牦牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及孤雌發(fā)育研究

王立斌， 王強(qiáng)龍， 潘陽陽， 趙天， 丁天翊， 崔燕， 余四九

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070）

卵母細(xì)胞質(zhì)量與孤雌激活胚胎發(fā)育潛能之間的關(guān)系是研究的焦點(diǎn)，人工激活孤雌生殖的的研究相繼在小鼠[1]、兔[2]、羊[3]、豬[4]、牛[5]以及猴子[6]等動物中開展[7]。1999 年，Sun 等[8]證實(shí)了卵母細(xì)胞在體外發(fā)育到MⅡ中期會停滯，直到受精或激活才會進(jìn)一步發(fā)育，高水平的成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）和細(xì)胞靜止因子(cytostatic factor，CSF)共同維持MⅡ期的卵母細(xì)胞，當(dāng)卵母細(xì)胞受精或受到外界刺激，胞內(nèi)Ca2+呈多次有規(guī)律的升高，破壞了MPF 和CSF 的平衡，從而引發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)。

卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中核質(zhì)成熟不同步是制約后續(xù)胚胎發(fā)育的瓶頸，通過體外模擬卵泡液的微環(huán)境使卵母細(xì)胞生長發(fā)育最終具有受精能力是體外胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。但是，卵母細(xì)胞從成熟到發(fā)育為早期胚胎涉及復(fù)雜的生物學(xué)過程，任何異常因素的干擾都會導(dǎo)致其減數(shù)分裂停滯和受精失敗[9-10]。研究表明，體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育潛力均低于動物體內(nèi)，這也表明體外培養(yǎng)體系與動物體生理內(nèi)環(huán)境差距較大，其培養(yǎng)體系、培養(yǎng)方式仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

孤雌激活屬于無性生殖的范疇，可以實(shí)現(xiàn)無雄性參與誘導(dǎo)卵母細(xì)胞激活分裂和發(fā)育[9]，通過不同的物理（電激活）或化學(xué)方法[（氯化鍶、乙醇、離子霉素與6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）]對卵母細(xì)胞進(jìn)行激活，最終使停滯在MⅡ期的卵母細(xì)胞完成第二次減數(shù)分裂，并抑制第二極體排出，從而產(chǎn)生正常二倍體的胚胎[11]。研究卵母細(xì)胞孤雌激活及后續(xù)胚胎的發(fā)育過程，對于深度認(rèn)識生命的起始、個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、核移植、胚胎移植以及動物克隆等具有重要的參考意義。迄今為止，有關(guān)鼠、兔、牛、羊、豬、馬和猴的孤雌生殖研究已有報(bào)道，但不同物種或同一物種的不同種系，對孤雌激活的反應(yīng)不同[12]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)間長短對其孤雌激活效率有一定影響，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，可引發(fā)老化卵孤雌發(fā)生，在鼠、兔、牛的相關(guān)研究中，激活率隨卵齡增加而上升[13]，但是體外培養(yǎng)時(shí)間過長卻限制了孤雌激活率，可能是老齡卵母細(xì)胞cyclinB的降解途徑對細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放更為敏感所致。另外，影響卵母細(xì)胞孤雌激活的因素很多，如激活方法、電參數(shù)、激活液種類和含量水平、培養(yǎng)液種類、激活時(shí)間及卵母細(xì)胞采集方法等[14]，對卵母細(xì)胞孤雌激活率、卵裂率及孤雌發(fā)育率有較大影響。受體卵母細(xì)胞的有效激活及發(fā)育能力的研究，是核移植重構(gòu)胚發(fā)育的關(guān)鍵，對提高核移植效率及孤雌胚胎發(fā)育的研究具有重要意義[15]。孤雌激活胚胎作為胚胎學(xué)的研究模型，可以避免倫理道德的約束，為體外胚胎發(fā)育、形態(tài)學(xué)鑒定以及基因分析提供依據(jù)。

