虛擬篩選結合活性驗證發(fā)現(xiàn)新型SHP2催化位點抑制劑

黎婭琳,任吉霞

(聊城大學 生命科學學院,山東 聊城 252059)

1 引言

SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosinephosphatase-2)由PTPN11基因編碼,屬于非受體蛋白酪氨酸磷酸酶。完整的SHP2蛋白晶體結構顯示[1],在本底狀態(tài)下,SHP2通過N-SH2域和催化位點PTP域間形成分子內相互作用而處于一種自抑制的失活構象;在生長因子、細胞因子等外界環(huán)境因子的刺激下,SHP2的失活狀態(tài)被打破,變成有活性的開放構象。研究表明,SHP2參與多種信號通路,SHP2的活化是Ras/ERK1/2通路完全激活所必需的,此外,SHP2活化PI3K/AKT,JAK/STAT,JNK和NF-κB信號通路,進而調控細胞增殖、分化、細胞周期維持和遷移等生理功能[2]。SHP2還通過其N-SH2結構域結合免疫檢查點蛋白PD-1的磷酸酪氨酸基序(pTyr motif),參與調節(jié) T 細胞的活性[3]。綜上SHP2是細胞中多種信號通路的重要信號調節(jié)分子,同時SHP2還是控制細胞因子產(chǎn)生及免疫細胞反應的重要調控因子。

所以,當PTPN11基因發(fā)生突變而表達異常時,將導致細胞增殖分化異常,引起多種疾病的發(fā)生發(fā)展。近幾年大量遺傳學和臨床研究表明,在多種惡性血液病和實體瘤中都存在SHP2突變活化或過表達[4]。例如,生殖系獲得功能性PTPN11基因突變會導致Noonan 綜合征(40%～50%),該疾病是一種可增加惡性腫瘤風險的常染色體顯性遺傳發(fā)育障礙癥[5]。SHP2高活化突變出現(xiàn)于幼年慢性骨髓單核細胞性白血病(JMML,35%),急性B淋巴細胞白血病(7%)和急性髓性白血病(4%)[6,7]。白血病相關PTPN11E76K突變會促進骨髓增殖性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。SHP2過表達在多種實體瘤中非常常見,例如:在大約55%原發(fā)性乳腺癌中SHP2過表達,并會導致預后不良[9]。最近Hana Algül課題組發(fā)現(xiàn)KRAS突變驅動的胰腺導管腺癌和非小細胞肺癌依賴于SHP2[10]。據(jù)Rene Bernards課題組報道SHP2是KRAS突變型非小細胞肺癌所必需的[11]。除此之外,近期研究表明 SHP2與腫瘤免疫調節(jié)密切相關,例如,Zhao等研究發(fā)現(xiàn)[12],抑制SHP2活性可激活抗腫瘤免疫力,并可以與阻斷PD-1起協(xié)同作用,這為腫瘤免疫治療提供了新的思路。以上研究均提示SHP2是一個抗腫瘤新靶標。靶向抑制SHP2可雙管齊下,既減緩癌細胞生長,同時也調節(jié)免疫功能以激活其抗腫瘤作用。

綜上,研發(fā)SHP2小分子抑制劑,對靶向SHP2的抗腫瘤治療及其分子機制研究都具有十分重要的意義。目前已經(jīng)有一些 SHP2小分子抑制劑被報道,這些小分子抑制劑主要分為兩大類:催化位點抑制劑和變構位點抑制劑[13,14]。張仲寅課題組開發(fā)了多個SHP2催化位點抑制劑[15-17],最近,國內學者王文龍課題組[18]和王潤玲課題組[19,20]也發(fā)現(xiàn)多個新型SHP2催化位點抑制劑。除此,還有4款小分子變構抑制劑進入臨床研究[21,22]。

