基于LC-MS技術(shù)非酒精性脂肪肝病痰濕證大鼠肝臟的脂質(zhì)組學(xué)分析

張浩然 李毓秋 田琪 于晗 王翔宇 徐琬梨

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷疾病[1],流行病學(xué)顯示,NAFLD全球患病率為25%[2],嚴(yán)重威脅人類健康。因其關(guān)鍵致病因素為“痰”和“瘀”,故痰濕證是NAFLD的一種主要證型[3],且在已有的對NAFLD中醫(yī)證型的臨床研究中,痰濕證尤為常見。辨證論治是中醫(yī)診斷學(xué)的基本原則,也是中醫(yī)臨床診治的特色及核心,對個(gè)體的精準(zhǔn)辨證與脂質(zhì)組學(xué)的微觀探索有異曲同工之妙。機(jī)體的生理病理改變往往伴隨著代謝過程及成分的變化[4],NAFLD痰濕證的致病機(jī)制與代謝物紊亂密切相關(guān)[5],而脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要分支之一,為現(xiàn)代疾病的診斷提供了更有利的條件[6]。且中醫(yī)證型具備多樣性,根據(jù)脂質(zhì)代謝在NAFLD病程中的參與作用可推斷其代謝標(biāo)志物可能是區(qū)別NAFLD中醫(yī)證型的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)及客觀化依據(jù)。但目前國內(nèi)有關(guān)對NAFLD痰濕證的脂質(zhì)組學(xué)分析相對較少。本研究通過液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術(shù)檢測正常組大鼠與造模后痰濕組大鼠肝臟脂質(zhì)代謝物,探討NAFLD痰濕證大鼠肝臟脂質(zhì)代謝規(guī)律及特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝標(biāo)志物,并探索痰濕證NAFLD證型的脂質(zhì)代謝機(jī)制,有助于對NAFLD痰濕證進(jìn)行精準(zhǔn)辨證,為NAFLD痰濕證的診斷及有效防治提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:液相色譜儀(Thermo Vanquish)、質(zhì)譜儀(Thermo QE Focus)、冷凍離心機(jī)(湘儀 H1850-R)、混勻儀(其林貝爾 BE-2600)、真空濃縮儀(eppendorf 5305)、濾膜(Jin Teng 0.22 μm PTFE)、組織研磨器(美壁 MB-96)

試劑:甲醇(色譜純,Thermo)、乙腈(色譜純,Thermo)、甲酸(色譜純,TCI)、甲酸銨(色譜純,Sigma)、氯仿(色譜純,沃凱)、異丙醇(色譜純,Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性8周齡SD大鼠,16只,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,合格證號(hào):370726210100095071;許可證號(hào):SCXK(魯)2019 0003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.3 模型制備分組及驗(yàn)證

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,以隨機(jī)數(shù)字的方法分成兩組,每組8只,每籠飼養(yǎng)數(shù)量不超過3只,光照12小時(shí)/天,飼養(yǎng)溫度(24±1)℃,相對濕度45%～70%,自由攝食和攝水。模型組采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇、10%豬油)喂養(yǎng)誘導(dǎo)造模[7],正常對照組采用普通飼料喂養(yǎng),喂養(yǎng)8周。造模期間每天觀察各組大鼠毛發(fā)、攝食、飲水、糞便、精神狀態(tài)及整體行為活動(dòng)等情況,每4周測體質(zhì)量并記錄。

模型制備結(jié)果:模型組大鼠的體質(zhì)量、肝重、血清總膽固醇、血清甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶較正常組明顯偏高,且體質(zhì)量、血清總膽固醇、血清甘油三酯(triglyceride,TG),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),肝重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示NAFLD模型制備成功。NAFLD大鼠嗜睡,毛松散暗淡無光,活動(dòng)量減少,大便黏膩臭穢等癥狀符合人的痰濕證的特征[8],認(rèn)為NAFLD痰濕證模型建立成功。

1.4 樣本取材

取材前一晚對大鼠禁食不禁水12小時(shí),取濃度為10%水合氯醛溶液對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(0.25 mL/100 g),下腔靜脈取血后摘取肝組織,稱重后置于超低溫-80℃保存。