牦牛是青藏高原地區(qū)特有的哺乳動物，生活環(huán)境惡劣，繁殖力低下。研究牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)及孤雌激活胚胎發(fā)育，對深入研究牦牛早期胚胎發(fā)育、提升其受胎率等均有重要意義。為探討牦牛卵母細(xì)胞的不同處理方式與后續(xù)孤雌激活胚胎發(fā)育之間的潛在聯(lián)系，本研究比較了卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexs，COCs）和裸卵、TCM199 培養(yǎng)不同時(shí)間以及體外培養(yǎng)12 h的COCs 消化之后再培養(yǎng)對其孤雌激活胚胎發(fā)育的卵裂率、囊胚率的影響，有助于突破四細(xì)胞期發(fā)育阻滯、提高囊胚率、降低卵裂畸形率，可為進(jìn)一步開展牦牛卵母細(xì)胞孤雌激活尋求可靠的激活、培養(yǎng)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

所用主要試劑有TCM199 培養(yǎng)液（Gibco，Grand Island，NY，USA）、G1 胚胎培養(yǎng)液（Gibco，USA)、FBS（foetal bovine serum，HyClone，Uruguay Origin，South America）、杜 氏 磷 酸 鹽 緩 沖 液(dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)(Gibco，USA)、0.1%透明質(zhì)酸酶、離子霉素（Sigma-AIdrich）、6-二甲基氨基嘌呤（Sigma-AIdrich）、細(xì)胞固定液（Gibco，USA)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

所用主要儀器有四孔板（Nunc，Roskilde，Denmark）、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，USA）、倒置顯微鏡（Olympus，Japan）、體視顯微鏡（Olympus，Japan）等。

1.2 卵母細(xì)胞的獲取

于10 月份從青海省西寧市定點(diǎn)屠宰場采集5~8歲健康牦牛的卵巢，置于37 ℃含有雙抗（青霉素、鏈霉素）的生理鹽水中，3~5 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，再清洗3 次。用12號針頭的10 mL 注射器在無菌環(huán)境中自卵巢表面可見卵泡吸取卵泡液，在體視顯微鏡下用自制的撿卵針挑選胞質(zhì)均勻、形態(tài)完好、被卵丘細(xì)胞緊密包裹（≥3 層）的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 COCs 和裸卵的孤雌激活效果檢測 將培養(yǎng)24 h 的COCs 分成兩部分：一部分不做處理；一部分用0.1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的透明質(zhì)酸酶消化，操作過程中用移液器反復(fù)吹打，并觀察卵丘細(xì)胞脫落情況。將兩部分COCs 分別進(jìn)行孤雌激活，體外培養(yǎng)，觀察卵裂情況。

1.3.2 TCM199 不同培養(yǎng)時(shí)間的孤雌激活效果檢測 分別對體外培養(yǎng)24、36 h 的COCs 進(jìn)行篩選，用透明質(zhì)酸酶消化，去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，并用DPBS 清洗，進(jìn)行孤雌激活，體外培養(yǎng)，觀察卵裂情況。

1.3.3 裸卵再培養(yǎng)后孤雌激活效果檢測 對體外培養(yǎng)12 h 的COCs，用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化，去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，并用含有血清的DPBS 清洗，再次移入TCM199 培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行孤雌激活，體外培養(yǎng)，觀察卵裂情況。

1.4 體外培養(yǎng)

挑選表面包裹≥3 層的卵丘細(xì)胞，并且未發(fā)生擴(kuò)張的COCs，用含有1%胎牛血清的DPBS 微滴清洗3 次，移入含有50 μL TCM199 培養(yǎng)液的四孔板，COCs的最終密度為100個(gè)·mL-1。胚胎培養(yǎng)條件為：溫度38.5 ℃、CO2含量5%、濕度100%條件下分別培養(yǎng)24 、36 h，用于后續(xù)孤雌激活。

