藥物基因多態(tài)性對替格瑞洛抗血小板聚集效果的影響

謝小云，黃愛文，李 莉，江 彥，蔡佳松 （.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院臨床藥學科, 福建 福州 35005；.滕州市中心人民醫(yī)院, 山東 滕州 77599）

急性冠脈綜合征(ACS)病理基礎是冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼而形成不同程度的阻塞性血栓，抗血小板治療是其治療的基礎，可降低患者血栓事件的發(fā)生率[1]。目前我國臨床上普遍使用的口服抗血小板藥物包括氯吡格雷和替格瑞洛，這類藥物通過抑制血小板表面的ADP P2Y12受體發(fā)揮作用。研究表明與氯吡格雷相比，替格瑞洛可降低心血管死亡的發(fā)生率且不會增加主要致命性出血的風險[2]。近年來國內(nèi)外相關指南將替格瑞洛推薦作為急性冠狀動脈綜合征抗血小板治療的一線用藥，尤其對非ST 段抬高型ACS 患者建議首選替格瑞洛聯(lián)合阿司匹林進行抗血小板治療[3-7]。

替格瑞洛雖不受CYP2C19基因多態(tài)性影響，但文獻報道與替格瑞洛轉運受體、作用靶點以及血小板膜受體相關的基因多態(tài)性（如SLCO1B1、UGT2B7、P2Y12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3等）可能會影響其某些藥動學參數(shù)以及藥效[8-13]。相關基因多態(tài)性是否會影響替格瑞洛在中國ACS 患者體內(nèi)的抗血小板效果尚不清楚。本研究收集ACS 患者病例，通過全外顯子測序法探討與替格瑞洛有關的轉運蛋白、作用靶點以及血小板膜表面受體相關編碼基因的多態(tài)性，分析基因多態(tài)性與替格瑞洛體內(nèi)抗血小板聚集效果的相關性，為替格瑞洛的臨床個體化用藥提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取2018 年3 月至12 月于福建省某三甲醫(yī)院給予替格瑞洛常規(guī)治療的ACS 患者。納入標準：①診斷為ACS 的患者；②年齡≥18 周歲，男女不限；③PCI 術后阿司匹林100 mg 一天一次、替格瑞洛90 mg 一天兩次雙聯(lián)抗血小板治療至少維持1 年；④入院后常規(guī)給予替格瑞洛抗血小板治療至少7 d；⑤同意簽署知情同意書。排除標準：①免疫缺陷性疾病病史，包括HIV 檢查結果陽性；②乙肝表面抗原（HBsAg）或丙肝檢查結果陽性；③長期使用CYP3A 誘導劑、治療窗狹窄的CYP3A 底物、CYP3A 抑制劑；④肝功能異常和腎功能異常；⑤收縮壓＞180 mmHg 或舒張壓＞110 mmHg；⑥存在以下情況：如一個月內(nèi)進行過大手術，患有中重度肝病，活動性出血，既往顱內(nèi)出血史，過去6 個月內(nèi)的消化道出血，超敏反應等。

用藥方案：入院后常規(guī)接受阿司匹林100 mg一天一次、替格瑞洛90 mg 一天兩次雙聯(lián)抗血小板治療。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣標本的采集、處理和貯存

采集：患者口服替格瑞洛至少7 d 后收集清晨空腹靜脈血樣2.7 ml，測定給藥后的ADP 血小板聚集率；與上述同一時間采集靜脈血樣4 ml 測定基因。

藥物基因組學（PG）血樣處理及保存：血樣采集后，若無法立即處理，可室溫放置8 h，或先置于4 ℃冰箱保存24 h；血樣離心條件：7 500 r/min，4 ℃，10 min。下層血細胞用滴管移至凍存管中，平均分裝成2 份（set 1 和set 2），貼PG 標簽。凍存管需標注研究對象信息，統(tǒng)一標注為藥物-患者PGset1/2 編號-時間點；凍存管保存于-70 ℃冰箱，待基因檢測。

藥物效應動力學（PD）血樣處理及保存：血樣采集后需在10 min～4 h 內(nèi)進行血小板聚集率檢測。

1.2.2 血小板聚集率的測定

提前制備好富血小板血漿（PRP）、貧血小板血漿（PPP）及ADP 誘導劑，放置于-20 ℃冰箱內(nèi)，實驗前5 min 復溶備用，每支僅使用1 次。通過LBYNJ4 血小板聚集儀（北京泰利康信科技有限公司）檢測血小板聚集率。