1.5 肝臟脂質(zhì)樣品處理

稱取肝臟組織100 mg于2 mL管中,加入750 μL氯仿:甲醇混合溶液(2∶1,-20℃),渦旋振蕩30秒;冰上放置40分鐘,加入190 μL蒸餾水,渦旋振蕩30秒,冰上靜置10分鐘;離心(12 000 rpm,4℃,5分鐘),向下層液體中加入500 μL氯仿:甲醇混合溶液(2∶1,-20℃),渦旋振蕩30秒;離心(12 000 rpm,4℃,5分鐘)取400 μL下層液體用真空離心濃縮儀濃縮;用200 μL異丙醇溶解樣品,0.22 μm膜過濾,得到待測樣本。每個(gè)待測樣本中各取20 μL混合成質(zhì)量控制(quality control,QC)樣本。

1.6 脂質(zhì)組學(xué)檢測條件

1.6.1 色譜條件 儀器使用ACQUITY UPLC?BEH C18 色譜柱(2.1×100 mm×1.7 μm,購自美國賽默飛世爾科技公司),自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8℃,流速為0.25 mL/min,柱溫為50℃,流動(dòng)相C相為乙腈∶水=60∶40(0.1%甲酸+10 mM甲酸銨),D相為異丙醇∶乙腈=90∶10另加(0.1%甲酸+10 mM甲酸銨)。梯度洗脫程序?yàn)?～5分鐘,70%～57%C;5～5.1分鐘,57%～50%C;5.1～14分鐘,50%～30%C;14～14.1分鐘,30%C;14.1～21分鐘,30%～1%C;21～24分鐘,1%C;24～24.1分鐘,1%～70%C;24.1～28分鐘,70%C。

1.6.2 質(zhì)譜條件 儀器使用電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子模式采集,正離子噴霧電壓為3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325℃,以分辨率35 000進(jìn)行全掃描,掃描范圍150～2 000,并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解,碰撞電壓為30 eV,同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

1.7.1 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性 所有待測樣本各取20 μL,等量配置,混合制成QC樣本,處理方法如“1.5”。

1.7.2 數(shù)據(jù)處理 脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)通過LipidSearch軟件(v4.0)將獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行脂質(zhì)注釋,得到包括質(zhì)荷比和保留時(shí)間及峰響應(yīng)值等信息的數(shù)據(jù)矩陣。將所有樣本的注釋結(jié)果,通過LipidSearch軟件(v4.0)進(jìn)行alignment,對所有單個(gè)數(shù)據(jù)的注釋結(jié)果進(jìn)行峰對齊、峰過濾等工作,主要參數(shù)有bR.T.Tolerance=0.25,m-Score Threshold=3。為使不同量級(jí)的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行比較,對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰響應(yīng)值的總峰歸一化。歸一化后,進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,對所有樣本進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)。采用Simca-P 13.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)軟件進(jìn)行處理。采用Pareto數(shù)據(jù)變換,首先進(jìn)行無監(jiān)督的PCA分析,觀察各族數(shù)據(jù)的聚類并去除離群樣本;然后用偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis,PLS-DA)和正交—偏最小二乘判別分析(orthogonal- Partial Least Squares-Discriminant Analysis,OPLS-DA)進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析,并采用置換檢驗(yàn)防止PLS-DA模型的過度擬合差異脂質(zhì)。設(shè)置第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in the Projection,VIP)>3.5,P<0.001,倍數(shù)變化(fold change,FC)>2或<0.5來尋找差異的脂質(zhì)。根據(jù)獲得的潛在脂質(zhì)標(biāo)志物檢索HMDB(https://hmdb.ca)等數(shù)據(jù)庫,參考相關(guān)信息和文獻(xiàn)對生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步篩選及確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理

2.1.1 總離子流圖(total ion chromatogram,TIC) 使用LC-MS在正離子模式和負(fù)離子模式對肝臟進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析。肝臟中提取物的TIC圖顯示代謝物存在顯著差異性。代表性的色譜圖如圖1所示。

圖1 正負(fù)離子模式下TIC圖

2.1.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià) 對QC樣本進(jìn)行主成分分析,由圖可見QC樣本聚集,重復(fù)性良好,表明系統(tǒng)穩(wěn)定,樣本數(shù)據(jù)可靠。見圖2。

