生物樣品中有毒重金屬的快速檢測與脫除技術(shù)研究進展

吳世豪 董林沛 張云峰* 王繼芬* 趙 鵬 季佳華 李佳宜 吳小軍 王愛華

(1.中國人民公安大學 偵查學院,北京 100038;2.公安部物證鑒定中心,北京 100038)

重金屬具有極強的生物毒性,其進入人體后會抑制酶活性并誘導氧化應(yīng)激,產(chǎn)生強烈的毒害作用。為了及時避免有毒重金屬的危害,亟需探究建立快速、簡便的生物體內(nèi)重金屬檢測與脫除方法。然而常規(guī)的分析手段存在儀器便攜性差、檢測過程復(fù)雜等問題,難以用于現(xiàn)場的快速實時檢驗。基于此,多種針對生物樣品特性的快速定量分析技術(shù)得到了開發(fā)與應(yīng)用。同時,為了實現(xiàn)生物體內(nèi)有毒重金屬的安全與高效脫除,研究人員不斷探索各種藥物的解毒機理,對其脫除能力以及安全性進行了全面系統(tǒng)的評價。

1 有毒重金屬的常見來源

作為重要的自然資源,重金屬在工業(yè)生產(chǎn)和生活實踐中得到了廣泛的應(yīng)用,給人們的生活帶來了極大的便利。然而重金屬難以被生物體降解,能夠通過多種途徑進入人體,對健康造成嚴重危害。在日常生活中,環(huán)境中的重金屬污染物會沿著食物鏈不斷富集并在人體內(nèi)累積;在工業(yè)生產(chǎn)中,鉻、鉛等廣泛使用的重金屬則能夠通過職業(yè)性接觸的方式導致慢性或急性中毒;在刑事司法領(lǐng)域,砷、汞等具有致命生物毒性的物質(zhì)也經(jīng)常出現(xiàn)在投毒、自殺、誤服等案件中。表1對常見有毒重金屬的來源進行了匯總[1],并列舉了世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)準則(第四版)》以及我國GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的水中重金屬離子限量值。

表1 常見有毒重金屬的來源與水中限量值Table 1 Sources and water limits of common toxic heavy metals

2 生物樣品中重金屬的快速檢測

為了實現(xiàn)生物樣品中重金屬的快速檢測,氣相富集、激光燒蝕等固體進樣技術(shù)迅速發(fā)展,與原子吸收光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜等方法實現(xiàn)了聯(lián)用。近年來,隨著電子技術(shù)與半導體材料的發(fā)展,單色聚焦X射線熒光光譜技術(shù)的靈敏度得到了顯著提升,在生物樣品中痕量重金屬的檢測方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。此外,基于新型修飾電極開發(fā)的電化學傳感器在血液、精漿的直接檢測方面也取得了良好的效果,成為重金屬快速檢測領(lǐng)域的研究熱點。

2.1 高分辨率連續(xù)光源原子吸收光譜法

原子吸收光譜法(Atomic absorption spectrometry,AAS)通過分析待測元素基態(tài)原子蒸氣對特征譜線的吸收強度來確定待測元素的含量。為了實現(xiàn)痕量重金屬的快速檢測,可以利用石墨管加熱產(chǎn)生的高溫使樣品全部參與原子化,在提高靈敏度的同時也能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的直接分析。然而由于生物樣品的基體成分較為復(fù)雜,需要針對基質(zhì)效應(yīng)進行校準。對于血液、尿液等液體類生物樣品,通常在稀釋后加入基體改進劑即可有效消除干擾[2-3]。然而對于肝臟等固體生物樣品,存在背景噪音嚴重、難以將樣品引入石墨管等問題。近年來,隨著高分辨率連續(xù)光源原子吸收光譜法(HR-CS-AAS)的發(fā)展,固體進樣技術(shù)有效克服了基體干擾等的限制,在固體樣品的直接分析中展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。如ORANI等[4]建立了HR-CS-ETAAS測定海洋生物樣品中As、Cd、Cu、Ni、Co和Cr等元素的分析方法,使用魚勻漿、龍蝦肝胰腺等基質(zhì)相似的標準物質(zhì)對方法進行校準與驗證,證明了該方法能夠用于固體生物樣品的直接分析。GMEZ-NIETO等[5]同樣基于HR-CS-AAS技術(shù)開發(fā)了一種快速、簡單的微量采樣方法,在固體取樣平臺中將微量樣品引入石墨爐霧化器,從而實現(xiàn)了人體全血樣品以及小鼠肝線粒體懸浮液中鈣含量的快速分析。