計算機輔助藥物設計(computer aided drug design,CADD)技術已在藥物研發(fā)中得到廣泛應用,據(jù)估計 CADD 使得新藥研發(fā)周期縮短了0.9 年,研發(fā)費用降低 1.3億美元[23]。根據(jù)藥物作用靶點三維結構是否已知,CADD 大概可以分為基于配體的藥物設計(如藥效團模型)和基于結構(如分子對接)的藥物設計。研究證明三維藥效團模型和分子對接技術的聯(lián)合應用可以縮短大型化合物數(shù)據(jù)庫虛擬篩選的時間,并可提高命中率[24]。虛擬篩選獲得化合物的活性基本上在 μmol/L 水平,有少量的化合物達到 nmol/L 水平,這一活性水平的化合物可以作為先導化合物進行結構改造,以獲得活性高的類藥性化合物[25]。計算機輔助藥物分子設計作為創(chuàng)新藥物研究的新方法和新技術,已經(jīng)成為一種實用化工具,加入到了創(chuàng)新藥物研究的工作流程中,成為現(xiàn)代藥物研發(fā)的核心技術之一。

本研究使用DS軟件構建SHP2催化位點抑制劑和非抑制劑的貝葉斯分類模型,抑制劑的3D-QSAR藥效團模型,利用貝葉斯分類模型對大型商業(yè)數(shù)據(jù)庫進行篩選,預測陽性化合物再由藥效團進行篩選,通過兩輪篩選的化合物利用分子對接技術對接到SHP2催化活性位點,通過分析對接結果選出潛在活性化合物,再從公司購買化合物實體,進行酶水平抑制活性檢測,最終得到3個具有一定潛在選擇性的SHP2新型抑制劑。并通過分析活性最高化合物和藥效團匹配和分子對接結果,闡明化合物起抑制作用的機制。

2 材料和方法

2.1 搜集SHP2催化位點小分子抑制劑

從BindingDB數(shù)據(jù)庫下載已報導的SHP2小分子抑制劑的SDF文件[26],利用Discovery Studio 3.1(DS 3.1)打開文件,根據(jù)文件中提供的每個化合物的信息,刪除非活性位點抑制劑。利用DS 3.1的“Prepare Ligands”模塊對剩余SHP2催化位點小分子抑制劑進行去重處理;將去重處理后的所有SHP2小分子抑制劑按照活性IC50進行排序,規(guī)定IC50< 20 μmol/L為SHP2的抑制劑,添加標注為1,IC50> 20 μmol/L為非抑制劑,添加標注為-1。

2.2 構建SHP2催化位點小分子抑制和非抑制劑二分類貝葉斯模型

利用DS 3.1的“Generate Training and Test Data”模塊,構建訓練集和測試集,將注有標記的SHP2催化活性位點抑制劑作為輸入化合物,“Split Method”參數(shù)設置為“Random”,“Training Set Percentage”參數(shù)設置為80。利用DS 3.1中“Create Bayesian Model”模塊,以生成的訓練集和測試集化合物作為輸入,構建貝葉斯模型,設置“Calculate Properties”時,先確定所用分子指紋的類型,然后將確定的分子指紋和常見的幾種分子描述符組合進行模型構建。為確定關鍵分子描述符,采取逐一排查法,最終確定分子指紋和分子描述符的最優(yōu)組合。

2.3 構建SHP2催化位點小分子抑制劑3D-QSAR藥效團

2.3.1 訓練集化合物的選取。藥效團建模過程中,訓練集分子的挑選對模型的構建具有非常重要的作用。利用DS3.1構建3D-QSAR藥效團模型對訓練集分子有如下要求[27]:(1)18-25個結構多樣性的化合物,為保證結果具有統(tǒng)計學意義,化合物分子數(shù)目不得低于15個。(2)化合物活性跨度至少為4個數(shù)量級,每個數(shù)量級至少有3個化合物。(3)結構相似的化合物活性至少相差一個數(shù)量級,有相似活性的化合物結構必須不同。(4)所有化合物提供的信息不得冗余。根據(jù)這4條要求,從搜集的SHP2催化位點抑制劑中選擇16個化合物構成訓練集。