1.5 消化、篩選

將培養(yǎng)24、36 h 的COCs 用0.1%的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行消化，除去卵母細(xì)胞外面所有的卵丘細(xì)胞，觀察第一極體排出情況。選擇透明帶完整，胞質(zhì)均勻、形態(tài)良好、卵周間隙清晰，具有第一極體的卵母細(xì)胞，用DPBS進(jìn)行清洗。

1.6 牦牛卵母細(xì)胞體外孤雌激活

在培養(yǎng)皿中做50 μL的孤雌激活微滴，分別為5 μmol·L-1離子霉素（ionomycin）和2 mmol·L-16-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP），用石蠟油進(jìn)行覆蓋，移入胚胎培養(yǎng)箱平衡2 h。

使用DPBS 將牦牛卵母細(xì)胞清洗3次，收集成熟的卵母細(xì)胞，使用0.1%的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行消化，隨時(shí)觀察卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的脫離情況。篩選優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞再次清洗，將其在離子霉素微滴中處理5 min，再次清洗，移入6-DMAP 的微滴中4 h，使卵母細(xì)胞激活。

1.7 體外培養(yǎng)

將清洗之后的卵母細(xì)胞移至石蠟油覆蓋的胚胎培養(yǎng)液微滴中，每個(gè)微滴中放20 個(gè)卵母細(xì)胞，置入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)體系為：38.5 ℃、5%CO2和100%濕度，連續(xù)培養(yǎng)1周；培養(yǎng)期間通過體視顯微鏡觀察并記錄卵裂情況，根據(jù)胚胎發(fā)育情況，收取2~4 細(xì)胞、5~8 細(xì)胞、9~16 細(xì)胞期胚胎和囊胚，分別做凍存和固定處理。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 孤雌激活胚胎的體外發(fā)育

對卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)（圖1A), 使用倒置顯微鏡觀察牦牛卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的成熟情況（圖1B、C）。用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化成熟的COCs（圖2），挑選含有第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活（圖3A），早期胚胎發(fā)育良好。挑選形態(tài)較好的2-細(xì)胞期胚胎（孤雌激活后的卵母細(xì)胞一分為二，形成2 個(gè)卵裂球）、4~8 細(xì)胞期胚胎（含4~8 個(gè)細(xì)胞）、8~16 細(xì)胞期胚胎（含8~16 個(gè)細(xì)胞）、桑椹胚(內(nèi)含32 個(gè)左右細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)）和囊胚（內(nèi)部產(chǎn)生囊胚液、出現(xiàn)囊胚腔）（圖3），分別進(jìn)行固定保存。

圖1 牦牛卵母細(xì)胞Fig. 1 Yak oocytes

圖2 透明質(zhì)酸酶消化后的卵母細(xì)胞Fig. 2 Oocytes digested by hyaluronidase

圖3 孤雌激活之后的卵母細(xì)胞不同發(fā)育階段Fig. 3 Different developmental stages of oocytes after parthenogenetic activation

2.2 COCs和裸卵的孤雌激活效果

將成熟的COCs經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶消化之后進(jìn)行孤雌激活，其卵裂率、囊胚率均顯著高于未消化的處理組（表1）。培養(yǎng)7 d 后發(fā)現(xiàn)，COCs 組脫卵丘，表明卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中周圍的卵丘細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子，有助于卵母細(xì)胞成熟，從而影響后期孤雌激活效果。

表1 COCs和裸卵的孤雌激活效果Table 1 Parthenogenetic activation effects of COCs and nude eggs

2.3 TCM199培養(yǎng)時(shí)間對孤雌激活效果的影響

將牦牛卵母細(xì)胞分別培養(yǎng)24、36 h后進(jìn)行孤雌激活，對卵母細(xì)胞成熟率、孤雌胚胎卵裂率、囊胚率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（表2）顯示，培養(yǎng)24 h的COCs，經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化之后進(jìn)行孤雌激活，其成熟率、卵裂率、囊胚率均顯著高于體外培養(yǎng)36 h的處理組。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下牦牛卵母細(xì)胞的成熟和孤雌激活胚胎發(fā)育Table 2 Maturation and parthenogenetic development of yak oocytes under different culture time

