鋅指轉錄因子在冠心病心力衰竭氣虛血瘀證患者血清中的表達及意義研究

張蕾，何建成，李小茜，沈琳，曹雪濱，王代明

1. 上海中醫(yī)藥大學，上海 201203

2. 河南科技大學第一附屬醫(yī)院（河南科技大學臨床醫(yī)學院），河南 洛陽 471003

3. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 201203

4. 中國人民解放軍252醫(yī)院，河北 保定 071000

5. 上海市公惠醫(yī)院，上海 201203

心力衰竭（HF）常見于多種心血管疾病終末期，發(fā)病率逐年攀升。盡管近年來新技術、新治療方法不斷出現，HF 的治療有了極大改善，但其死亡率仍居高不下[1]。中醫(yī)中藥防治本病的機制與方法得到廣泛關注，證候研究尤顯重要。本課題組前期研究發(fā)現，HF 的中醫(yī)病因病機以虛實夾雜為特點，氣虛血瘀證為其臨床最為常見的證候之一[2]。鋅指轉錄因子（GATA4）是調控心肌基因表達的重要轉錄因子，在心臟中高表達，是多種刺激和信號通路的下游效應因子，參與心肌肥厚、HF 的進程[3-4]。本研究在病證結合原則的指導下，選取HF 氣虛血瘀證為研究對象，通過測定血清樣本中GATA4 含量，綜合運用多種統(tǒng)計學分析方法，初步擬定本病氣虛血瘀證的診斷界值，旨在全面促進本病的證候標準化、規(guī)范化進程，為臨床辨證論治提供參考與依據。

1 臨床資料

1.1 診斷標準參考《中國心血管健康與疾病報告2021 概要》[1]中HF 的診斷標準；心功能分級標準按美國紐約心臟協會（NYHA）心功能分級[5]。

1.2 辨證標準參考《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[6]對心力衰竭氣虛血瘀證的辨證標準，符合下列主癥加次癥各2 項及以上。主癥：氣短/喘息、乏力、心悸。次癥：倦怠懶言，活動易勞累；自汗；語聲低微；面色/口唇紫暗。舌脈：舌質暗（或有瘀斑、瘀點或舌下脈絡迂曲青紫），苔薄白，脈沉、細、澀或虛無力。

1.3 納入標準符合HF 診斷標準，且以冠心病為原發(fā)病的HF；年齡18～85 歲；臨床資料齊全；簽署知情同意書。

1.4 排除標準合并急性心肌梗死、心源性休克、嚴重心律失常伴有血流動力學改變者；并發(fā)感染者；合并嚴重的肝功能不全；合并血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤者；妊娠或哺乳期婦女；精神病、傳染病患者。

1.5 一般資料觀察對象為2019 年12 月—2021 年6 月上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院心內科住院患者。根據納入、排除標準及HF 中醫(yī)證候診斷標準，選入HF 氣虛血瘀證患者30 例，選取30 例上海中醫(yī)藥大學教職工體檢人員作為健康對照組。本研究經上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2018LCSY447）。

2 研究方法

2.1 臨床資料收集與數據錄入記錄入組患者年齡、性別、基礎疾病、NYHA 心功能分級、左心室射血分數（LVEF）等臨床資料。采用雙人雙機獨立數據錄入整理的方式，再統(tǒng)一進行數據核對及邏輯檢查，找出錯誤并及時更正，如遇到意見不能統(tǒng)一的情況，通過聯系數據錄入者、調取原始病例等方式予以核查。

經過培訓的臨床醫(yī)師根據前期制定的納入、排除標準，對住院HF 患者進行篩選入組，由2 位或以上副主任醫(yī)師對入組的HF 患者進行中醫(yī)辨證分型復核，規(guī)范HF 患者臨床資料信息，協調處理資料信息及樣本采集過程中出現的特殊情況。

2.2 血清樣本采集和指標檢測方法入組患者于清晨空腹采靜脈血3 mL 置于EDTA 抗凝管中，4 ℃靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，吸取上清至離心管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。應用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清樣本中GATA4 含量。GATA4 試劑盒廠家及貨號：上海美軒生物科技有限公司，貨號：MEXN- H0832，測量范圍為250～8 000 pg/mL。具體實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

