LncRNA(HOTAIR)/miR-206/TAGLN2信號軸調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌細胞的侵襲

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腫瘤,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常見的甲狀腺癌類型[1]。隨著甲狀腺健康體檢的普及和檢查技術(shù)的提高,PTC的檢出率越來越高,多數(shù)患者預后良好,但仍有10%患者會發(fā)生腫瘤復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[2],亟需尋找與甲狀腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標志物以改善此部分患者的生存和預后。

肌動蛋白結(jié)合蛋白(transgelin2,TAGLN2)與人腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌及結(jié)直腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3],但在甲狀腺癌中的作用及其調(diào)控機制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)在基因的轉(zhuǎn)錄后微調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。miR-206通過靶向下游分子,抑制結(jié)肝內(nèi)膽管細胞癌[4]和非小細胞肺癌[5]的增殖、遷移和侵襲,其在PTC中侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制研究尚未見報道。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOTAIR通過miR-206調(diào)節(jié)斯鈣素(stanniocalcin,STC)進而影響腫瘤細胞生物學功能[6],有學者報道HOTAIR在PTC中高表達,對PTC的發(fā)展有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。本研究旨在探討HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2是否通過相互作用參與調(diào)節(jié)PTC的侵襲轉(zhuǎn)移,為PTC侵襲、轉(zhuǎn)移和治療提供新的研究依據(jù)和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要細胞和組織樣本:人甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院);10例甲狀腺乳頭狀癌和對應癌旁組織取自就診于蘭州大學第一醫(yī)院的甲狀腺癌患者,所取標本均由病理確診為甲狀腺癌。項目通過蘭州大學第一醫(yī)院倫理委員會的批準(LDYYLL2021-20),并取得所有參與者的知情同意。

1.1.2 試劑及試劑盒:DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和血清(Gibco公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(Sigma-Aldrich公司);GAPDH、HOTAIR、miR-206、TAGLN2引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);miR-206 Mimic和silncRNAHOTAIR(廣州銳博生物技術(shù)有限公司);抗GAPDH和TAGLN2抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng):用含10% FBS+1%雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基在5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1,達到 90% 左右匯合時進行細胞轉(zhuǎn)染實驗及后續(xù)相關(guān)的實驗。

1.2.2 細胞的轉(zhuǎn)染:按照陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine3000、miRNA-206 mimic和silncRNA HOTAIR的說明書,將轉(zhuǎn)染試劑和目標RNA制劑加入增值狀態(tài)良好的對數(shù)增值期的TPC-1細胞中,加入無抗生素和無血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后,換用含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 熒光實時定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA:Trizol試劑盒抽提總RNA,檢測RNA濃度,按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增反應,每個樣本重復3次。用SYBR Green染料法,以GAPDH為內(nèi)參照,設(shè)計目標基因引物(表1)。PCR反應條件為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,95 ℃ 15 s,共40個循環(huán)。反應完成后,分析相應Ct值,得出各組之間基因的mRNA表達水平的差異。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測目標蛋白質(zhì):用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細胞和組織蛋白質(zhì),BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣量為50 μg,內(nèi)參為GAPDH,后分別以80 V和120 V恒壓電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)模,脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃一抗孵育過夜,TBST清洗3次,室溫孵育二抗1 h,TBST清洗后,加入ECL化學發(fā)光檢測試劑,暗室X線曝光,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)表達量。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞侵襲:胰蛋白酶消化TPC-1細胞,調(diào)整細胞濃度至5×104/mL,取200 μL無FBS細胞懸液加入Transwell上室中,取600 μL含30% FBS培養(yǎng)基加入下室。共培養(yǎng)體系培養(yǎng)48 h后,4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色液避光染色30 min,顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)并拍照保存。

1.2.6 生存期分析:用GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在線搜索分析TCGA數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌組織及正常組織中的TAGLN2的表達情況;同時繪制TAGLN2的表達與甲狀腺癌患者無瘤生存期之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中TAGLN2在甲狀腺癌中的表達

TCGA數(shù)據(jù)庫資料分析得到甲狀腺組織的TAGLN2的表達如箱線圖顯示,TAGLN2在腫瘤組織中的表達量高于癌旁組織對照(圖1A)。TAGLN2相關(guān)的無瘤生存曲線顯示,TAGLN2高表達組的無瘤生存期可能更短(圖1B)。

A.expression profile of TAGLN2 in tumor tissue and adjacent tissue; B.TAGLN2-related tumor-free survival curve in patients with thyroid cancer; *P<0.05 compared with adjacent tissue.

2.2 HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2在PTC組織中的表達

與癌旁組織(adjacent tissue,AT)相比PTC組織(PTC)中HOTAIR表達量增加2.48倍,miR-206-5p降低至為原來的3/5水平,TAGLN2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量均增加(P<0.05)(圖2)。

AT.adjacent tissue; PTC.papillary thyroid cancer; A.HOTAIR and TAGLN2 gene expression; B.miR-206 gene expression; C.TAGLN2 protein expression; *P<0.05 compared with AT.