2.2 介質(zhì)阻擋放電-原子熒光光譜法

原子熒光光譜法(Atomic fluorescence spectrometry,AFS)根據(jù)原子在輻射能激發(fā)下產(chǎn)生的熒光發(fā)射強度來確定物質(zhì)的含量。由于光譜干擾極小,原子熒光光譜儀可在無需分光系統(tǒng)的條件下進行元素檢測。此外,介質(zhì)阻擋放電反應(yīng)器(DBD)的應(yīng)用也簡化了樣品的前處理過程,促進了儀器往小型化、便攜化的方向發(fā)展。在生物樣品分析中,AFS法主要用于砷、汞、鉛等元素的測定。如LIU等[6]對微生物以及頭發(fā)樣品的研磨液進行簡單稀釋后使用DBD對砷元素進行預(yù)濃縮,而后使用懸浮進樣-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法實現(xiàn)了砷的快速、超靈敏檢測。然而AFS法的缺點在于應(yīng)用范圍不夠廣,僅能檢測As、Sb、Hg等11種具有熒光發(fā)射的元素[7]。因此,原子熒光光譜技術(shù)在重金屬檢測中的推廣和應(yīng)用仍然是分析人員研究的熱點。

2.3 激光燒蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)具有靈敏度高、抗干擾性強等顯著優(yōu)勢,在檢測復(fù)雜生物基質(zhì)中的重金屬時得到了最為廣泛的應(yīng)用。如MCGEEHAN等[8]使用ICP-MS對雞肉干、牛肝等樣品中的重金屬進行檢測,通過比較4個實驗室內(nèi)得到的24個數(shù)據(jù)集,證明了ICP-MS是一種可重復(fù)分析的方法。近年來,隨著儀器進樣系統(tǒng)的多樣化以及接口性能的改進[9],電感耦合等離子體質(zhì)譜不斷與其他技術(shù)聯(lián)用,應(yīng)用范圍得到大幅擴展。激光燒蝕(LA)是一種常用的激光導入技術(shù),通過高強度激光脈沖聚焦在樣品表面產(chǎn)生高溫使樣品等離子化。激光燒蝕技術(shù)與ICP-MS相結(jié)合,能夠用于固體生物樣品的快速直接分析,具有制樣簡單、無需消解、污染小等優(yōu)點。為了消除儀器漂移、不穩(wěn)定性以及基質(zhì)對等離子體的影響,通常需要采用相同或相似基質(zhì)的標準物質(zhì)進行校準。如ASH等[10]根據(jù)果樹葉標準物質(zhì)中待測元素205Tl與內(nèi)標元素12C的強度比建立了校準曲線,并通過分析毛發(fā)標準物質(zhì)驗證了方法的定量準確性,而后使用LA-ICP-MS技術(shù)對鉈中毒前、中、后的頭發(fā)樣品進行連續(xù)線性掃描,成功揭示了中毒時間等重要信息。