表3 裸卵再培養(yǎng)對孤雌激活效果的影響Table 3 Effects of reculture of nude oocytes on parthenogenetic activation

2.4 裸卵再培養(yǎng)對孤雌激活效果的影響

通過對透明質(zhì)酸酶消化之后的卵母細(xì)胞進(jìn)行二次培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)卵母細(xì)胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生貼壁，后續(xù)的試驗(yàn)操作很難進(jìn)行，但經(jīng)過培養(yǎng)并進(jìn)行孤雌激活處理，仍然有個(gè)別早期胚胎形成，最終無法形成囊胚。

3 討論

目前，主要依據(jù)形態(tài)學(xué)（卵裂率、胚胎形態(tài)、細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)等）衡量體外胚胎的發(fā)育潛能[16]。卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟過程中受諸多因素干擾，進(jìn)而影響后期胚胎的發(fā)育及囊胚形成[17]。卵泡中的卵母細(xì)胞和周圍上皮形成COCs，卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞通過縫隙連接與橋粒實(shí)現(xiàn)信號傳導(dǎo)和物質(zhì)交換，二者相互依賴，形成一個(gè)結(jié)構(gòu)功能共同體。研究表明，卵丘細(xì)胞可以合成特殊蛋白，能夠啟動或抑制卵母細(xì)胞成熟[18]。卵母細(xì)胞也能通過分泌細(xì)胞因子影響卵丘透明質(zhì)酸酶的合成并調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，從而解除卵丘-卵母細(xì)胞的連接，促使減數(shù)分裂的重新啟動。卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞成熟的啟動并非具有主導(dǎo)作用，應(yīng)該只有促進(jìn)或抑制的輔助作用。研究表明，卵丘細(xì)胞的生長狀態(tài)與卵母細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)，卵丘細(xì)胞凋亡脫落對卵母細(xì)胞成熟、體外受精以及早期胚胎發(fā)育均有影響[19]。在動物體內(nèi)，促黃體生成素(luteinizing hormone, LH) 刺激卵丘細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖和糖蛋白，并且在卵丘層周圍形成細(xì)胞外基質(zhì)，稱為卵丘擴(kuò)展。擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞形成COCs，可以保護(hù)卵母細(xì)胞免受機(jī)械外力作用，避免卵泡或輸卵管中蛋白酶降解，從而對卵母細(xì)胞起到保護(hù)作用[20]。本研究中，對體外培養(yǎng)24 h的COCs，部分不進(jìn)行消化處理直接孤雌激活，部分消化為裸卵進(jìn)行孤雌激活，未消化的COCs孤雌激活率明顯低于消化之后的COCs，說明卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞阻礙了孤雌激活效果。