圖2 QC樣本PCA得分圖

2.1.3 數(shù)據(jù)驗(yàn)證分析 將數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行PCA分析、PLS-DA分析,同時(shí)采用OPLS-DA模型驗(yàn)證。

見圖3。結(jié)果可見模型組與正常組大鼠組間明顯聚集,分離良好,表明模型組肝臟脂質(zhì)代謝出現(xiàn)較為明顯的紊亂。模型擬合指數(shù)R2=0.59,預(yù)測指數(shù)Q2=-0.45,表明所建立模型的擬合能力和預(yù)測能力良好。見圖4。

注:A為正常對照組,B為NAFLD痰濕證組;①為正常組與模型組的PCA得分圖,②為PLS-DA得分圖,③為PLS-DA置換檢驗(yàn)圖,④為OPLS-DA得分圖。

2.2 脂質(zhì)差異分析與標(biāo)志物篩選

根據(jù)OPLS-DA的結(jié)果,參數(shù)設(shè)置VIP>3.5,P<0.001且FC>2或<0.5的篩選條件,得到23個(gè)變量結(jié)果作為NAFLD痰濕證潛在的脂質(zhì)代謝的生物標(biāo)志物,與正常對照組相較,12個(gè)TG、一個(gè)甘油二酯(diacylglycerol,DG)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)(15∶0_20∶3)升高,其余9個(gè)PC、一個(gè)雙—甲基化磷脂酸(bis-methyl phosphatidic acid,BisMePA)、一個(gè)溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)、一個(gè)甲基化磷脂酰膽堿(methyl phosphatidylcholine,MePC)、一個(gè)溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine,LPE)降低,詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

表1 NAFLD痰濕證組與正常對照組潛在脂質(zhì)代謝生物標(biāo)志物結(jié)果

3 討論

NAFLD同多數(shù)代謝疾病一樣存在誘發(fā)原因多樣性的特點(diǎn),而肝臟作為最重要的人體代謝器官,與脂類的代謝合成關(guān)系密切,尤其是參與內(nèi)源性脂肪的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD的重要特征之一,且其發(fā)生和發(fā)展程度與中醫(yī)痰濕證密切相關(guān)[5,10-11]。通過脂質(zhì)組學(xué)對生物脂質(zhì)進(jìn)行篩選和分析,探索脂質(zhì)生物標(biāo)志物及其相關(guān)的代謝通路,對于本病以及相關(guān)證型的診斷和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究有著及其重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究以探索NAFLD中醫(yī)臨床最常見證型痰濕證的脂質(zhì)代謝差異物為研究目標(biāo),補(bǔ)充了脂質(zhì)組學(xué)對NAFLD痰濕證的研究空白。質(zhì)譜分析一般是脂質(zhì)組學(xué)研究的首選分析技術(shù),在對脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定能力和靈敏度、精確度上體現(xiàn)了其絕對優(yōu)勢。因此本研究采用了LC-MS技術(shù)正負(fù)離子相結(jié)合的電離模式進(jìn)行檢測,以獲得覆蓋率更大、更準(zhǔn)確的差脂質(zhì)異代謝物。

痰濕證為NAFLD最為常見的中醫(yī)證型。NAFLD雖無明確的中醫(yī)病名,但根據(jù)其臨床特性一般將其歸于“肝脹、肝痞、肝癖、肝著、鼓脹、痞滿、積聚、濕阻、痰濁、痰證、肥氣”等相關(guān)疾病[12]。其病位主要在肝脾,久則及腎。各醫(yī)家認(rèn)為其病因病機(jī)為肝郁氣滯或脾胃受損,內(nèi)生濕濁;肝郁氣滯,肝病及脾,脾失健運(yùn),濕濁內(nèi)停;濕邪日久,郁而化熱,導(dǎo)致濕熱內(nèi)蘊(yùn);聚濕則生痰,痰阻則血瘀,遂成痰瘀互結(jié)[13],可認(rèn)為NAFLD發(fā)病與疾病進(jìn)程與濕證關(guān)系最為密切,其關(guān)鍵致病因素為“痰”和“瘀”,而其中濕邪的程度也反應(yīng)了疾病的輕重程度,符合中醫(yī)的“聚濕成痰、痰瘀互結(jié)”理論特點(diǎn)。本病證主要表現(xiàn)為形體肥胖、腹部肥大松軟、皮膚油膩、喜食肥甘厚膩、素體痰多而黏、時(shí)感口甜、身重不爽、容易困倦、舌體肥大、舌苔白膩、脈滑等[14]。