1.2.3 基因檢測

依照海普洛斯實驗標準處理流程，對收集的血樣進行質檢、核酸提取、文庫制備和上機測序。再依照海普洛斯數(shù)據(jù)分析標準處理流程，對原始數(shù)據(jù)進行質控，參考序列比對，去重復，檢測以及對變異結果進行下游分析。最后，利用卡方檢驗原理驗證哈迪-溫伯格平衡 (HWE)。P＞0.05 認為符合HWE。應用在線軟件SHEsis (http://analysis.bio-x.cn/my Analysis.php) 進行連鎖不平衡（LD）分析，D'＞0.8且r2＞0.8 提示兩位點間存在明確連鎖不平衡。

1.2.4 臨床資料記錄

①一般資料：性別、年齡、身高、體質量、BMI、吸煙史、飲酒史等；②患病類型：ST 段抬高型急性冠脈綜合征(STE-ACS)、非ST 段抬高型急性冠脈綜合征(NSTE-ACS)；③合并疾病：高血壓、糖尿病、高脂血癥等；④生化指標：血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、凝血四項、血脂等；⑤聯(lián)合用藥：他汀類（Statins）、β-受體拮抗劑(β-blocker)、血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、質子泵抑制劑(PPI)等。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 24.0 軟件；計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，計數(shù)資料數(shù)據(jù)用百分比表示；兩組間參數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間參數(shù)的比較采用單因素方差分析，若P＜0.05，認為存在顯著性差異；將單因素分析中P＜0.1 的變量進行多因素分析；采用調整混雜因素的線性回歸法預測影響替格瑞洛體內(nèi)抗血小板效果的獨立遺傳變量。

2 結果

2.1 人口統(tǒng)計學資料

本研究共納入符合要求的受試者75 例，63 例男性，12 例女性，平均年齡為（60.37±11.70）歲，平均體質量指數(shù)(BMI)值為（24.48±3.66）kg/m2。表1列出了75 例患者的患病類型、合并疾病以及合并用藥情況。

表1 75 例急性冠脈綜合征患者的臨床特征(n=75)

2.2 最大血小板聚集率分布情況

采用MAXADP（即ADP 誘導的最大血小板聚集率）反映替格瑞洛的抗血小板效果。當使用的誘導劑為5 μmol/L 的ADP 時，光學比濁法（LTA）檢測到的最大血小板聚集率的治療范圍為MAXADP＜50%，當MAXADP＞50%時提示血栓形成的風險升高[14]。

本研究入組患者最大血小板聚集率的分布情況如圖1 所示，結果顯示所有患者服用替格瑞洛后的最大血小板聚集率均在治療范圍之內(nèi)。經(jīng)KS 檢驗（Kolmogorov–Smirnov test），最大血小板聚集率基本符合正態(tài)分布（P＞0.05）。

圖1 最大血小板聚集率的頻率分布圖(P=0.072)

2.3 SNP 位點篩選

根據(jù)文獻報道確定與替格瑞洛有關的轉運蛋白、作用靶點以及血小板膜受體的編碼基因[8-13]（基 因 為SLCO1B1、UGT2B7、P2RY12、PEAR1、ITGA2B、ITGB3），在入組患者全外顯子測序的結果中篩選出以上相關編碼基因上所有的外顯子突變位點以及調控區(qū)域突變位點。本研究共篩選出18 個突變位點，全部突變均發(fā)生在外顯子區(qū)域。

2.4 各因素與替格瑞洛抗血小板聚集效果的相關性分析

2.4.1 臨床因素與替格瑞洛抗血小板效果的相關性分析

將患者各臨床因素與最大血小板聚集率進行單因素分析（見表2）。結果表明，與最大血小板聚集率顯著相關的是患病類型，STE-ACS 患者的最大血小板聚集率較NSTE-ACS患者高（11.73%±5.55%vs7.74%±6.35%，P=0.007）。這表明STEACS 患者服用替格瑞洛后抗血小板聚集效果較NSTE-ACS 患者差。

表2 臨床因素與LTA 測得的最大血小板聚集率的相關性

其余臨床因素與患者用藥后的最大血小板聚集率無顯著相關性（P＞0.05）。為找出更多可能的影響因素，將顯著性水平調整為P＜0.1，數(shù)據(jù)顯示有高血壓病史的ACS 患者平均最大血小板聚集率高于無高血壓病史者（10.40%±6.08%vs7.93%±6.44%，P=0.092），這表明合并高血壓有可能會對ACS 患者服用替格瑞洛后最大血小板聚集率產(chǎn)生一定的影響。

將血小板計數(shù)、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平、糖化血紅蛋白含量這四個臨床因素作為連續(xù)變量，與LTA 測得的最大血小板聚集率進行雙變量單因素相關分析，得到的結果見表3。由表3 可以看出，以上4 個臨床因素與LTA 檢測的最大血小板聚集率均不存在顯著相關性（P＞0.05）。