2.3.2 3D-QSAR藥效團的構建。利用DS 3.1中的“3D QSAR Pharmacophore Generation”模塊以16個訓練集化合物作為輸入化合物,兩個高活性化合物1(IC50:0.2 μmol/L)和2(IC50:0.45 μmol/L)用作建模過程中的模板分子,其對應的參數(shù)“Principal”及“MaxOmitFeat”分別設為2和0,其余化合物的這兩個參數(shù)都設為1。

所有SHP2催化活性位點抑制劑利用DS 3.1的“Prepare Ligands”模塊進行能量優(yōu)化,使其初始構象處于能量較低的狀態(tài)。在“3D QSAR Pharmacophore Generation”模塊中“Conformation Generation”參數(shù)設為Best,并將能量閾值設為“20 kcal/mol”,然后利用Poling算法對每個化合物產(chǎn)生255個構象,這些構象涵蓋了所有可能與SHP2催化結構域結合的化合物的活性構象?！癕aximum Pharmacophores”參數(shù)設置為5,“Minimum Interfeature Distance”設為1.5,利用剩余SHP2抑制劑作為測試集化合物,“Fitting Method”設置為flexible,“Fisher Validation”設置為95%。除此,構建藥效團所需其它參數(shù)采用默認參數(shù)。

通過對所有SHP2小分子抑制劑的觀察和相關文獻報道,選擇以下藥效特征元素作為初始藥效特征:氫鍵受體(Hydrogen-bond acceptor,A),氫鍵供體(Hydrogen-bond donor,D),疏水特征(Hydrophobic feature,H)),芳香環(huán)特征(Ring aromatic feature,R)和電離后呈負電荷基團(NEG_ionizable,N)。

2.3.3 3D-QSAR藥效團的評價。通常通過分析計算結果中給出的cost值和其它相關統(tǒng)計學參數(shù)對3D-QSAR藥效團模型進行初評,對通過初評的藥效團模型再利用測試集和交叉驗證法進行進一步的評價。參數(shù)修改后運算給出最好的5個藥效團模型及其相應參數(shù),這些參數(shù)主要有:Fixed cost,理想模型的cost值;Null cost,無意義模型的cost值,即模型預測活性和實驗活性完全不相關時的cost值;Total cost,對應于每個不同的藥效團模型其值不同;相關系數(shù)(correlation coefficient),代表利用藥效團模型預測的訓練集分子活性值和實際實驗活性值的相關度;Config值,代表藥效團模型空間構象的復雜程度;還有均方根偏差值(RMSD value)等。一個好的藥效團模型,應當具有較高的相關系數(shù),其Total cost值應該接近Fixed cost值遠離Null cost值,Config值不大于17,均方根偏差越小越好。交叉驗證法可以進一步評價通過初評藥效團模型的可信度(confidence level),將置信度設為95%,那么程序將產(chǎn)生19個隨機表單,每個表單中化合物的結構和活性數(shù)據(jù)是隨機混亂匹配的,但是表單中的其它參數(shù)與構建初始藥效團模型的參數(shù)值完全相同。通過分析隨機產(chǎn)生的19個訓練集構建的95個藥效團模型的統(tǒng)計學參數(shù)可評價構建的定量藥效團模型的可信性。在測試集驗證方法中,將除訓練集之外的66個化合物組成獨立測試集,運用構建的定量藥效團模型對測試集化合物進行活性預測并與其實驗活性做回歸分析,以驗證藥效團模型的預測能力。

2.4 分子對接研究

本研究中的所有對接研究均使用GOLD 5.1來完成[28]。SHP2催化結構域的晶體結構來源于蛋白質數(shù)據(jù)庫(PDB ID: 4RDD),因為其在所有的SHP2催化結構域晶體結構中分辨率最高(0.16 nm),所以被作為對接研究中小分子化合物的受體。通過使用DS 3.1將氫原子添加到蛋白質,然后分配ChARMM力場。結合位點被定義為一個球體,其覆蓋以配體為中心1 nm范圍內的受體氨基酸殘基,這個球體足夠覆蓋活性位點中配體化合物的結合區(qū)域。通過將與SHP2催化結構域共結晶的抑制劑對接到受體的活性部位,預先優(yōu)化了評分函數(shù)和對接參數(shù)。