目前臨床上雖存在較多降血脂藥物可供選擇,但尚缺乏對NAFLD靶點(diǎn)明確的有效治療藥物,且其副作用極易加重肝臟損傷及脂肪沉積[15]。通過對NAFLD痰濕證的脂質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)合中醫(yī)基于“整體觀念”思想指導(dǎo)下進(jìn)行精準(zhǔn)“辨證論治”,充分發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢,補(bǔ)充現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之局限,護(hù)肝、降脂、抗肝纖維化并降低西藥所造成的毒副作用損害[16-17],基于此優(yōu)勢,有關(guān)于運(yùn)用中醫(yī)藥治療NAFLD的思路及有效研究案例相繼涌現(xiàn)[18-20]。本研究通過分析NAFLD痰濕證與正常對照組大鼠之間的脂質(zhì)成分的變化情況,發(fā)現(xiàn)在NAFLD痰濕證中發(fā)生改變的主要是甘油酯類、磷脂類等共計(jì)23種脂質(zhì)代謝物,其中12個(gè)TG、一個(gè)DG呈上調(diào)趨勢;PC類脂質(zhì)PC(15∶0_20∶3)呈上調(diào)趨勢,其余均呈下調(diào)趨勢。

甘油磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分[21],可協(xié)助脂肪運(yùn)輸,其缺失會(huì)致使脂肪外運(yùn)障礙從而形成脂肪肝,因此磷脂中PC、PE的水平對在肝臟單純性脂變NASH中的進(jìn)展進(jìn)行提示,并對細(xì)胞膜的完整性起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Anjani K等[22]研究結(jié)果表明在女性肥胖脂肪肝病患者的血液中PC、PE等脂類水平升高,可認(rèn)為在NAFLD中肝臟及血清的甘油磷脂改變可對NAFLD痰濕證病程下肝臟脂質(zhì)合成代謝異常起到提示作用。PC合成受阻時(shí),體內(nèi)極低密度脂蛋白膽固醇會(huì)受到抑制,無法結(jié)合TG從肝組織中轉(zhuǎn)出從而導(dǎo)致TG在肝組織堆積,推動(dòng)NAFLD病程,因此PC含量降低在NAFLD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。同時(shí),甘油磷脂磷可在特定酶的作用下水解成脂肪酸和溶血磷脂,而溶血磷脂顧名思義具有強(qiáng)溶血作用,其機(jī)制會(huì)破壞紅細(xì)胞膜或其他細(xì)胞膜。Wang S[23]研究發(fā)現(xiàn)Gln/Glu比值、支鏈氨基酸和LPC與高血糖發(fā)展和代謝性疾病危險(xiǎn)因素顯著相關(guān)。由此可推斷LPC、LPE的含量異常與NAFLD發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

