靶向溶酶體治療腫瘤的策略探討

盛基堯， 李泳陟， 張學(xué)文

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 肝膽胰外科， 吉林 長春 130000）

化療是腫瘤治療的重要手段之一，然而隨著癌細(xì)胞基因組的不斷更新和化學(xué)藥物耐藥性的增加，很多抗癌藥物的療效正在逐漸下降[1]。通過基礎(chǔ)研究，人們發(fā)現(xiàn)了許多與化療耐藥相關(guān)的信號通路，并期待通過靶向這些通路來逆轉(zhuǎn)化療耐藥，取得一定的臨床獲益[2-4]。除此之外，越來越多的研究將化療耐藥聚焦在細(xì)胞器水平。以化療藥物順鉑為例，人們發(fā)現(xiàn)，線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均參與腫瘤細(xì)胞對順鉑的抵抗作用[5-7]。其中，溶酶體作為細(xì)胞分解代謝的平臺和樞紐，在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移潛力和耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用[7]。相關(guān)研究表明，可以通過破壞溶酶體膜的完整性，誘導(dǎo)溶酶體膜透化（lysosomal membrane permeabilization,LMP），釋放螯合于溶酶體內(nèi)的順鉑，從而增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用，減輕腫瘤細(xì)胞對順鉑的抵抗[8]。除此之外，LMP 還可以釋放溶酶體內(nèi)部的水解酶和酸性物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞成分的分解和細(xì)胞壞死。這種細(xì)胞死亡方式叫作溶酶體依賴性細(xì)胞死亡（lysosome dependent cell death, LDCD）[9]。綜上所述，靶向癌細(xì)胞的溶酶體是一種十分有前途的抗腫瘤策略。納米藥物被認(rèn)為是癌癥治療最有前途的工具之一。相較于常規(guī)化療藥物，納米藥物不僅有更好的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征，更有著良好的靶向性和多功能性[10]。目前，已經(jīng)開發(fā)出了眾多靶向腫瘤溶酶體的納米藥物，本文將著重介紹納米藥物誘導(dǎo)發(fā)生LMP 的策略。

1 LMP與腫瘤死亡

溶酶體是單膜細(xì)胞器，其主要功能是降解來自細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)[11]。溶酶體含有多種水解酶，包括蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、糖苷酶等，這些酶類在相對較低的pH 條件下顯示出最佳的活性[12-13]。溶酶體的酸性環(huán)境（pH≤ 5）由V 型ATPase 維持，其將氫離子從細(xì)胞質(zhì)泵入溶酶體腔內(nèi)[14]。同時，溶酶體膜上有特定的膜蛋白如LAMP-1 和LAMP-2，這些高度糖基化的蛋白能夠形成保護(hù)性的糖萼，所以才能使溶酶體膜免受酸性水解酶的影響[15-16]。

在發(fā)現(xiàn)溶酶體后不久，有研究提出了“自殺袋假說”，該假說認(rèn)為，細(xì)胞破壞和死亡是由溶酶體膜不穩(wěn)定后，溶酶體水解酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中引起的[17-18]。盡管這一觀點曾受到作者本人的質(zhì)疑，但現(xiàn)在看來，溶酶體在生理和病理條件下的細(xì)胞凋亡和死亡中都起著關(guān)鍵作用。最常見的涉及溶酶體的細(xì)胞死亡途徑叫作LDCD。這種細(xì)胞死亡方式的主要特征是LMP。LMP 的定義是溶酶體膜受到細(xì)胞內(nèi)外因素的刺激發(fā)生的膜損傷，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中[19-20]。其中，較重的LMP 可以導(dǎo)致組織蛋白酶的部分和選擇性釋放，如組織蛋白酶B 和D，啟動了導(dǎo)致細(xì)胞死亡的級聯(lián)反應(yīng)[21-24]。程度更加嚴(yán)重的LMP 直接導(dǎo)致溶酶體破裂，細(xì)胞質(zhì)酸性增加，細(xì)胞成分不受控制地分解，細(xì)胞壞死和死亡[25]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的溶酶體體積更大、數(shù)量更多，因此也更脆弱且容易破裂[26]。此外，腫瘤細(xì)胞的溶酶體內(nèi)酶的水平也更高[27]。因此，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞溶酶體的形態(tài)和生理變化更有利于誘導(dǎo)LMP 的發(fā)生。隨著納米科技的發(fā)展，人們已經(jīng)研究開發(fā)出了許多靶向于溶酶體的納米藥物，并且已經(jīng)展露出有效的抗腫瘤作用和很少的副作用。本文將介紹這些納米藥物是如何靶向溶酶體并且誘導(dǎo)LMP 和LDCD的發(fā)生。