2.5 新型SHP2催化位點抑制劑的虛擬篩選

使用構建好的貝葉斯分類模型通過DS 3.1中“Calculate Molecular Properties”模塊對大型商業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫里的化合物進行預測,利用預測為陽性的化合物,構建藥效團篩選數(shù)據(jù)庫。使用DS 3.1中的“Search 3D Database”模塊,利用建立的藥效團模型對構建好的化合物數(shù)據(jù)庫進行3D結構匹配,選擇匹配值(Fit Value)超過一定閾值的化合物進行分子對接研究,通過對對接結果的分析,選擇購買數(shù)個化合物進行后續(xù)的活性研究。

2.6 酶水平化合物活性檢測

本研究中酶水平活性檢測選用歐洲Eurofins Discovery公司的Discovery Services模塊中的PhosphataseProfilerTM完成,該方法使用熒光法測試磷酸酶活性。參考文獻[29,30]并作適當調整,以6,8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)作為底物,SHP2催化其水解產(chǎn)生6,8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素(DiFMU),通過Thermo Scientifific Verioskan Flash多功能讀數(shù)儀,以358 nm為激發(fā)波長來檢測450 nm處的熒光值,確定SHP2的酶活。以礬酸鈉(Na3VO4·12H2O)為陽性抑制劑,它能夠氧化蛋白酪氨酸磷酸酶的保守催化活性位點半胱氨酸,是一種PTPs的通用抑制劑。除了感興趣的待測化合物被正釩酸鈉取代,陽性對照孔包含了反應的所有組分以及控制溶劑效應的DMSO;除了化合物,空白孔包含了反應的所有成分。各種不同酶的活性抑制實驗具體操作如下。

2.6.1 SHP2活性檢測。使用在大腸桿菌中表達的人重組磷酸酶PTPN11(SHP-2)。將試驗化合物與45 ng/mL酶在37 ℃、pH 7.2的改良HEPES緩沖液中預孵育15 min。通過添加100 μmol/L DiFMUP 60 min來引發(fā)反應。在358 nm/450 nm下用熒光光譜法讀取所形成的DiFMU的量的測定?；衔镌?0 μmol/L下進行篩選。

2.6.2 SHP1活性檢測。使用在大腸桿菌中表達的人重組蛋白磷酸酶SHP1。將試驗化合物與2 U/mL酶在37 ℃、pH 7.2的改良HEPES緩沖液中預孵育15 min。通過加入100 μmol/L DiFMUP 30 min來引發(fā)反應。在358 nm/450 nm下用熒光光譜法讀取所形成的DiFMU的量的測定?；衔镌?0 μmol/L下進行篩選。

2.6.3 PTP1B活性檢測。使用在大腸桿菌中表達的人重組蛋白磷酸酶PTP1B。將受試化合物與170 μU/mL酶在37 ℃、pH 7.2的改良HEPES緩沖液中預孵育15 min。通過加入10 μM DiFMUP 60 min來引發(fā)反應。在358 nm/450 nm下用熒光光譜法讀取所形成的DiFMU的量的測定。化合物在10 μmol/L下進行篩選。

2.6.4 DUSP22檢測。使用在大腸桿菌細胞中表達的人重組蛋白磷酸酶DUSP22。將受試化合物與2 μg/mL酶在37 ℃、pH 7.2的改良HEPES緩沖液中預孵育15 min。通過加入10 μmol/L DiFMUP 30 min來引發(fā)反應。在358 nm/450 nm下用熒光光譜法讀取所形成的DiFMU的量的測定。化合物在10 μmol/L下進行篩選。

3 結果和討論

3.1 SHP2催化位點小分子抑制和非抑制劑二分類貝葉斯模型

總共搜集到376個SHP2催化位點抑制劑,其中220個化合物活性(IC50)高于20 μmol/L,在模型構建中作為非活性化合物,標注為-1;剩余157個化合物活性(IC50)低于20 μmol/L,在構建模型時作為活性抑制劑,標注為1。訓練集化合物占比80%,剩余20%為測試集化合物,經(jīng)程序隨機分配后,訓練集總共301個化合物,其中178個非活性化合物,123個活性化合物;測試集總共75個化合物,由42個非活性化合物和33個活性化合物組成。