TG參與NAFLD的發(fā)病機(jī)制。TG以二酰基甘油(DG)為基礎(chǔ)通過二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT1和2)合成,肝TG積累是NAFLD的主要決定因素。TG分子代表了脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)和血漿中儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)闹饕问?在營養(yǎng)過剩和肥胖的情況下,肝脂肪酸代謝被改變,通常導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)TG積累,并導(dǎo)致NAFLD發(fā)病[24]。Gorden DL等[21]采用ESI-MS/MS的“目標(biāo)”脂質(zhì)組學(xué)研究肝臟脂質(zhì)水平,結(jié)果顯示NAFLD患者的磷脂和DAG水平與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,在肝硬化患者的肝臟提取物中鑒定出來新的磷脂類(乙醚結(jié)合的磷脂酰肌醇)。氧化應(yīng)激在NAFLD進(jìn)展中起著核心的作用,Feldstein AE等[25]利用LC/ESI/MS/MS的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究NAFLD患者的血漿脂質(zhì)氧化產(chǎn)物水平及這些產(chǎn)物的來源,評(píng)估它們在循環(huán)中的水平是否反映肝臟的組織學(xué)改變。Puri P等[26-27]研究發(fā)現(xiàn),在正常人、NAFL及NASH的脂質(zhì)組學(xué)分析中,NAFL及NASH組的TG、DG水平較正常組呈現(xiàn)明顯的升高趨勢,且TG/DG值與肝損程度呈正相關(guān),這與本研究的結(jié)論有一定相似性。DG的增加是NAFLD的標(biāo)志,Gorden DL等[21]研究表明正常與脂肪肝病患者中DG存在顯著差異,可認(rèn)為DG轉(zhuǎn)移酶在NAFLD的疾病進(jìn)程中發(fā)揮作用,并認(rèn)為其參與可能會(huì)影響TG、PC、PE等脂類水平的改變。同時(shí)脂肪肝病患者的PC水平低于正常人也與DG的合成增加有關(guān)。Yetukuri L等[28]利用超高效液相色譜—質(zhì)譜(UPLC/MS)技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法對肥胖相關(guān)的ob/ob小鼠的肝臟脂質(zhì)進(jìn)行研究,也發(fā)現(xiàn)TG、DAG類上調(diào),而鞘磷脂在ob/ob小鼠肝臟的含量下調(diào),認(rèn)為酰基甘油的增加可能是導(dǎo)致ob/ob小鼠脂肪肝進(jìn)展的標(biāo)志。路曉茅[29]研究得出,ALT與TG(60∶6)在多因素相關(guān)性分析中呈負(fù)相關(guān),在存在組間差異的8個(gè)TAG中檢出TG(52∶1)[TG(18∶0/16∶0/18∶1)]、TG(54∶2)[TG(18∶1/16∶0/20∶1)]呈現(xiàn)升高趨勢,其性質(zhì)及脂肪酸鏈含鍵數(shù)不同,故TAG水平差異可能與其上包含的脂肪酸鏈性質(zhì)有關(guān),可認(rèn)為脂質(zhì)分子的種類和水平可能會(huì)對NAFLD痰濕證的病程和發(fā)展有一定的提示作用,且甘油酯類的變化趨勢有極大可能對應(yīng)NAFLD痰濕證病程發(fā)展,DG可能是NAFLD病程發(fā)展的重要信號(hào),TG相關(guān)的脂質(zhì)分子性質(zhì)可能與NAFLD病程進(jìn)展中肝臟的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

以上可佐證本研究表明NAFLD患者肝臟及血清中甘油三酯、甘油二酯、磷脂與肝臟DNL過程及氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體和過氧化酶功能性異常存在相關(guān)性,推測這些脂質(zhì)有可能作為NAFLD痰濕證的重要標(biāo)志物,且隨各脂質(zhì)間差異的升高與降低,有可能反應(yīng)疾病的進(jìn)程及痰濕證的程度。

總之,本研究通過LC-MS技術(shù)對正常大鼠與造模后NAFLD痰濕證大鼠進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)研究,揭示中醫(yī)痰濕證的脂質(zhì)代謝基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)痰濕證NAFLD大鼠較正常對照組的肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生了顯著改變,鑒定發(fā)現(xiàn)23個(gè)差異脂質(zhì)代謝標(biāo)志物包括甘油脂類、磷脂類等多種脂質(zhì)信號(hào)分子,或可將其作為潛在的NAFLD痰濕證新的治療靶點(diǎn),為診斷及防治NAFLD痰濕證提供新的依據(jù)。未來對NAFLD痰濕證基于大樣本人群和臨床試驗(yàn)人群的脂質(zhì)組學(xué)研究,無疑會(huì)產(chǎn)生大量相關(guān)信息,有利于開發(fā)無創(chuàng)性的診斷方法及新的治療方法,并進(jìn)一步將脂質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于NAFLD痰濕證的臨床研究中。但由于目前針對NAFLD痰濕證研究的論述較少,具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探索,同時(shí),在脂質(zhì)組學(xué)分析中對于樣品的處理及數(shù)據(jù)處理無法完全統(tǒng)一,因此生物標(biāo)志物可能存在一定差異,因此將在本研究基礎(chǔ)上,著重其與臨床的聯(lián)系,從“病證結(jié)合”到“證癥結(jié)合”進(jìn)一步探索[30],真正從微觀的角度揭示其發(fā)病機(jī)制,以進(jìn)一步為NAFLD痰濕證的診治提供新的依據(jù)。