3 統(tǒng)計學方法

利用SPSS24.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計量資料需進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，非正態(tài)分布的計量資料用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示；計數資料用頻數（構成比）進行統(tǒng)計描述。數據符合正態(tài)分布且方差齊時，2 組均數比較用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布或方差不齊時，則采用Mann-WhitneyUtest 檢測。3 組及以上均數比較采用單因素方差分析ANOVA 檢驗，若P＜0.05 則采用LSD 檢驗進行兩兩比較。如數據不符合正態(tài)分布或方差不齊時，則采用Kruskal-WallisH檢驗。應用Pearman、Spearman 相關分析方法分析鈣調磷酸酶（CaN）與B 型鈉尿肽（BNP）、NYHA 心功能分級、LVEF 的相關性。符合正態(tài)分布的計量資料采用Pearman 相關分析，非正態(tài)分布的計量資料或等級資料采用Spearman 相關分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

采用受試者工作特征曲線（ROC）確定證候的診斷閾值。以敏感度為縱軸，1-特異性為橫軸，繪制HF氣滯血瘀證的ROC 曲線，計算曲線下面積（AUC）來判斷診斷價值。結合ROC 曲線下面積，依據Youden指數最大，即（敏感度+特異性-1）達到最大時，所對應的值為該證候的診斷界值。

4 研究結果

4.1 一般資料比較見表1。HF 氣滯血瘀證患者中25 例有冠心病，20 例有高血壓病，7 例有糖尿病，還有3 例高血脂癥。健康對照組和HF 氣虛血瘀證組在年齡、性別、舒張壓上，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但HF 氣虛血瘀證組收縮壓、心率高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 一般資料比較

4.2 GATA4 在HF 氣虛血瘀證組患者血清中的表達見表2、表3。與健康對照組比較，HF 氣虛血瘀證組患者血清中GATA4 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步檢測發(fā)現，隨NYHA 心功能分級的增加，HF 氣虛血瘀證組患者血清中GATA4 含量逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 2 組GATA4 蛋白含量比較（）pg/mL

表2 2 組GATA4 蛋白含量比較（）pg/mL

注：①與健康對照組比較，P＜0.05

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表3 NYHA 心功能分級GATA4 蛋白含量比較（） pg/mL

表3 NYHA 心功能分級GATA4 蛋白含量比較（） pg/mL

注：①與Ⅱ級比較，P＜0.05；②與Ⅲ級比較，P＜0.05

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4.3 GATA4 與NYHA 心功能分級、BNP、LVEF關系HF 中GATA4 與NYHA 心功能分級呈正相關性（r=0.914，P＜0.001），與BNP 含量呈正相關性（r=0.697，P＜0.001），與LVEF 水平呈負相關性（r=-0.592，P=0.001）。

4.4 GATA4 對HF 氣虛血瘀證的診斷界值見圖1。本研究繪制ROC 曲線初步擬探討GATA4 對HF 虛血瘀證的診斷界值，AUC 為0.92，95%CI[0.83，1.00]（P＜0.001），臨界值為0.90，界值為3 777.49 pg/mL，敏感度為90%，特異性為100%。

圖1 GATA4 診斷HF 氣虛血瘀證的ROC 曲線

5 討論

HF 屬中醫(yī)心悸、水腫、喘證、胸痹心痛等疾病范疇。中醫(yī)藥在HF 的臨床治療上積累了豐富的經驗，在緩解癥狀、改善心功能、減輕西藥副作用以及提高生活質量等方面均發(fā)揮重要作用。辨證論治是取得臨床療效的關鍵，證候研究是中醫(yī)學的重點與難點，亦是研究取得突破性進展的關鍵所在。證候的診斷標準是甄別證候的基本準則，更是辨證治療的基礎與保障。本課題組前期研究發(fā)現，本病病機為本虛標實，虛實夾雜，本虛以氣虛為主，標實常見血瘀[2，7]。氣虛進一步發(fā)展為氣陰兩虛、陽氣虧虛、陽氣虛脫；血瘀證兼水濕停滯、痰飲內阻，虛實交錯多變，演變?yōu)槎喾N證候。氣虛血瘀是HF 發(fā)生發(fā)展始動因素，并貫穿于本病始終，是臨床常見、多發(fā)證型之一。

