西地那非對勃起功能障礙模型大鼠主動脈血管組織中NLRP3/caspase-1通路的影響

張汐佳，朱兵兵，楊承霞，牛立盼，劉鳳霞，2*

1.新疆醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 人體解剖學教研室，新疆 烏魯木齊 836001；2.新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 836001

勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)是指患者在性行為中陰莖持續(xù)或反復無法達到令人滿意的性交,是男性常見的性功能障礙之一[1]。目前,西地那非(sildenafil,Sil)是治療ED的一線臨床藥物,早期治療不僅可以逆轉ED的發(fā)生發(fā)展,而且可以預防重大心血管事件的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),ED患者的血管發(fā)生病理性改變,主動脈損傷指數(shù)上升[2],且已經(jīng)明確 ED是血管性疾病的預警因子,而炎性反應是ED和血管性疾病共同的核心機制,引發(fā)內皮功能障礙和血管組織纖維化,進一步加重ED。而焦亡是一種新型的促炎程序性細胞死亡方式,核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的組裝和激活能促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化、消皮素D(gasdermin D,GSDMD) 膜穿孔及白介素-1β(interleukin,IL-1β)的釋放[3]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)[4-5],ED患者血清中炎性相關蛋白水平顯著升高,且Sil能減少ED大鼠睪丸組織中的細胞焦亡。因此,本研究在此基礎上,進一步明確Sil對ED大鼠主動脈血管組織中NLRP3/caspase-1焦亡通路蛋白表達的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級6周齡雄性SD大鼠和性成熟的雌性大鼠,體質量(250 ±10)g[新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,許可證:SCXK(新)2018-0003];室溫 20～24 ℃,濕度約55%,飲食飲水自由,適應性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學倫理委員會批準(IACUC-20280222-60)。

1.1.2 主要試劑:阿撲嗎啡(APO)(西格瑪企業(yè)有限責任公司);NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD一抗(Affinity公司);西地那非、BCA蛋白質定量試劑盒、蛋白質電泳試劑盒及Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司);45%高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將大鼠隨機分為對照組(control,n=10)、模型組(ED,n=45),高脂飼料誘導造模。12周后,阿撲嗎啡實驗篩選出ED大鼠[6]:大鼠頸部皮下注射APO(90 mg/kg)溶液后,放入安靜、昏暗房間的玻璃觀察箱中適應5 min,然后繼續(xù)觀察30 min,計時器測量1 800 s內大鼠的勃起次數(shù)和勃起潛伏期。陰莖勃起的表現(xiàn)為大鼠呈蹲位,陰莖體伸出并舔舐陰莖頭。勃起次數(shù)為大鼠注射APO后1 800 s內陰莖勃起的次數(shù);勃起潛伏期為注射APO后至第1次勃起的時間。實驗結果隨機分為ED組(n=8)、Sil組(n=8)。Sil組給予20 mg/kg西地那非灌胃 1次/天,持續(xù)14 d。

1.2.2 HE染色觀察大鼠主動脈的病理學變化:將主動脈放在4%多聚甲醛中固定48 h,包埋、切片,蘇木精染色4～5 min后,自來水沖洗,伊紅浸染20 s,脫水、透明、封片后光鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 Masson染色觀察大鼠主動脈的纖維化改變:制作石蠟切片后進行Masson染色,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察各組大鼠主動脈纖維化程度并拍照。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測大鼠主動脈中NLRP3和eNOS的表達:主動脈常規(guī)切片、脫蠟水化及抗原修復后,加入抗NLRP3(1∶300)一抗和抗內皮型-氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)(1∶500)一抗4 ℃孵育過夜。滴加二抗室溫孵育20 min;滴加DAB顯色,蘇木精復染,封片后光鏡下觀察并采集圖像,使用圖像分析軟件Image J進行結果分析。

1.2.5 RT-qPCR檢測大鼠主動脈中NLRP3、cas-pase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS mRNA表達水平:根據(jù)RNA提取試劑盒提取大鼠主動脈總RNA,按照試劑盒說明書進行反轉錄和擴增反應。根據(jù)所得Ct值計算2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測大鼠主動脈中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS 蛋白水平:將主動脈放入蛋白裂解液中裂解30 min后,所得上清液即為所提取的總蛋白質。根據(jù)BCA試劑盒的方法測定總蛋白質。按照每組30 μg上樣量進行電泳、轉膜、封閉后,加入抗NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶2 000)、IL-1β(1∶1 000)、GSDMD(1∶3 000)、eNOS(1∶3 000)、GAPDH(1∶6 000)一抗4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶8 000)室溫孵育,顯色并采集圖像后測量目的蛋白及內參蛋白的吸光度值并計算比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 勃起次數(shù)及勃起潛伏期變化

與對照組相比,ED組勃起次數(shù)降低,勃起潛伏期延長(P<0.05);與ED組相比,Sil組勃起次數(shù)升高,勃起潛伏期縮短(P<0.05)(表2)。

表2 干預期間大鼠勃起次數(shù)及潛伏期變化

2.2 主動脈組織形態(tài)變化及西地那非的干預作用

對照組大鼠主動脈管壁層次清晰,內膜表面光滑,結構完整,內皮細胞排列整齊;ED組主動脈管壁增厚且內膜表面粗糙,內皮細胞局部脫落,排列紊亂;Sil組大鼠主動脈內皮結構基本完整,內皮細胞局部脫落減少,排列較整齊(圖1)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil.

