龍葵提取物對大腸桿菌、糞腸球菌及其生物膜形成的抑制作用

郭航帆， 王萍，2， 王穎

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)森林食品資源利用重點實驗室，哈爾濱 150040；3.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院科研處，哈爾濱 150038）

龍葵（Solanum nigrumL.）別名黑天天、苦葵等，為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）1 年生草本植物，始載于《唐本草》，應(yīng)用歷史悠久，歷代本草均有記載[1]。龍葵提取物中含有豐富的活性物質(zhì)如甾醇、生物堿、皂苷、黃酮[2]、萜類、蒽醌[3]等，具有較好的生物活性。我國常見的龍葵有黑果龍葵、紅果龍葵和黃果龍葵，據(jù)報道，黑果龍葵（Solanum nigrumLinnaeus）提取物具有保肝[4]、緩解胃潰瘍[5]等作用，可以對MCF-7 乳腺癌細胞產(chǎn)生毒性[6]、抑制枯草芽孢桿菌生長[7]、抑制小鼠急性耳水腫炎癥[8]；紅果龍葵[Solanum villosumMiller.或Solanum alatumMoench（東歐）][9]提取物具有保肝作用[10]；黃果龍葵（Solanum diphyllumLinnaeus）提取物具有降糖、抗氧化等作用[11]。

生物膜是相互連接或附著在基質(zhì)表面的微生物細胞群落[12]，可避免宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫并阻礙抗生素進入致病菌細胞[13]，可使其耐藥性增加10~1 000倍[14]。細菌自聚集性、泳動性、疏水性與生物膜形成密切相關(guān)。生物膜的形成始于細胞的自聚集，細胞從浮游狀態(tài)通過單細胞泳動、多細胞群集運動轉(zhuǎn)變?yōu)楸砻娓街鵂顟B(tài)形成細胞團，經(jīng)細菌表面疏水性非特異性地黏附到各種基質(zhì)表面，形成生物膜[15-16]。大量研究證明，植物提取物具有抑制細菌生長繁殖和生物膜形成的特性，主要是由于植物提取物含有萜類、皂苷、生物堿等生物活性成分[17]。

響應(yīng)面分析法是通過回歸方程確定最優(yōu)工藝參數(shù)的統(tǒng)計方法，可評價因素之間的相互作用，具有試驗周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點[18]。植物源抑菌劑常用提取方法有溶劑萃取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法等，其中超聲輔助提取法、微波輔助提取法和超臨界CO2萃取法需要特殊設(shè)備[19]，故本研究選擇操作簡單、條件易控制的溶劑萃取法提取龍葵提取物，對比3 種龍葵果及其莖葉提取物對常見致病菌大腸桿菌、糞腸球菌的抑制作用，確定具有最佳抑菌效果的部位并采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其提取工藝，研究該提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成的影響，為合理利用野生植物資源、緩解抗生素研發(fā)壓力帶來新的啟示。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

龍葵采自黑龍江省哈爾濱市郊區(qū)田間；供試菌 種 大 腸 桿 菌（Escherichia coli）、糞 腸 球 菌（Enterococcus faecalis）由東北林業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供；牛肉膏、蛋白胨和瓊脂粉購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉等化學(xué)試劑均為分析純，購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-2D 雙人無菌操作臺，上海尚道儀器制造有限公司；PC722s 分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；303-00A 電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津天泰儀器有限公司；YXQ-LS-18SI 手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FD-1A-80 冷凍干燥機，上海比朗儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-DIII 循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 龍葵不同部位提取物制備

黑果龍葵、黃果龍葵和紅果龍葵的莖葉于陰涼處晾干，粉碎，過60目篩；選取成熟新鮮的黑果龍葵、黃果龍葵和紅果龍葵果，清洗、瀝干水分，儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。?0%乙醇以液料比（mL·g-1）10∶1 將龍葵莖葉細粉及搗碎的龍葵果在20 ℃下浸提6 h，真空抽濾，濾液在60 ℃下真空濃縮至15 mL，冷凍干燥，所制備的黑果龍葵果提取物（SNF）、黑果龍葵莖葉提取物（SNS）、黃果龍葵果提取物（SDF）、黃果龍葵莖葉提取物（SDS）、紅果龍葵果提取物（SVF）、紅果龍葵莖葉提取物（SVS）儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 龍葵提取物抑菌試驗