2 納米藥物靶向溶酶體

誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生LMP 首先需要將納米藥物準(zhǔn)確的靶向于溶酶體。目前的溶酶體靶向策略可以根據(jù)材料的結(jié)構(gòu)分為兩類：基于小分子和金屬絡(luò)合物的直接靶向策略和依靠納米材料治療平臺的間接靶向策略。直接靶向策略常用的靶向集團(tuán)大多數(shù)是胺類，胺類的弱堿性使其本身很容易在溶酶體的酸性環(huán)境中聚集。這樣就可以使納米藥物被細(xì)胞內(nèi)吞后，在溶酶體酸度作用下，驅(qū)動到溶酶體內(nèi)部[28]。間接靶向策略主要依賴于新型納米材料的構(gòu)建，可以設(shè)計增加這些納米藥物本身的內(nèi)在抗腫瘤功效，或者利用其作為納米載體將常規(guī)治療藥物運輸?shù)饺苊阁w中，例如光動力療法中的光敏劑、光熱療法中的光熱劑、化療藥物、放療中的核素、免疫檢查點抑制劑等[29]。

3 納米藥物誘導(dǎo)LMP

3.1 磁場機(jī)械力和磁熱療法

磁場具有無限的組織穿透深度且副作用較小。許多抗腫瘤磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles,MNPs）由于具有良好的生物相容性、豐富的原料和突出的生物效應(yīng)而被開發(fā)出來，特別是由氧化鐵制成的磁性納米顆粒[30]。

SHEN 等[31]合成了摻雜鋅的氧化鐵納米顆粒，并用表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）對其進(jìn)行修飾，用于靶向癌細(xì)胞。在15 Hz 和40 mT的低頻旋轉(zhuǎn)磁場下，內(nèi)化的EGF-MNPs 形成較長的聚集體，并產(chǎn)生數(shù)百個公稱壓力（pN）的磁機(jī)械應(yīng)力，顯著破壞了溶酶體膜的完整性，使溶酶體水解酶滲漏到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡和壞死。LUNOV 等[32]合成了羧右旋糖酐包被的超順磁性氧化鐵納米顆粒，該納米顆粒能夠聚集于肝癌細(xì)胞的溶酶體中，并通過磁機(jī)械應(yīng)力（≥ 700 pN）嚴(yán)重?fù)p傷溶酶體，誘導(dǎo)組織蛋白酶B 滲漏，并最終使暴露在高強(qiáng)度（8 T）、短脈寬（≈ 15 μs）脈沖磁場下的細(xì)胞死亡。氧化鐵磁性納米顆?？梢栽谙鄬^低的磁場下產(chǎn)生較大的力，以物理機(jī)械力的方式破壞溶酶體膜甚至質(zhì)膜。這種低頻旋轉(zhuǎn)磁場對人體幾乎沒有副作用，并且可以大大降低儀器的成本。

除利用磁場力的作用機(jī)械性破壞溶酶體膜，還可以利用納米粒子在磁場下的產(chǎn)熱作用誘導(dǎo)LMP——溶酶體內(nèi)磁場熱療。PUCCI 等[33]構(gòu)建了Angiopep-2 功能化的脂基磁性納米載體（Ang-LMNVs），Angiopep-2 可以靶向在膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low density lipoprotein receptor-associated protein 1, LRP1），并促進(jìn)Ang-LMNVs 透過血腦屏障。將Ang-LMNVs 置于交變磁場中，通過溶酶體內(nèi)磁場熱療的方法誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生LMP 和死亡。與提高腫瘤整體溫度的磁熱療法相比，溶酶體內(nèi)磁場熱療只加熱溶酶體內(nèi)的納米顆粒，具有更高的生物安全性和環(huán)保性。

值得注意的是，利用磁場治療的前提是能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶的存在，才能特異性地使磁場作用于腫瘤。因此，磁場療法不能很好地治療尚未發(fā)現(xiàn)的腫瘤病灶。

3.2 光熱和光動力療法

光動力療法（photodynamic therapy, PDT）和光熱療法（photothermal therapy, PTT）是基于光化學(xué)的非侵入性醫(yī)療技術(shù)，用于治療實體瘤等多種疾病[34-35]。

PDT 的原理是積聚在腫瘤細(xì)胞中的光敏劑被適當(dāng)波長的光激發(fā)，并將光子能量轉(zhuǎn)移到生物基質(zhì)上以產(chǎn)生活性氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性[35-36]。LI 等[37]報道了一種負(fù)載光敏劑二氫卟吩e6（Ce6）/葉酸（FA）的支鏈聚乙烯亞胺-聚乙二醇化鈰納米顆粒（PPCNPs-Ce6/FA）的多功能藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)被開發(fā)用于PDT 靶向治療耐藥的乳腺癌。光敏劑二氫卟吩e6 在納米載體的遞送和葉酸的靶向作用下被細(xì)胞攝取，隨后在溶酶體中積累。PPCNPs-Ce6/FA 在近紅外照射（660 nm）后產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致p-糖蛋白表達(dá)降低并發(fā)生LMP。即使超低劑量PPCNPs-Ce6/FA 也能對細(xì)胞產(chǎn)生良好的光毒性。