2.4 激光誘導擊穿光譜法

激光誘導擊穿光譜法(Laser-induced breakdown spectroscopy,LIBS)是一種新興的物質(zhì)組分光化學“綠色”分析技術(shù)。與LA-ICP-MS檢測元素離子信號不同[11],LIBS利用超短脈沖激光聚焦在樣品表面形成的高溫使樣品產(chǎn)生特征的等離子體發(fā)射光譜,從而實現(xiàn)物質(zhì)成分及含量的分析。LIBS具有樣品制備簡單、響應(yīng)速度快等優(yōu)點,在食品安全[12]、環(huán)境監(jiān)測[13]等領(lǐng)域的重金屬快速檢測中發(fā)揮了重要作用。然而在分析生物組織樣品時,由于其具有表面凹凸不平、常溫下呈軟質(zhì)等特點,LIBS光譜信號質(zhì)量較低。為此,孫浩然[14]針對生物組織樣品的特性對LIBS檢測平臺裝置進行了設(shè)計與優(yōu)化,從而實現(xiàn)了光譜信號的有效采集,提高了光譜重復(fù)性以及信號質(zhì)量。此外,將化學計量學等方法與LIBS相結(jié)合,能夠為復(fù)雜光譜數(shù)據(jù)的定性定量分析提供強有力的支持。如YAO等[15]為了校正豬肉樣品的LIBS光譜基體效應(yīng),使用多元偏最小二乘算法對Cr和Pb的含量進行了預(yù)測,通過與AAS的檢測結(jié)果進行比較,驗證了校正模型的準確性。

2.5 單色聚焦X射線熒光光譜技術(shù)

X射線熒光光譜法(X-ray fluorescence spectrometry,XRF)是一種直接進樣的無損分析方法,通過分析待測元素受到激發(fā)后產(chǎn)生的X射線熒光強度來確定元素的含量。由于X射線熒光光譜與樣品的化學結(jié)合狀態(tài)無關(guān)[16],因此方法無需復(fù)雜的樣品前處理,具有操作簡單、檢測成本低、不損耗樣品等優(yōu)點。然而在分析生物樣品中的痕量重金屬元素時,由于傳統(tǒng)XRF技術(shù)的靈敏度相對較低,因此應(yīng)用較少。近年來,隨著電子技術(shù)與半導體材料的發(fā)展,X射線熒光光譜儀的檢測性能得到了顯著提升。單色聚焦X射線熒光光譜技術(shù)使用先進的單色聚焦光學器件DCC晶體,將來自光管的X射線單色化并有效聚焦到測量樣品的小區(qū)域,從而大幅提高了儀器的信噪比,在生物樣品中痕量重金屬的檢測方面展現(xiàn)出來巨大的應(yīng)用潛力。如WANG等[17]使用單色聚焦XRF技術(shù)建立了扇貝中As、Cd、Ni、Pb等重金屬元素的定量檢測方法,通過優(yōu)化儀器工作條件以及樣品制備方法,實現(xiàn)了重金屬的快速、準確分析。吳世豪等[18]采用同樣的技術(shù)對人體血液中As、Sr、Cd、Hg、Tl、Pb等元素進行了分析,檢出限在0.037～0.192 mg/L,適用于重金屬中毒案件的快速檢驗。

2.6 電化學傳感器技術(shù)

電化學分析法是一種高效、靈敏的重金屬痕量測定方法,具有便攜性好、特異性高、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,電化學傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水相中重金屬離子的檢測。然而當傳統(tǒng)傳感器直接接觸基質(zhì)復(fù)雜的生物樣本時,蛋白質(zhì)、紅細胞的非特異性吸附會造成傳感器的污染,從而影響檢測精度[19]。近年來,隨著新型修飾電極的開發(fā)以及檢測方法的創(chuàng)新[20],電化學分析法的選擇性、靈敏度不斷提高,檢測范圍也得到了相應(yīng)的改善,在生物樣品中重金屬的直接分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。如SONG等[21]構(gòu)建了一種新型的基于氯氧化鉍介孔氧化硅復(fù)合材料修飾的傳感器,用于真實血液樣品中鉛的電化學溶出分析,檢出限低至33 ng/L。SKIBA等[22]采用厚膜改性石墨傳感器(TMGE)作為工作電極,采用陽極溶出伏安法對牛精漿中的銅、鉛、鎘等重金屬進行了直接測定。CHEN等[23]基于肝素修飾的磁性超支化聚酰胺成功構(gòu)建了一種用于血鉛檢測的電化學/熒光雙響應(yīng)生物傳感器,肝素的修飾使傳感器具備了抗生物污損性,而具有豐富氨基和空腔結(jié)構(gòu)的超支化聚酰胺則能夠通過與鉛離子形成配位鍵快速積累血鉛,實現(xiàn)全血中鉛離子的高效檢測。