2.3 主動脈纖維化及西地那非的干預作用

與對照組相比,ED組大鼠主動脈中平滑肌纖維化增多;與ED組相比,Sil組纖維化減輕(P<0.05)(圖2)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil; 0.05 compared with control;0.05 compared with ED.

2.3 主動脈內皮功能變化

與對照組相比,ED組大鼠主動脈中eNOS mRNA降低;與ED組相比,Sil組大鼠主動脈中eNOS mRNA表達增高(P<0.05)(表3)。而eNOS主要分布在主動脈內皮細胞胞質中,與對照組相比,ED組大鼠主動脈中eNOS蛋白表達減少(圖3,4,表4);與ED組相比,Sil組大鼠主動脈中eNOS蛋白表達增高(P<0.05)(圖3,4,表4)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil; 0.05 compared with control;0.05 compared with ED.

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil.

表3 西地那非對大鼠主動脈組織中焦亡相關因子及eNOS mRNA表達的影響

表4 大鼠主動脈組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS蛋白Western blot檢測結果

2.4 主動脈中NLRP3/caspase-1焦亡相關因子mRNA表達及西地那非干預的作用

與對照組相比,ED組大鼠主動脈中NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β mRNA表達較高,eNOS mRNA表達較低(P<0.05);Sil組大鼠主動脈中NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β mRNA表達降低(P<0.05)(表3)。

2.5 主動脈中NLRP3/caspase-1焦亡相關蛋白表達及西地那非的干預作用

與對照組相比,ED組大鼠主動脈中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達升高,與ED組相比,Sil組大鼠主動脈中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達降低(圖4,表4)。

3 討論

陰莖的勃起是涉及血管、神經(jīng)、激素和心理因素之間的復雜作用下完成的血流動力學過程。炎性反應作為血管性疾病的核心機制,能導致ED。ED大鼠血清中IL-1β等炎性因子水平升高,導致海綿體受損進而引發(fā)ED[7]。此外,在ED小鼠陰莖海綿體中NLRP3、caspase-1和IL-1β表達也升高,引起細胞焦亡進而導致炎性反應[8],本研究也發(fā)現(xiàn)ED組大鼠主動脈血管組織焦亡相關因子和炎性因子IL-1β水平明顯升高,表明細胞焦亡能夠引起炎性反應,從而導致ED。同時也表明Sil促進ED大鼠主動脈血管組織中NLRP3/caspase-1通路蛋白的表達。作為治療ED的經(jīng)典藥物,本研究探究該藥可能通過抑制此通路改善ED大鼠炎性反應進而促進大鼠的勃起功能。

本研究發(fā)現(xiàn)ED大鼠主動脈內皮功能指標eNOS明顯降低,發(fā)生內皮功能障礙。在糖尿病ED小鼠中,內源性促炎細胞因子IL-1β表達顯著增高,而在使用抗炎藥物干預后,主動脈內皮功能得到明顯改善[9]。激活NLRP3炎性小體介導的細胞焦亡會進一步誘導血管內皮損傷,加劇ED[10]。在高膽固醇血癥誘導的冠心病模型小鼠中,NLRP3炎性小體的激活下調小鼠冠狀動脈eNOS和NO的表達,誘發(fā)內皮功能障礙[11],同時也發(fā)現(xiàn)沉默NLRP3炎性小體能降低人肺動脈內皮細胞的死亡,減少內皮損傷[12]。以上研究均表明焦亡在內皮功能中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),Sil 干預可抑制ED模型大鼠主動脈血管組織中NLRP3/caspase-1焦亡通路中相關因子的表達水平,并可以改善血管內皮功能,結果提示,Sil可能通過抑制此通路減輕ED大鼠內皮功能障礙,進而促進大鼠的勃起功能。

除了內皮功能障礙外,勃起組織和血管的纖維化也是導致ED的關鍵因素[13]。Sil除了能顯著降低男性血管性ED中促炎標志物的表達[14],并可改善肺血管擴張及纖維化程度,恢復肺功能[15]。通過靶向NLRP3炎性小體能治療心血管纖維化[16],本研究結果也發(fā)現(xiàn)主動脈纖維化可促進ED,再次驗證Sil可能通過IL-1β等炎性因子促進主動脈纖維化水平,并最終導致勃起功能障礙,表明Sil可通過改善纖維化來促進勃起功能的恢復。

綜上所述,在Sil干預后,能改善ED大鼠主動脈內皮功能和纖維化,降低炎性因子的表達,恢復大鼠勃起功能,這可能與焦亡介導的炎性反應有關。本研究通過體內實驗證明Sil改善ED大鼠的勃起功能,但這還需要通過體外實驗進一步研究來證實。