1.3.1 抑菌效果評價 參考張弘弛等[20]的方法并進行改進。無菌條件下用生理鹽水配制0.5 麥氏菌懸液。在96 孔板中依次加入100 μL 液體培養(yǎng)基、10 μL 菌懸液、50 μL 200 mg·mL-1提取物或50 μL 20 μg·mL-1環(huán)丙沙星，以不加提取物為空白對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。在600 nm 波長下測定吸光值，按公式（1）計算抑菌率（Y）。

式中，X1為空白組在600 nm 波長下的吸光值；X2為試驗組在600 nm波長下的吸光值。

1.3.2 最小抑菌濃度測定 參考Moura等[21]的方法并改進。將龍葵提取物配制為12.5~200.0 mg·mL-1溶液，在96 孔板中依次加入100 μL 液體培養(yǎng)基、10 μL 菌懸液、50 μL 提取物，37 ℃培養(yǎng)12 h，600 nm 波長下測定吸光值。生長未能發(fā)生的最小濃度作為龍葵提取物的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.4 龍葵提取物活性成分定性

通過標準方法對不同龍葵不同部位提取物活性成分進行定性分析，以確定提取物中是否存在單寧、皂苷、蒽醌、甾醇、黃酮、萜類、生物堿[22]。①單寧，提取物中加入幾滴1%的FeCl3，產(chǎn)生深綠色為陽性。②皂苷，向提取物中加入5 mL 蒸餾水劇烈振搖，產(chǎn)生泡沫持續(xù)10 min 則為陽性。③蒽醌，提取物中加入5 mL 氯仿，搖勻過濾，濾液加等量10% 氨水，氨化層出現(xiàn)紅色則為陽性。④甾醇，取2 mL 提取物溶液，加入2 mL 濃硫酸，產(chǎn)生紅色沉淀表示試驗呈陽性。⑤黃酮，少量提取物溶于2 mL 甲醇，加入少量鎂屑，再加入少量濃鹽酸，產(chǎn)生紅色為陽性。⑥萜類，少量提取物加入2 mL 氯仿和3mL 濃硫酸，產(chǎn)生1 層棕紅色界面則為陽性。⑦生物堿，取3 mL 提取物加入5 mL 1%的鹽酸，加熱攪拌過濾，等分成2 份，分別加入少 量Wanger’s 試 劑（碘- 碘 化 鉀 試 劑）和Dragendorff’s 試劑（碘化鉍鉀試劑），分別產(chǎn)生紅棕色沉淀和橙色沉則為陽性。

1.5 龍葵果提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗 以黑果龍葵鮮果為原料，以乙醇含量40%、液料比（mL·g-1）10∶1、提取溫度20 ℃、提取時間1 h 為固定水平，按照1.3 的試驗方法考察乙醇含量（30%、35%、40%、45%、50%、55%）、液料比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1）、提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）對龍葵提取物抑菌能力的影響。

1.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 設(shè)計，以抑菌率為響應(yīng)值，對提取影響因素進行優(yōu)化，自變量因素水平及編碼如表1所示。

表1 因素水平編碼Table 1 Factors and levels in the experimental design

1.6 大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成能力測定

參照李程程[23]的24 孔板法通過結(jié)晶紫對生物膜染色以研究黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成的影響。在含不同水平提取物（12、30 mg·mL-1）的液體培養(yǎng)基中接種1% 的0.5 麥氏菌懸液，以不加提取物為空白對照，37 ℃培養(yǎng)，無菌水除去游離細胞。用0.3%結(jié)晶紫溶液染色10 min，無菌水除去多余染料，靜置晾干后用1 mL 95%乙醇溶解結(jié)晶紫。將溶劑轉(zhuǎn)移至干凈的96孔板中，595 nm處測定吸光值。