3 生物體內(nèi)重金屬的脫除方法

在實現(xiàn)生物體內(nèi)重金屬的定性定量檢測之后,下一步的措施是采取安全高效的治療方案進行重金屬的脫除。近年來,研究人員不斷探索重金屬在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝的生理和分子機制,多種安全有效的治療藥物得到了應(yīng)用。依據(jù)作用機理的不同,可以將脫除方法分為螯合法和吸附法兩大類。

3.1 螯合療法

螯合療法是治療急性重金屬中毒的主要方法。金屬螯合劑的種類多樣,通常是含有巰基、氨基等基團的雙齒或多齒配體,通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的配位鍵與中心金屬原子或離子形成螯合環(huán)。良好的螯合劑通常具備以下特性:1)在與金屬原子或離子結(jié)合后會形成化學惰性且無毒的絡(luò)合物,絡(luò)合物容易從體內(nèi)排出而不與重要器官發(fā)生進一步作用;2)能夠有效地穿過細胞膜,以清除細胞內(nèi)的有毒重金屬;3)在體液的pH值下保持其螯合特性,并且在體內(nèi)的分布與重金屬相同;4)對重金屬的親和力大于對人體必需微量元素的親和力[24]。二巰基丙醇(BAL),通過巰基與金屬原子或離子形成穩(wěn)定的配合物,隨后由腎臟排泄,實現(xiàn)砷、汞中毒的治療。二巰基丙磺酸鈉(DMPS),BAL的水溶性類似物,與BAL相比毒性更低且效力更好,通常用作砷和汞的解毒劑[25]。二巰基丁二酸鈉(DMSA),我國首創(chuàng)的廣譜金屬解毒劑,藥理作用與BAL相同但毒性更低[26]。依地酸鈣鈉,對無機鉛中毒的治療效果好,但對四乙基鉛中毒無效。去鐵胺(DFO),通過羥肟酸基團與Fe3+形成穩(wěn)定、無毒的水溶性鐵胺復(fù)合物,由尿排出[27]。青霉胺,主要用于治療因銅在組織中沉積所致的威爾遜病,也可用作砷、鉛中毒的治療[28]。

盡管取得了不錯的臨床治療效果,但這些螯合劑仍存在一些問題:具有一定的毒副作用,可能會導致繼發(fā)性中毒和嚴重的并發(fā)癥,長期服用也會對腎臟造成損害;易與人體內(nèi)的必需微量元素結(jié)合,造成鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)的流失。為此,在充分考慮各種螯合劑理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上,提出了聯(lián)合用藥的治療方式:通過同時使用輔助藥物來提高螯合劑的作用效果,從而大幅度地減少可能產(chǎn)生的副作用,實現(xiàn)更加安全高效的解毒。如莫能菌素(Monensin)與DMSA聯(lián)合使用時能夠顯著加速Pb2+與DMSA的螯合,從而有效去除沉積在大腦中的鉛[29]。

3.2 吸附法

吸附療法通過吸附劑對體內(nèi)重金屬的吸附作用,達到治療重金屬中毒的目的。按照材料來源的不同,可以分為天然無機吸附劑、天然有機吸附劑、合成吸附劑以及生物吸附劑,見表2。理想的吸附劑應(yīng)滿足以下幾點要求:1)安全、無毒性和過敏性,具有良好的生物相容性;2)高效,具有大的活性表面積,對毒素具有高的吸附能力;3)選擇性好,對人體內(nèi)微量營養(yǎng)素的損失小;4)物理和化學穩(wěn)定性良好[30-31]。

表2 常用的生物體內(nèi)重金屬吸附劑Table 2 Commonly used adsorbents for heavy metals in organisms