PTT 通常是用光熱劑將照射時的光子能轉(zhuǎn)化為熱能，從而通過熱療殺死癌細(xì)胞。LI 等[38]制備了聚乙二醇修飾的聚多巴胺修飾金納米星（AuNSs@PDA-PEG）納米粒子，AuNSs@PDA-PEG 納米粒子具有較強(qiáng)的近紅外吸光度和良好的光穩(wěn)定性，在808 nm 激光照射下表現(xiàn)出良好的光熱殺傷性能；實驗表明，AuNSs@PDA-PEG 納米粒子作用后的HeLa 細(xì)胞在近紅外激光照射下可被嚴(yán)重破壞，其誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的機(jī)制涉及線粒體功能障礙、LMP 等。

由于光的物理性質(zhì)直接決定了治療的深度和效果，因此光療法無法有效穿透體積較大的腫瘤。除此之外，腫瘤微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，也限制了光動力療法的效果。

3.3 化學(xué)動力學(xué)方法

高濃度的活性氧可以與溶酶體膜中的不飽和脂質(zhì)反應(yīng)以觸發(fā)LMP[39]。而化學(xué)動力學(xué)療法（chemodynamic therapy, CDT）可以利用芬頓型反應(yīng)產(chǎn)生高度細(xì)胞毒性的羥基自由基（·OH），其是活性最高的活性氧[40-41]。CDT 只依賴于過氧化氫H2O2和催化劑，不需要氧氣O2，也沒有外部能量輸入。這種獨特的活性氧生成模式使CDT 能夠規(guī)避腫瘤光動力治療中缺氧相關(guān)的抵抗和光的有限穿透深度的問題[42-43]。

銅基納米顆粒作為芬頓反應(yīng)催化劑可用于酸性環(huán)境，并且比傳統(tǒng)的黑色金屬材料具有更高的催化速率[44]。LIN 等[45]提出在具備氫氧根離子（OH-）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的條件下，通過H2O2和Cu2+結(jié)合來制備過氧化銅（CP）納米粒子。當(dāng)CP 進(jìn)入癌細(xì)胞溶酶體后，在酸性條件下可水解為芬頓反應(yīng)催化劑Cu2+和H2O2，分解產(chǎn)物之間發(fā)生芬頓反應(yīng)，隨后產(chǎn)生高毒性的·OH，進(jìn)而發(fā)生LMP 介導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡。體內(nèi)外實驗均證實了CP 納米粒子的抗癌作用。該方法可以為CDT 提供大量的外源性H2O2，這對維持后續(xù)的LMP 過程至關(guān)重要。

為了讓銅基納米可以長時間存在于溶酶體中，增加LMP 程度，DENG 等[46]制備了一系列具有不同pKa 的過氧化銅納米藥物；與具有高pKa 的過氧化銅納米藥物相比，具有低pKa（5.2～6.2）的過氧化銅納米藥物在溶酶體中的停留時間更長，數(shù)量更多，并且能增加溶酶體中的活性氧水平和LMP 程度。

除銅基顆粒外，ARATHI 等[47]合成了L-半胱氨酸封蓋的氧化鋅納米顆粒，并將其作用于A549 細(xì)胞，實驗結(jié)果表明，L-半胱氨酸封蓋的氧化鋅納米顆粒處理后可誘導(dǎo)活性氧生成、降低溶酶體完整性、增加肌動蛋白絲縮聚和組織蛋白酶泄漏，并呈劑量依賴性。

CDT 同樣也存在著不可忽視的問題，因為許多炎癥部位有較高濃度的過氧化氫，因此，CDT 可能會非特異性地引起炎癥部位的LMP[48]。

3.4 納米藥物聚集增加滲透壓

由于癌細(xì)胞的溶酶體體積更大，更容易受到滲透壓的影響，由此出現(xiàn)了可以誘導(dǎo)溶酶體滲透壓差或引起溶酶體形態(tài)變化的納米藥物。

BORKOWSKA 等[49]開發(fā)了一系列金納米顆粒[（+/-）NPs]，用帶正電荷的N，N，N-三甲基氯化銨（TMA）和帶負(fù)電荷的11-巰基十一烷酸（MUA）以不同的比例修飾，基于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間溶酶體pH 的差異，以特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的LMP；（+/-）TMA/MUA 比率為80∶20 的NP 在癌細(xì)胞表面聚集，并通過內(nèi)吞作用逐漸積聚在內(nèi)體中，然后轉(zhuǎn)運到溶酶體，在溶酶體內(nèi)進(jìn)一步組裝成有序的（+/-）NP 聚集體。這些（+/-）NPs（TMA∶MUA = 80∶20）的粒徑僅為5.3 nm，而在癌癥溶酶體中可形成直徑＞ 2 μm的聚集體，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的LMP；相反，在正常細(xì)胞中，（+/-）NPs 聚集是有限的，并且其可以通過胞吐作用被排到細(xì)胞外，對正常細(xì)胞幾乎沒有傷害。