GATA4 是GATA 家族一員，是廣泛存在于脊椎動物中的鋅指蛋白轉錄因子。GATA4 在心臟高表達，參與心臟發(fā)育和生長的整個過程，在胚胎期心臟發(fā)育、心肌纖維化、心肌肥厚和心肌重構中發(fā)揮重要調控作用，是調節(jié)心臟的特異性基因[3]。GATA4是鈣調磷酸神經激酶-活化的T 細胞核因子3（CaNNFAT3）、有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、異丙腎上腺素激活胞外信號調節(jié)激酶（ERK）等多種心臟信號轉導通路的下游效應因子，在HF 發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。以CaN-NFAT3 通路為例，受神經激素如血管緊張素Ⅱ、內皮素Ⅰ刺激，心肌細胞內游離Ca2+濃度升高，CaN 活化，在CaN 調節(jié)下，活化T細胞核因子（NFAT）發(fā)生脫磷酸，并由細胞質轉移到細胞核，但由于NFAT 在細胞核內與DNA 結合力較弱，需在細胞核內的其他轉錄因子GATA4 協助下形成共激活因子復合體，提高與DNA 親和力活化過程，從而發(fā)揮其生理效應[8-9]。

本研究結果顯示，HF 氣虛血瘀證患者血清中GATA4 的含量明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義。進一步分析發(fā)現，隨NYHA 心功能級別的增加，GATA4 水平呈上升趨勢；相關性分析結果提示GATA4 與心功能分級、BNP 關聯密切，且呈正相關，提示GATA4 可反映HF 病情輕重程度，為本病中醫(yī)證候輕重程度的判斷提供一定參考。這與國內一些學者研究結果一致，胡厚祥[10]收集39 例因瓣膜性心臟病進行二尖瓣置換術HF 患者和38 例健康對照者，采用免疫沉淀法測心肌組織GATA4 蛋白含量，結果顯示HF 患者心肌組織GATA4 蛋白含量明顯高于健康對照者，且隨心功能惡化，GATA4 蛋白表達逐漸增加，同樣的研究結論也見于楊永健等[11]的報道。研究報道126 例缺血性心肌病患者血清中GATA4、心肌肥厚標志物血清肌球蛋白重鏈（MHC）蛋白水平均明顯高于健康對照組，左心室質量及左心室質量指數亦明顯增高，左室射血分數下降，提示左心功能下降，推測GATA4 作為轉錄因子可能參與了心肌缺血所致的心肌重構[12]。亦有研究證實中醫(yī)中藥可通過MAPK/ERK/ GATA4 通路，抑制心室肥厚，改善心肌重構，緩解HF 癥狀[13-14]。

明確診斷閾值是證候診斷標準化、量化研究的重要內容之一，ROC 曲線作為經典的醫(yī)學診斷試驗性能的評價方法應用廣泛[15]。結合AUC 來判斷其診斷價值，AUC 值在0.5～0.7 范圍時診斷價值偏低，在0.7～0.9 范圍時診斷價值中等，大于0.9 時具有較高的診斷價值[16]。本研究繪制ROC 曲線初步擬定HF氣虛血瘀證血清GATA4 的診斷界值為3 777.49 pg/mL，此時AUC 為0.92，敏感度為90%，特異性為100%?；诖?，筆者認為血清GATA4 對HF 氣虛血瘀證的診斷價值較高，此時診斷試驗的敏感度和特異性較高，且誤診率和漏診率較低，可為本病證提供客觀化、量化的參考和依據。

本研究樣本量較少，尚需大樣本臨床研究證實或動物實驗進一步驗證。除氣虛血瘀證，在其他不同證候中，GATA4 表達及變化也值得進一步探索，才能更加全面地揭示HF 常見中醫(yī)證候的內在物質基礎，推進本病中醫(yī)證候標準化、客觀化研究。