1.7 影響大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成因素

1.7.1 細菌泳動性的測定 參考Magnini 等[24]方法并進行改進。配制0.3%半固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入不同含量（12.5、25.0 mg·mL-1）的龍葵提取物，以不加提取物為對照，接種2 μL 0.5 麥氏菌懸液于平板中心，37 ℃培養(yǎng)12 h，測量細菌運動區(qū)域。

1.7.2 細菌表面疏水性的測定 參考Salaheen等[25]方法并進行改進。配制不同水平（12.5、25.0、50.0、100.0 mg·mL-1）的龍葵提取物液體培養(yǎng)基，加入100 μL 0.5 麥氏菌懸液，以不加提取物為對照，37 ℃培養(yǎng)12 h。將菌懸液5 000 r·min-1離心15 min，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.2）沖洗沉淀，加入1 mL十六烷分離兩相，測量下層水相600 nm吸光值，按公式（2）計算細菌細胞表面疏水性（H）。

1.7.3 細菌自聚集性的測定 參考Salaheen等[25]方法并進行改進。配制不同水平（12.5、25.0 mg·mL-1）的龍葵提取物液體培養(yǎng)基，加入100 μL 0.5 麥氏菌懸液，以不加提取物為對照，37 ℃培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)物5 000 r·min-1離心15 min，用0.01 mol·L-1PBS（pH 7.2）重懸沉淀，600 nm 波長下測定吸光值，記為ODt0。將菌懸液在37 ℃培養(yǎng)2 h，測定吸光值，記為ODt2，按公式（3）計算細菌自聚集性（A）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±SD 表示，采用SPSS 26.0 進行顯著性分析，以P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。通過Design Expert 10 進行響應(yīng)面設(shè)計及分析。采用Origin2021完成繪圖及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種龍葵不同部位提取物抑菌能力比較分析

龍葵不同部位提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生長的影響如圖1 所示，200 mg·mL-1龍葵果及莖葉提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生長均有抑制能力，但均著性（P<0.05）低于抗生素環(huán)丙沙星。其中，SNF對大腸桿菌、糞腸球菌生長的抑制能力最強，抑制率分別為72.97%±1.73%、87.25%±0.16%；其次為SDF、SVF。與果實提取物相比，莖葉提取物抑菌能力較弱，其中SNS對大腸桿菌、糞腸球菌生長的抑菌率最高，抑菌率分別為55.49%±1.32%、55.61%±2.27%。故選擇黑果龍葵果進行提取條件優(yōu)化。

2.2 龍葵提取物活性成分定性分析

由表2 可知，6 種龍葵提取物中均含有單寧、皂苷、甾醇、黃酮、萜類、生物堿，不含蒽醌。其中，龍葵果提取物中皂苷、萜類含量比莖葉提取物含量高，與其抑菌效果相呼應(yīng)。

表2 龍葵提取物活性成分Table 2 Phytochemical screening of Solanum nigrumL. extract

2.3 黑果龍葵果提取物單因素試驗結(jié)果分析

從圖2 可知，隨著乙醇含量的增加，黑果龍葵果提取物抑菌率先增大后減小，當(dāng)乙醇含量為45%時，抑菌率最高，對大腸桿菌和糞腸球菌的抑制率分別為76.01%±0.70%、83.50%±3.92%，具有較強的抑菌能力。當(dāng)液料比（mL·g-1）為5∶1 時，抑菌率最大，對大腸桿菌、糞腸球菌的抑制率分別為74.47%±1.00%、78.29%±1.47%，且與其他液料比差異顯著。在30 ℃下浸提，抑菌率最高，對大腸肝菌、糞腸球菌的抑制率分別為71.98%±3.49%、84.85%±0.64%，當(dāng)提取溫度高于30 ℃后，隨著溫度升高抑菌率降低。綜上，選擇乙醇含量40%~50%，提取溫度20~40 ℃，液料比（mL·g-1）4∶1~6∶1進行響應(yīng)面試驗。

圖2 單因素試驗結(jié)果Fig. 2 Results of single factor experiments

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.4.1 回歸模型與方差分析 利用Design-Expert 10 軟件對提取溫度、乙醇含量、液料比進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Programs and experiment results of the Box-Behnken design

