于20%,極差符合率均大于80%[26-28];通過比較變異系數(shù)變化百分率(表3),位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略明顯優(yōu)于其他兩種取樣策略,在位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略中,取樣比例為30%時(shí),所得種子資源庫最優(yōu);使用離差平方和法進(jìn)行聚類,遺傳距離為歐氏距離,取樣策略為位點(diǎn)優(yōu)先取樣,取樣比例為30%時(shí),構(gòu)建的核心種質(zhì)能夠較好的保留原始種質(zhì)的表型性狀并有效降低遺傳冗余度。通過上述最優(yōu)方法選擇出初級(jí)核心種質(zhì)19份。

倍性檢驗(yàn)共得到68份四倍體材料,1份二倍體材料和1份復(fù)合體材料,由于二倍體和復(fù)合體材料相對(duì)稀少,故將二者編入核心種質(zhì)中,得出核心種質(zhì)共21份,如表4所示。

表3 不同策略取樣的種質(zhì)資源與原種質(zhì)性狀差異Table 3 Trait differences between germplasm resources sampled by different strategies and the original germplasm

表4 核心種質(zhì)來源及倍性信息Table 4 Source and ploidy information of core germplasm

2.4 核心種質(zhì)代表性的評(píng)價(jià)

核心種質(zhì)的均值差異百分率(MD%)為0.00%,各性狀均不存在顯著差異;各性狀的極差符合率(CR%)為97.14%,表明核心種質(zhì)保留了原始群體中的特殊種質(zhì);各性狀指標(biāo)的變異系數(shù)變化率(VR%)為115.87%,變異系數(shù)均高于原始群體,表明核心種質(zhì)具有良好的異質(zhì)性;各項(xiàng)指標(biāo)方差差異百分率(VD%)為5.26%,除株高、莖節(jié)數(shù)、莢長、莢寬、莢厚、單莢種子數(shù)外,其余方差顯著高于原始群體,表明核心種質(zhì)獲得了較大的變異(表5)。

表6所示,利用主成分分析對(duì)21份黃花苜蓿核心種質(zhì)資源與原種質(zhì)資源比較分析,二者均有6個(gè)主成分特征值大于1,包含各性狀74%以上的遺傳多樣性信息,并且二者累計(jì)貢獻(xiàn)率差異不明顯,也證明所構(gòu)建的核心種質(zhì)資源代表性和可靠性較高。

表5 原始種質(zhì)與核心種質(zhì)間P值的比較Table 5 Comparison of P values between original germplasm and core germplasm

表6 原種質(zhì)資源與核心種質(zhì)資源主成分比較Table 6 Comparison of principal components of original germplasm resources and core germplasm resources

3 討論

表型性狀差異是遺傳多樣性最直觀的表現(xiàn),基于表型進(jìn)行遺傳多樣性分析,能夠直觀展示種質(zhì)資源群體的遺傳結(jié)構(gòu),有助于種子的選擇和利用[25]。一般建立核心種質(zhì)資源庫步驟為：數(shù)據(jù)的收集整理,對(duì)收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分組,種質(zhì)的抽樣,核心種質(zhì)確定及有效性檢驗(yàn),即首先通過對(duì)收集材料進(jìn)行分組,在組內(nèi)通過合適的抽樣策略和抽樣比例篩選核心種質(zhì),通過一定的統(tǒng)計(jì)參數(shù)檢驗(yàn)核心種質(zhì)庫的代表性[29-30]。

黃花苜蓿在抗旱、耐鹽堿、抗寒等方面均有相應(yīng)的研究[31-34],新疆具有豐富的野生黃花苜蓿資源,但是開展的研究卻很少,主要因?yàn)樾陆鶈T遼闊,黃花苜蓿未進(jìn)行系統(tǒng)化的收集整理工作,無法高效的對(duì)其進(jìn)行開展研究。本研究基于70份新疆野生黃花苜蓿種質(zhì)資源的19個(gè)表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)材料的變異系數(shù)高于10%,則樣本間差異顯著[35-37],本研究中19個(gè)性狀的變異系數(shù)均大于10%,性狀之間差異明顯;多樣性指數(shù)能反映遺傳多樣性的豐富度,遺傳多樣性指數(shù)越高,則表明性狀多樣性豐富度越高[37],研究中19個(gè)性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)為1.9246,遺傳多樣性指數(shù)較高,表明所選用的材料具有較高的離散程度,資源類型豐富。

按照MD%≤20%、CR%≥80%原則,VR%和CR%越大就越能夠代表原種質(zhì)群體的遺傳多樣性[26-28],本研究抽取的核心種質(zhì)MD%=0.00%,CR%=97.14%符合上述原則,且VR%=115.87%,說明所選核心種質(zhì)能夠基本上代表全部種質(zhì)資源的遺傳多樣性。通過主成分分析比較核心種質(zhì)與原種質(zhì)資源的累計(jì)貢獻(xiàn)率,發(fā)現(xiàn)二者的累計(jì)貢獻(xiàn)率均大于74%,也從另一方面也說明所篩選的核心種質(zhì)具有一定的代表性。

目前,遺傳多樣性分析和主成分分析等方法已成為分析種質(zhì)資源表型多樣性的常用手段,被廣泛應(yīng)用在種質(zhì)資源的鑒定和評(píng)價(jià)中[38]。本研究的不足之處在于僅對(duì)材料樣本的表型性狀進(jìn)行了研究,形態(tài)學(xué)指標(biāo)具有局限性,如環(huán)境變化可能會(huì)導(dǎo)致材料形態(tài)發(fā)生變化,后續(xù)應(yīng)結(jié)合分子層面的相應(yīng)技術(shù)手段,多方面多層次的對(duì)新疆野生黃花苜蓿種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定,從而提高鑒定的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究中通過表型性狀的遺傳多樣性和倍性檢驗(yàn)手段構(gòu)建了新疆野生黃花苜蓿的核心種質(zhì),共篩選21份核心種質(zhì),為后續(xù)的相關(guān)研究人才提供快速的檢索取樣方式,簡化了育種工作繁瑣的前期準(zhǔn)備工作,為提高育種工作效率提供一定的理論支持。