尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑(urantide)減輕動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腎臟損傷

劉怡斐，王鑫宇，王嘉慧，杜曉冰，王 途，趙 娟

承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000

尾加壓素Ⅱ(urotensin,UⅡ)與G蛋白偶聯(lián)受體(GPR14)構(gòu)成的UⅡ/UT具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)等心血管疾病的作用[1]。Urantide是由在UⅡ 衍生而來(lái)的受體拮抗劑,可抑制UⅡ/UT系統(tǒng)影響多條信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用[1-3]。JAK2/STAT3(Janus kinase 2 and signal transducer and activator of transcriptions 3)信號(hào)通路活化在腎損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,抑制其活性可有效恢復(fù)腎臟功能[4-6]。本課題組前期研究[7-8]發(fā)現(xiàn),urantide可競(jìng)爭(zhēng)性拮抗UⅡ,有效改善AS大鼠的病理變化,機(jī)制尚不清楚。JAK2/STAT3信號(hào)通路在AS相關(guān)腎損傷中是否具有作用?本研究探索了urantide在AS大鼠發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)腎臟JAK2/STAT3信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)主要試劑

Wistar雄性大鼠,(190±10)g,SPF級(jí)(北京維通利華)。Urantide(蘇州強(qiáng)耀生物公司);辛伐他汀(simvastodin,北京諾華制藥公司)。免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司);p-JAK2和p-STAT3(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將大鼠分為:1)正常組(n=10);2)模型組(n=40),飼以高脂特制飼料,連續(xù)3 d每天腹腔注射給予 VitD3150 U/(kg·d-1)。實(shí)驗(yàn)周期為6周。辛伐他汀組 (n=10)每天灌胃給予5 μg/kg,連續(xù)14 d;干預(yù)模型組(7 d和14 d)(每組n=10)每天尾靜脈注射 30 μg/(kg·d-1),分別連續(xù)7 d和14 d。

1.2.2 HE和Masson染色檢測(cè)病理:取大鼠組織蠟片進(jìn)行染色,在光鏡下觀察胸主動(dòng)脈和腎臟的組織形態(tài)變化,隨機(jī)選擇10個(gè)視野評(píng)估腎小球的硬化[9]和腎小管間質(zhì)損傷程度[10]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)蛋白:嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,應(yīng)用病理圖形分析軟件Image J-Pro Plus 6.0 計(jì)算各組腎臟組織中p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)的平均吸光度(A)值。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)腎組織JAK2/STAT3 mRNA:Trizol法提取腎臟組織總RNA,按照試劑盒操作說(shuō)明,檢測(cè)JAK2、STAT3和β-actin mRNA的Ct值,并以目的基因與β-actin mRNA Ct值的差值為ΔCt,運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胸主動(dòng)脈形態(tài)變化

模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜下出現(xiàn)結(jié)締組織鈣化、泡沫細(xì)胞形成,彈性纖維變性、斷裂等典型AS病理形態(tài)改變(圖1)。

圖1 胸主動(dòng)脈的形態(tài)變化

2.2 腎臟形態(tài)變化

模型組腎組織水腫,腎小球萎縮且與周圍組織黏連,腎小管上皮細(xì)胞萎縮變性甚至有壞死征象,膠原纖維大量表達(dá)于腎小球與小管間質(zhì)中為典型的腎損傷特征;腎小球和腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分均升高(P<0.01)。與模型組相比,經(jīng)urantide治療后腎臟病理變化得到有效改善(P<0.01)(圖2)。

2.3 Urantide對(duì)腎組織JAK2/STAT3表達(dá)的影響

模型組大鼠腎組織的腎小球和腎小管間質(zhì)中p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性顆粒表達(dá)明顯強(qiáng)于正常組。與模型組相比,urantide組p-JAK2和p-STAT3在腎小球和腎小管間質(zhì)中陽(yáng)性顆粒表達(dá)下降(P<0.05,P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with normal group; #P<0.05,##P<0.01 compared with AS model group; △P<0.05 compared with simvastatin group.

2.4 Urantide對(duì)腎組織JAK2/STAT3基因表達(dá)的影響

模型組腎組織中JAK2和STAT3的基因表達(dá)水平較正常組升高。干預(yù)模型組JAK2和STAT3 mRNA在腎組織中表達(dá)較模型組下降(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

*P<0.01 compared with normal group; #P<0.05,##P<0.01 compared with AS model group; △P<0.05,△△P<0.01 compared with simvastatin group.

3 討論

AS嚴(yán)重威脅人類健康,在其進(jìn)展過(guò)程可促進(jìn)腎動(dòng)脈狹窄造成缺血性損傷而影響濾過(guò)與重吸收功能[11]。研究發(fā)現(xiàn),AS大鼠腎小球腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯受損,說(shuō)明在發(fā)生AS時(shí)腎臟功能發(fā)生異常。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在腎損傷中大量激活,嚴(yán)重影響腎臟的代謝能力以形成惡性循環(huán)進(jìn)而加重腎臟損傷[4-6]。本課題組發(fā)現(xiàn),p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性顆粒及基因表達(dá)水平升高,其可能對(duì)腎臟的濾過(guò)與重吸收功能有一定影響。為進(jìn)一步探究JAK2/STAT3通路對(duì)AS大鼠腎臟的作用機(jī)制,本研究采用辛伐他汀和urantide治療AS大鼠以觀察兩種藥物對(duì)AS大鼠的腎損傷的修復(fù)作用。

Urantide作為UⅡ受體拮抗劑,對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有防治作用,同時(shí)對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖及膠原合成亦具有抑制作用[2,8]。本次研究顯示,AS大鼠經(jīng)urantide治療后,腎臟組織水腫現(xiàn)象減輕,腎小球萎縮與黏連程度得到改善,腎臟功能得到有效改善。相應(yīng)地,urantide降低了JAK/STAT3信號(hào)通路活化狀態(tài)。由此說(shuō)明,urantide可通過(guò)抑制該通路以改善腎臟功能。然而,p-JAK2和p-STAT3在腎小球和腎小管間質(zhì)中分布存在差異,說(shuō)明兩者可能分別影響腎臟的重吸收、濾過(guò)功能,但其作用機(jī)制仍需深層次研究。

綜上所述,VitD3給藥及高脂飲食在誘導(dǎo)AS發(fā)生的同時(shí)引發(fā)了腎損傷。本研究進(jìn)一步證明,urantide可緩解AS大鼠腎損傷,可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。