通過對表3 試驗數(shù)據(jù)進行擬合，可得到大腸桿菌（Y1）、糞腸球菌（Y2）分別以抑制率為響應(yīng)值的模擬方程。

大腸桿菌、糞腸球菌抑菌率回歸模型與方差分析如表4、表5 所示。由表4 可知，大腸桿菌抑菌率二次回歸模型P<0.000 1，表明該模型達到極顯著水平；失擬項P>0.05，表明該模型未產(chǎn)生失擬現(xiàn)象；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.975 9，說明擬合度較好，校正決定系數(shù)R2adj=0.944 9，表明94.49%的響應(yīng)值變化可用該模型來解釋，并且R2和R2adj均接近1，說明模型準確性和通用性較高，可用該模型來分析和預(yù)測各因素對大腸桿菌抑菌率的影響。方差分析表明，乙醇含量對黑果龍葵提取物抑菌具有極顯著影響（P<0.01），液料比對黑果龍葵提取物抑菌具有顯著影響（P<0.05），提取溫度對提取物的抑菌作用無顯著差異。

表4 大腸桿菌抑制率回歸模型與方差分析Table 4 ANOVA of the regression equation model of Escherichia coli inhibition rate

表5 糞腸球菌抑菌率回歸模型與方差分析Table 5 ANOVA of the regression equation model of Enterococcus faecalis inhibition rate

由表5 可知，糞腸球菌抑菌率二次回歸模型P<0.000 1，表明該模型達到極顯著水平；失擬項P>0.05，表明該模型未產(chǎn)生失擬現(xiàn)象；模型相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，說明擬合度較好，校正決定系數(shù)=0.991 1，表明99.11%的響應(yīng)值變化可用該模型來解釋，并且R2和R2adj均接近1，說明模型準確性和通用性較高，可用該模型來分析和預(yù)測提取因素對糞腸球菌抑菌率的影響。方差分析表明，乙醇含量、液料比對龍葵提取物抑制糞腸球菌活性具有極顯著（P<0.01）影響。比較F值可知，乙醇含量對龍葵提取物抑菌影響最大，其次為液料比、提取溫度。

2.4.2 響應(yīng)面分析 各因素交互作用對大腸桿菌、糞腸球菌抑菌率影響如圖3、圖4所示。通過響應(yīng)面坡度陡峭程度（圖3）可知，乙醇含量對黑果龍葵抑制大腸桿菌生長影響最大，其次為液料比、提取溫度；當(dāng)提取溫度為28.08 ℃、乙醇含量為44.46%、液料比（mL·g-1）為5.13∶1.00時，黑果龍葵果提取物對大腸桿菌抑制率達到理論最高，為79.66%。

圖3 各因素交互作用下大腸桿菌的抑菌率Fig. 3 Inhibition rate of Escherichia coliunderinteraction of various factors

圖4 各因素交互作用下糞腸球菌的抑菌率Fig. 4 Inhibition rate of Enterococcus faecalis underinteraction of various factors

由圖4 可知，乙醇含量對黑果龍葵抑制糞腸球菌生長影響最大，其次為液料比、提取溫度；當(dāng)提取溫度為29.55 ℃，乙醇含量為44.65%，液料比（mL·g-1）為5.07∶1.00 時，黑果龍葵果提取物對糞腸球菌抑制率達到理論最高，為89.00%。

2.5 最佳工藝條件驗證

為驗證最佳提取工藝，結(jié)合實際操作可行性，分別在提取溫度為28 ℃、乙醇含量為44.5%、液料比（mL·g-1）為5.1∶1.0 以及提取溫度為29.5 ℃，乙醇含量為44.7%，液料比（mL·g-1）為5.1∶1.0 條件下對大腸桿菌與糞腸球菌進行模型驗證試驗，此時龍葵提取物對2 種菌的生長抑制率分別為81.44%±1.78%、90.63%±2.33%，與理論值相近，說明該模型可靠，可有效預(yù)測黑果龍葵果提取物對大腸桿菌與糞腸球菌的生長抑制率。在此條件下，黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌最小抑菌質(zhì)量濃度均為50 mg·mL-1。