在眾多吸附劑中,由天然有機高分子材料和合成吸附材料制備的吸附劑得到了最為廣泛的應(yīng)用。殼聚糖、果膠、纖維素等天然多糖類活性物質(zhì)已經(jīng)用作重金屬的腸道吸附劑[32],而在新型高分子吸附材料的研發(fā)方面,同樣取得了不錯的成果。如GUO等[40]通過快速配體交換法合成了一種丁二酸包覆的磁性納米吸附劑,通過研究吸附劑與血液成分之間的相互作用及其誘導的細胞免疫反應(yīng),有效提高了血中重金屬的分離效率。結(jié)果表明,通過采用連續(xù)多級吸附模式,該研究合成的吸附劑能夠在120 min內(nèi)去除血液中97.97%的鉛和96.53%的鎘。SONG等[41]基于角叉菜膠和聚丙烯酸等材料,合成了一種模擬肝素結(jié)構(gòu)和官能團的雙網(wǎng)狀凝膠珠,該珠表現(xiàn)出了優(yōu)異的生物相容性以及抗凝性能,能夠有效清除血液中外源性和內(nèi)源性的重金屬等毒素。

此外,出于對可降解性與可持續(xù)性等因素的考慮,藻類、真菌等經(jīng)濟環(huán)保的生物吸附劑逐漸用于環(huán)境中重金屬污染的修復(fù)[50-51]。對于生物體內(nèi)的有毒重金屬,盡管魯氏酵母[45]、釀酒酵母[46]等生物吸附劑已經(jīng)展示出了良好的脫除效果,但對于其可能產(chǎn)生的安全風險,仍需開展大量的研究進行評估。為此,研究人員不斷開展相關(guān)的毒理學、耐藥性等實驗,以評價這些生物吸附劑的安全性,并進一步探究其解毒的機理。如于哲[47]對具有吸附重金屬Pb2+特性的酵母菌進行了安全性評價,通過開展有毒代謝產(chǎn)物實驗、毒理學實驗等研究,證明了相關(guān)菌株的安全性,從而為食品、藥品中此類微生物的應(yīng)用提供了合理的安全依據(jù)。李麗杰[49]通過開展體外吸附實驗與動物實驗,對具有良好吸附能力和抗鉛特性的菌株進行了安全性驗證,并通過光譜分析技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)等手段,對酵母菌的吸附及抗鉛機理進行了初步揭示。

4 總結(jié)與展望

重金屬的毒性會對健康造成嚴重危害,這促使研究人員不斷地開發(fā)各種方法與試劑,以有效地檢測和脫除生物體內(nèi)的有毒重金屬。目前,多種技術(shù)和材料已經(jīng)得到了應(yīng)用,并且取得了不錯的效果。然而尋找更加準確有效、環(huán)保節(jié)約、易于操作的檢測及脫除方法,是一個持續(xù)不斷的過程。展望未來,關(guān)于生物體內(nèi)有毒重金屬的檢測與脫除,仍存在一些亟待解決的問題。首先,對于重金屬的形態(tài)分析較為不足。在分析生物樣品中的重金屬時,目前的方法通常是對元素的總濃度進行測定,卻較少關(guān)注其存在形態(tài)。然而重金屬的毒性不僅與其含量有關(guān),而且還與元素的結(jié)合態(tài)、價態(tài)等物理-化學形式有關(guān)。因此,僅測定重金屬的總量,無法全面、客觀地反映生物體的實際中毒情況;其次,在采用新型快速檢測技術(shù)分析生物樣品中的重金屬時,缺乏對應(yīng)的標準物質(zhì),與ICP-MS、AAS等方法相比,LIBS等快速檢測技術(shù)不需要微波消解等樣品處理,然而如果不采取有效的方法消除基體效應(yīng),則會導致測量結(jié)果出現(xiàn)一定的偏差;最后,關(guān)于部分重金屬脫除藥物在生物體內(nèi)的作用機理以及可能產(chǎn)生的安全風險,仍需開展大量的工作進行探究與驗證。進一步的研究需要利用基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學等技術(shù),結(jié)合分析各類藥物對生物體基因表達及機體代謝的影響,從而揭示其在體內(nèi)緩解重金屬毒性的機制以及安全性。