2.3 miR-206的增加抑制了TPC-1細胞中TAGLN2的表達

與對照組(normal control group,NC)相比,上調(diào)TPC-1細胞中miR-206的表達后,TAGLN2的表達受到抑制,轉(zhuǎn)染miR-206 mimic組中TAGLN2的蛋白表達顯著減少(圖3)。

NC.normal control group;*P<0.05 compared with NC.

2.4 miRNA-206抑制了TPC-1細胞的侵襲能力

與對照組相比miR-206 mimic組TPC-1細胞的侵襲能力下降(73±11vs.152±20)(P<0.05)(圖4)。

2.5 HOTAIR對TPC-1細胞中miR-206和TAGLN2表達的影響

干擾lncRNAHOTAIR后,TPC-1細胞中miR-206表達量增加了2.13倍,TAGLN2基因表達量降低至原來的1/2(圖5A)。與對照組相比,干擾組中TAGLN2蛋白表達減少(圖5B)。

a.si-HOTAIR on miR-206-5p and TAGLN2 expression; B.si-HOTAIR on TAGLN2 protein expression;*P<0.05 compared with si-NC.

2.6 LncRNA HOTAIR對TPC-1細胞侵襲能力的影響

干擾HOTAIR的表達后,TPC-1細胞的侵襲能力明顯下降(圖6),干擾組和對照組相比穿透小室的細胞數(shù)量明顯減少(64±12vs161±15)(P<0.05)。

A,B.Transwell assay in the si-NC and si-HOTAIR group (magnification×400); C.histogram of the Transwell assay; *P<0.05 compared with si-NC group(n=6)

3 討論

PTC的5年生存率較高,但仍有約5%～10%的腫瘤生長迅速、侵襲性高,出現(xiàn)復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移,因此,需要進一步了解PTC發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制TAGLN2作為肌動蛋白結(jié)合蛋白Calponin家族的一員,是一種致癌基因。研究發(fā)現(xiàn),TAGLN2可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移和凋亡[8]。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有甲狀腺癌組織數(shù)據(jù)分析顯示,TAGLN2在癌組織中的表達量顯著高于正常組織,本研究中組織樣品的表達也得到了相同的結(jié)果。同時,分析表明,TAGLN2高表達可能預示患者的無瘤生存期更短。此外,研究證明,下調(diào)TAGLN2可以抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲活性[9],與本研究的實驗結(jié)果一致。

miRNA在各種腫瘤中通過調(diào)控相關(guān)靶基因發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),miRNA在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用[10]。miR-206在腫瘤進展中發(fā)揮抑制作用,許多研究報道,miR-206參與腫瘤的發(fā)病機制,但其對PTC-1細胞增殖和遷移的調(diào)控機制仍不明確。通過生物信息學分析,得出miR-206可能靶向調(diào)控TAGLN2進而在PTC中發(fā)揮重要作用。本研究證實,miR-206對TAGLN2調(diào)控作用,miR-206過表達導致TPC-1中TAGLN2的下調(diào)。同時,Transwell小室法的實驗結(jié)果也顯示,miR-206過表達后,PTC-1細胞的侵襲能力受到抑制。

越來越多的證據(jù)表明,lncRNA在多種生物過程的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。作為研究最廣泛的lncRNA之一,HOTAIR已被報道在許多腫瘤中高表達,其表達水平與某些腫瘤的病理分級、臨床分期和預后密切相關(guān)[11],HOTAIR在PTC組織中的高表達通常導致較差的預后[12]。而HOTAIR在PTC調(diào)控中的詳細作用及其潛在機制迄今尚未完全闡明。miR-206與HOTAIR在PTC中的表達是否存在相關(guān)性尚不清楚。本研究評估HOTAIR對PTC中miR-206水平的調(diào)控作用。在PTC-1細胞或甲狀腺乳頭狀癌組織中,高水平HOTAIR抑制miR-206的表達,下調(diào)HOTAIR表達可導致miR-206水平明顯升高,同時TAGLN2表達水平隨之下降,PTC-1細胞的侵襲能力下降。

綜上所述,在PTC的腫瘤組織或細胞中可檢測到HOTAIR高表達,miR-206低表達,TAGLN2高表達,其具有成為PTC有價值的生物標志物的潛力。此外,在甲狀腺乳頭狀癌中,可以通過降低HOTAIR的表達水平,促成miR-206的過表達,進一步抑制TAGLN2的表達,最終達到降低甲狀腺癌的侵襲能力的目的。因此,HOTAIR和TAGLN2水平的降低,miR-206水平的升高,可能有助于抑制PTC的惡性生物學行為。