2.6 黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成的影響

生物膜在培養(yǎng)基與空氣交界處形成，保護細菌免受外部脅迫[26]，不易被沖洗。從圖5 可知，提取優(yōu)化后的黑果龍葵提取物能夠有效抑制大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成，培養(yǎng)時間相同時，OD值隨提取物含量升高而降低，表明黑果龍葵果提取物劑量依賴性抑制了大腸桿菌、糞腸球菌生物膜的形成，培養(yǎng)48 h 后，30.0 mg·mL-1提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生物膜形成抑制率分別可達83.52%、85.13%。30.0 mg·mL-1提取物培養(yǎng)大腸桿菌、糞腸球菌48 h后，對生物膜形成的抑制比培養(yǎng)6 h 僅提高10.42%、2.74%，可知隨著培養(yǎng)時間增加，提取物抑制細菌生物膜形成能力減弱。

圖5 黑果龍葵果提取物對細菌生物膜形成的影響Fig. 5 Effect of Solanum nigrum L. fruit extracts on bacterial biofilm formation

2.7 黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌表面疏水性的影響

細菌表面疏水性與生物膜形成密切相關(guān)，表面疏水性越低，黏附性越差，生物膜形成能力越弱[27]。由圖6 可知，優(yōu)化后的黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌表面疏水性均有影響，大腸桿菌、糞腸球菌表面疏水性隨著提取物含量升高而降低，當(dāng)提取物含量為100.0 mg·mL-1時，大腸桿菌、糞腸球菌表面疏水性分別為48.65%±0.75%、43.81%±1.07%。進一步表明龍葵果提取物可抑制生物膜形成。

圖6 黑果龍葵果提取物對細菌表面疏水性的影響Fig. 6 Effect of Solanum nigrum L. fruit extracts on hydrophobicity

2.8 黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌泳動性的影響

由圖7 可知，黑果龍葵果提取物能夠有效抑制細菌泳動，阻礙細菌遷移，并呈現(xiàn)劑量依賴性。加入25.0 mg·mL-1龍葵果提取物后，大腸桿菌、糞腸球菌菌落泳動直徑分別為（8.37±0.12） mm、（10.06±0.15）mm，與 對 照 組 相 比 抑 制 率 可 達45.39%、46.28%，具有顯著性差異（P<0.05）。

圖7 黑果龍葵果提取物對細菌泳動性的影響Fig. 7 Effect of Solanum nigrum L. fruit extracts on swimming

2.9 黑果龍葵果提取物對大腸桿菌、糞腸球菌自聚集性的影響

細菌自聚集性被廣泛用于評估其黏附能力和生物膜形成能力[28]。細菌自聚集性越強，定殖能力越強，黏附性、生物膜形成能力越強[29]。從圖8 可知，大腸桿菌、糞腸球菌自聚集性均受到黑果龍葵果提取物的抑制，并隨著提取物含量增大自聚集性降低。經(jīng)25.0 mg·mL-1龍葵果提取物培養(yǎng)后，大腸桿菌、糞腸球菌自聚集性分別降低6.1%、8.4%。

圖8 黑果龍葵果提取物對細菌自聚集性的影響Fig. 8 Effect of Solanum nigrumL. fruit extracts on auto-aggregation

2.10 生物膜形成能力與影響因素相關(guān)性分析

大腸桿菌、糞腸球菌泳動性、表面疏水性、自聚集性與生物膜形成的相關(guān)性分析如圖9、圖10所示。細菌泳動性、疏水性、自聚集性均可影響生物膜形成，相關(guān)性越大對應(yīng)在相關(guān)性分析圖中橢圓越扁。從圖9、圖10可知，大腸桿菌生物膜形成能力與細菌疏水性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），糞腸球菌生物膜形成能力與細菌泳動性、自聚集性呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。并且對于泳動性、自聚集性而言，大腸桿菌、糞腸球菌均具有顯著的相關(guān)性（P<0.05），可能由于菌毛運動被抑制，細菌運動性下降，從而影響菌落聚集，影響了生物膜的形成[30]。

圖9 大腸桿菌生物膜形成能力與細菌理化性質(zhì)相關(guān)性分析Fig. 9 Correlation analysis between biofilm formation ability and physicochemical properties of Escherichia coli