除納米藥物本身的聚集可以引起溶酶體腫脹，DENG 等[50]還設(shè)計了一種可以由H＋觸發(fā)生成氣體的納米系統(tǒng)（BGNSs@pDA-FA）；該系統(tǒng)由中空的二氧化硅納米顆粒裝載阿霉素，再用聚多巴胺進(jìn)行包被，最后再將葉酸錨定在納米系統(tǒng)上；BGNSs@pDAFA 通過葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被癌細(xì)胞內(nèi)化，在溶酶體的酸性環(huán)境下產(chǎn)生二氧化碳?xì)馀荩谷苊阁w腫脹，提高溶酶體膜通透性，隨后細(xì)胞死亡。

3.5 改變?nèi)苊阁w內(nèi)pH環(huán)境

溶酶體內(nèi)水解酶的活性依賴于溶酶體內(nèi)的低pH 環(huán)境，而一些納米顆粒通過改變?nèi)苊阁wpH 環(huán)境，導(dǎo)致溶酶體受損。WU 等[51]發(fā)現(xiàn)了來自速溶咖啡的熒光納米顆粒對正常大鼠腎和Caco-2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，證明了內(nèi)化的熒光納米顆?？梢栽黾尤苊阁wpH 值，降低溶酶體酶活性，導(dǎo)致溶酶體功能障礙，同時也使受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和受體相互作用蛋白激酶3（RIPK3）在溶酶體中積累；結(jié)果表明，速溶咖啡中的熒光納米顆?？烧T導(dǎo)LMP 并通過壞死性凋亡放大了死亡信號。然而，熒光納米顆粒的體內(nèi)作用有待進(jìn)一步研究，對人體的毒性作用尚不清楚。

3.6 影響溶酶體膜鞘磷脂代謝

溶酶體膜的脂質(zhì)成分包括鞘磷脂和膽固醇，增加膽固醇水平可保護(hù)溶酶體免受LMP 的侵害，而鞘磷脂的水解可以使細(xì)胞對LMP 更加敏感[52]。鞘脂活化蛋白皂苷C（SapC）-二油酰磷脂酰絲氨酸（DOPS）是SapC 和DOPS 偶聯(lián)形成的納米囊泡。WOJTON 等[53]提出SapC-DOPS 治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胰腺癌細(xì)胞可以導(dǎo)致溶酶體膜上的鞘磷脂分解代謝為神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為鞘氨醇，導(dǎo)致LMP和溶酶體功能障礙，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

4 總結(jié)與展望

鑒于癌細(xì)胞中溶酶體生物學(xué)的改變，靶向溶酶體是一種非常有前途的抗腫瘤策略。結(jié)合納米藥物的優(yōu)點，設(shè)計靶向溶酶體的納米材料實驗越來越多。然而，在誘導(dǎo)發(fā)生LMP 的過程中仍然有一些需要解決的問題：例如熱休克蛋白70（HSP70）在惡性腫瘤中過表達(dá)，而HSP70 位于溶酶體膜上，可以保護(hù)溶酶體膜免受一定程度的刺激[54]。同時細(xì)胞內(nèi)存在多種溶酶體膜修復(fù)途徑，包括轉(zhuǎn)運必需內(nèi)體分選復(fù)合體途徑，磷脂酰肌醇介導(dǎo)的膜交互和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑等[55-56]。這些因素都可以有效降低LMP 程度，從而抑制細(xì)胞死亡。因此如何利用溶酶體的保護(hù)機(jī)制，最大限度地使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆的LDCD 將會是未來研究的主要方向。

納米材料是治療癌癥的有前途的工具，但仍有許多關(guān)鍵問題需要解決，例如納米材料的穩(wěn)定性、多重耐藥的發(fā)展和癌細(xì)胞功能異常會影響納米藥物的靶向性，金屬基納米顆粒的代謝毒性問題，納米藥物系統(tǒng)在體內(nèi)的定位、生物分布、生物相容性和功效等。納米藥物治療腫瘤還需要大量的臨床前和臨床水平上的研究。