Ozils 等[2]最初發(fā)現(xiàn)兔的未成熟卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中逐漸發(fā)育成熟。表明卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間直接影響其成熟度，進(jìn)而對孤雌激活效果有明顯的影響。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞核成熟與胞質(zhì)成熟不同步，而胞質(zhì)成熟與否直接決定胚胎發(fā)育能力[21-22]。不同動物卵母細(xì)胞體外成熟所需時(shí)間不同，一般以18~24 h 為宜，26 h 以后卵母細(xì)胞老化。牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟的最佳時(shí)間為20~24 h[23]，培養(yǎng)時(shí)間少于20 h，卵丘擴(kuò)展不充分，培養(yǎng)時(shí)間超過24 h，卵母細(xì)胞會退化衰老[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h 再進(jìn)行孤雌激活，胚胎發(fā)育能力明顯高于體外培養(yǎng)36 h 的處理組，說明體外培養(yǎng)36 h，會使卵母細(xì)胞老化，同時(shí)出現(xiàn)透明帶硬化。透明帶是包裹卵子的糖蛋白，能保護(hù)卵子和早期胚胎免受外界刺激。離子霉素是一種高效鈣離子載體，通過動員鈣庫釋放Ca2+而 產(chǎn) 生 生 物 學(xué) 作 用[25]。2001 年，Nakagawa等[26]發(fā)現(xiàn)，用離子霉素聯(lián)合6-DMAP 可有效激活卵母細(xì)胞，提高孤雌胚胎發(fā)育率，最后發(fā)育至囊胚。但孤雌胚胎發(fā)育能力很低，通過比較，體外培養(yǎng)24 h的卵母細(xì)胞孤雌胚發(fā)育能力明顯高于體外培養(yǎng)36 h。體外培養(yǎng)12 h 的COCs，卵母細(xì)胞成熟率低，經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化之后，再移入TCM199 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞大多數(shù)發(fā)生貼壁，很難進(jìn)行下一步操作。細(xì)胞貼壁的前提是具備可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子，才能在表面上生長繁殖。本課題組前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的COCs受到污染或卵丘細(xì)胞脫落導(dǎo)致COCs 發(fā)育不充分的情況下，也會有部分貼壁，說明該過程有細(xì)胞貼附因子的生成。而裸卵再培養(yǎng)或許促進(jìn)了相關(guān)因子的合成與分泌。

影響卵母細(xì)胞成熟、孤雌胚胎發(fā)育的因素很多，除以上設(shè)置組別的不同處理方式外，培養(yǎng)基成分的差異也會影響發(fā)育效果，培養(yǎng)皿的材質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及個(gè)人操作手法，都會產(chǎn)生影響。此外，卵母細(xì)胞來源、母牦牛的年齡胎次也會影響體外發(fā)育；卵巢離體時(shí)間在4 h 以內(nèi)為好，但偶爾因交通運(yùn)輸狀況導(dǎo)致卵母細(xì)胞移入培養(yǎng)液的時(shí)間會有所延長，卵母細(xì)胞對外界環(huán)境的變化產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，直接影響后期孤雌激活效果。研究顯示，豬卵巢離體時(shí)間對卵母細(xì)胞體外成熟有影響，其成熟率隨著時(shí)間的延長而降低[26]；牦牛屠宰主要在冬季，樣品運(yùn)輸過程中對溫度的控制非常重要，卵母細(xì)胞中有大量脂肪滴，對溫度的變化十分敏感，卵巢運(yùn)送過程中生理鹽水溫度下降，也會對卵母細(xì)胞后期生長發(fā)育產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢回收溫度影響卵母細(xì)胞體外成熟率，36~39 ℃時(shí)卵裂率為52.3%，25~28 ℃時(shí)卵裂率為49.1%，而14~17 ℃時(shí)卵裂率僅為28.8%[27]。本實(shí)驗(yàn)室獲取卵母細(xì)胞通過注射器抽吸，操作快速方便，但操作過程中會對COCs 的完整性造成破壞[28]。隨著對孤雌胚胎體外培養(yǎng)的深入研究，仍需進(jìn)一步完善卵母細(xì)胞體外成熟的操作方法和培養(yǎng)體系，精確模擬胚胎發(fā)育的外環(huán)境，以期為輔助生殖技術(shù)提供參考。

牦牛卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h 誘導(dǎo)成熟之后，用透明質(zhì)酸酶對其進(jìn)行消化，使卵丘細(xì)胞全部脫落，再進(jìn)行體外孤雌激活，能夠明顯提高孤雌胚胎的體外發(fā)育能力。研究結(jié)果可為牦牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)以及孤雌激活前期處理方式對后續(xù)胚胎發(fā)育質(zhì)量提供參考，為優(yōu)化體外培養(yǎng)模式奠定了基礎(chǔ)。