表3 其他臨床指標與LTA 測得的最大血小板聚集率之間的相關性

2.4.2 候選SNPs 各基因型與替格瑞洛抗血小板聚集效果的相關性分析

將入組的75 例患者按照相關突變位點的不同基因型進行分組分析，比較各SNP 相應基因型之間平均最大血小板聚集率的差異（見表4）。結果顯示18 個候選SNPs 中SLCO1B1rs2306283 會影響替格瑞洛抗血小板聚集的效果，至少攜帶一個突變基因G 的患者（AG 型+GG 型）平均最大血小板聚集率顯著低于攜帶野生純合子AA 型的患者（8.07%±6.17%vs13.88%±6.39%，P=0.042）。其余候選SNPs各基因型與替格瑞洛抗血小板聚集效果均無統(tǒng)計學相關性。這表明SLCO1B1rs2306283 G 等位基因可能會影響替格瑞洛在體內(nèi)的轉運，進而增強替格瑞洛在體內(nèi)的抗血小板聚集效果，具體機制有待進一步探究。

表4 SLCO1B1 rs2306283 與LTA 測得的最大血小板聚集率的相關性

2.4.3 影響替格瑞洛抗血小板聚集效果的獨立變量預測

將單因素相關性分析中得到的P＜0.1 的因素即高血壓、患病類型以及SLCO1B1rs2306283 G 等位基因納入多因素線性回歸模型中，對高血壓、患病類型進行調整，得到SLCO1B1rs2306283 G 等位基因對替格瑞洛抗血小板聚集效果的影響程度。具體結果見表5。

表5 基于3 個變量的最大血小板聚集率的多元線性回歸

從表5 可知STE-ACS、高血壓以及SLCO1B1rs2306283 G 等位基因對最大血小板聚集率影響依次減弱（|β|：0.235＞0.142＞0.125），但是三者均不會顯著影響患者服用替格瑞洛后的最大血小板聚集率（P＞0.05），因此，調整高血壓、患病類型這兩個混雜因素后，SLCO1B1rs230628 G 等位基因并不是影響替格瑞洛抗血小板聚集效果的獨立變量。

3 討論

全外顯子測序結果顯示在SLOC1B1基因外顯子區(qū)域檢測到3 個可信度較高的突變位點，分別是rs2306283、rs4149056 和rs2291075。

一項體外研究表明rs2306283 G 等位基因會降低OATP1B1 對利福平的轉運活性[15-16]。WEN 等[17]研究表明SLOC1B1388A＞G（rs2306283）單核苷酸多態(tài)性會引起健康中國志愿者匹伐他汀藥動學的顯著改變：AG+GG 組的Cmax、AUC0–48、AUC0–∞顯著高于AA 組。目前沒有文獻報道rs2306283單核苷酸多態(tài)性是否會影響替格瑞洛的藥動學，但本研究數(shù)據(jù)表明rs2306283 單核苷酸多態(tài)性會影響ACS 患者服用替格瑞洛后抗血小板聚集效果：AG+GG 組的血小板聚集率顯著低于AA 組，即AG+GG 組患者服用替格瑞洛后對血小板的抑制作用較強。因此，我們推測SLCO1B1 rs2306283 G 等位基因雖不是影響抗血小板聚集效果的獨立變量，但可能會影響替格瑞洛在體內(nèi)的轉運，而本研究沒有測定替格瑞洛的藥動學參數(shù)，無法確定上述推測，還需進一步研究。試驗結果是否會直接影響服用替格瑞洛患者的主要治療終點，還需對患者進行長期隨訪。

在高加索人群中進行的全基因組關聯(lián)分析表明rs4149056 與rs113681054 存在連鎖不平衡（LD）（r=0.871 8）致使OATP1B1 的轉運活性降低，繼而使替格瑞洛以及其活性產(chǎn)物血漿水平升高，但是對替格瑞洛治療期的療效或安全性沒有顯著影響[8]。然而，千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫顯示在103 名漢族受試者rs4149056 與rs113681054 表現(xiàn)出較低程度的LD（r= 0.380 8），并且rs113681054 以及rs4149056這兩個SNP 對中國健康年輕男性志愿者替格瑞洛的藥動學以及藥效學（PK/PD）沒有顯著影響[9]。雖然本研究顯示rs4149056 TT 型替格瑞洛抗血小板效果較CT 型差，但是不具有顯著性差別。

目前沒有文獻報道rs2291075 單核苷酸多態(tài)性會影響替格瑞洛的轉運。本研究也顯示rs2291075各基因型對血小板聚集率沒有影響。

綜上所述，替格瑞洛的抗血小板效果不受相關基因單核苷酸多態(tài)性的影響，這為不宜使用氯吡格雷的基因缺陷患者選擇替格瑞洛治療提供了參考。