圖10 糞腸球菌生物膜形成能力與細菌理化性質(zhì)相關(guān)性分析Fig. 10 Correlation analysis between biofilm formation ability and physicochemical properties of Enterococcus faecalis

3 討 論

本研究比較了黑果龍葵、黃果龍葵、紅果龍葵果及其莖葉提取物的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)3 種龍葵果及其莖葉提取物對大腸桿菌、糞腸球菌生長均有抑制能力，并且果實提取物抑菌效果優(yōu)于莖葉提取物，可能與果實中含有較多的活性物質(zhì)有關(guān)，果實為生殖器官，聚集著許多抑菌活性物質(zhì)，而莖主要起輸導(dǎo)作用，不利于大量活性物質(zhì)儲存[31]。對常見抑菌活性物質(zhì)初篩發(fā)現(xiàn)，果實提取物中儲存有較高含量的皂苷與萜類，但仍需進一步確定龍葵提取物中抑制大腸桿菌、糞腸球菌生長的主要活性物質(zhì)。本研究中，黑果龍葵提取物對大腸桿菌、糞腸球菌的抑菌效果優(yōu)于黃果龍葵、紅果龍葵提取物，可能與其活性物質(zhì)含量不同有關(guān)，可進一步對3種龍葵進行成分比較。

本研究發(fā)現(xiàn)，3 種龍葵的提取物對革蘭氏陽性菌抑菌效果均優(yōu)于對革蘭氏陰性菌，與姜雪琪等[32]的研究結(jié)果相似，革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出對龍葵提取物更強的敏感性。從活性物質(zhì)分析，龍葵提取物中萜類等抑菌活性物質(zhì)較為豐富，而萜類物質(zhì)已被報道對革蘭氏陽性菌抑制作用較革蘭氏陰性菌更強[33]。從細菌結(jié)構(gòu)分析，革蘭氏陰性菌細胞壁成分復(fù)雜，由肽聚糖和脂多糖外膜組成，很難被外部因素破壞[34]，并且?guī)в袕娯撾姾傻母锾m氏陰性細菌的外膜可以控制某些物質(zhì)的進出[35]；革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸組成，可滲透可溶性糖、氨基酸和大多數(shù)離子[36]，故革蘭氏陰性菌對龍葵提取物不如革蘭氏陽性菌敏感。后續(xù)可對龍葵提取物抑制大腸桿菌、糞腸球菌生長途徑、機制進行深入研究。

細菌理化性質(zhì)（自聚集性、泳動性、疏水性）與生物膜形成密切相關(guān)。本研究中，黑果龍葵果提取物降低了大腸桿菌、糞腸球菌表面疏水性、泳動性、自聚集性，致使一部分細菌無法從浮游的單細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦街鵂顟B(tài)的細胞團，減弱了細菌的黏附能力，影響了生物膜形成。但由于大腸桿菌、糞腸球菌表面結(jié)構(gòu)不同，提取物對自聚集性、泳動性、疏水性的影響產(chǎn)生差異[37]。本研究中大腸桿菌生物膜形成能力與細菌疏水性顯著正相關(guān)，可能是因為疏水性與細菌表面的蛋白和多糖有關(guān)，而革蘭氏陰性菌較革蘭氏陽性菌多了1 層由脂多糖、脂蛋白、膜孔蛋白等物質(zhì)組成[38-39]的外膜，故革蘭氏陰性菌表面疏水性更易受到影響。Song等[40]關(guān)于葡萄柚籽提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌表面疏水性的研究也證實了這一結(jié)論。而在泳動性方面，本研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌生物膜形成能力與泳動性顯著正相關(guān)，可能是因為糞腸球菌的泳動與其Ebp 菌毛有關(guān)，在生物膜早期形成中起重要作用[41-42]。在Liu 等[43]研究中，百里香精油就是通過抑制Ebp 菌毛基因ebpABC下調(diào)而抑制糞腸球菌泳動性，進而影響?zhàn)じ?，抑制了生物膜的形成。綜上，黑果龍葵果提取物可通過改變細菌自身性質(zhì)，影響細菌生物膜形成，結(jié)果為改善大腸桿菌、糞腸球菌耐藥性研究奠定基礎(chǔ)。