模型構建時,分子指紋LCFC16與分子描述符Num_H_Donors,Molecular_Fractional Polar Surface Area為最優(yōu)組合,給出最好的二分類結果。最優(yōu)貝葉斯分類模型SHP2_BDM評價數(shù)據(jù)見表1,ROC Score,SE,SP和Concordance數(shù)值越接近1,說明模型的二分類能力越優(yōu)。從表1中的數(shù)據(jù)可見已構建模型是一個優(yōu)秀的貝葉斯分類模型,可用于后續(xù)虛擬篩選。

表1 SHP2催化位點抑制劑和非抑制劑貝葉斯分類模型的驗證結果

3.2 3D-QSAR藥效團模型的構建及評價

3.2.1 藥效團模型的構建。利用選出的16個訓練集小分子化合物(圖1),經(jīng)過運算得到5個最佳的藥效團模型,其參數(shù)見表2,從表2數(shù)據(jù)可見,P1-P5的Cost差值分布在53.014～63.656之間。就藥效團有意義的顯著性而言,真正重要的是任何藥效團的Total cost與Null cost之間的差異大小,如果二者差異為40～60,那么代表有75%～90%的可能性活性數(shù)據(jù)和化學結構是真正相關的。Total cost和Null cost差值越大代表構建的藥效團預測化合物活性的能力越高。

圖1 構建藥效團模型的訓練集分子化學結構及其生物活性(IC50 : μmol/L)

表2 排名前五的SHP2催化位點小分子抑制劑定量藥效團模型的統(tǒng)計學參數(shù)

圖2(a～e)顯示了構建的5個定量藥效團模型,包括藥效特征元素種類和藥效團特征元素三維空間以及距離限制,圖2(f)顯示了5個藥效團的疊合結果,從圖2可以看出5個藥效團的藥效特征的空間排布和各個特征元素之間的距離是相差無幾的。但5個藥效團的藥效特征的種類和數(shù)目卻有較大差別。5個藥效團都含有空間分布類似的1個電離負電荷基團特征,1個氫鍵受體和1個疏水特征。P2、P3和P4還各含有一個位置相似的疏水基團特征;P1和P3還各含有一個位置類似的芳香環(huán)特征;P2在與P1和P3芳香環(huán)特征位置相似的空間位置有一個氫鍵受體;P5還在一個靠近電離負電荷特征的位置有個氫鍵供體;除此,P1、P2和P5還含有3～4個不等的排斥球,即化合物不能占據(jù)的空間。經(jīng)過分析5個藥效團含有的藥效特征種類、數(shù)目和空間排布,本研究傾向選擇P3和P5進行后續(xù)的活性化合物篩選。

3.2.2 藥效團模型的驗證。好的藥效團模型不僅能正確預測訓練集化合物的分子活性,還應當具有正確預測訓練集之外其它分子生物活性的能力。因此,本研究使用66個訓練集分子之外的SHP2催化位點抑制劑組成測試集,用于測試藥效團正確預測外部分子活性的能力。圖3顯示了5個藥效團模型對16個訓練集化合物和66個測試集化合物預測活性值與實驗活性值的回歸分析結果。由圖可見,5個藥效團模型對訓練集化合物的活性預測是非常準確的,化合物預測活性值和實驗活性值間的相關系數(shù)在0.923 3～0.952 4。通過對5個藥效團模型對測試集化合物預測活性值和實驗活性值進行回歸分析,得出藥效團模型準確預測訓練集之外化合物活性值的能力,從圖3可見,5個藥效團模型對66個測試集化合物的活性預測值和實驗活性值之間的相關系數(shù)在0.822 8～0.909 1,其中P3和P5的預測準確度最高,相關系數(shù)分別為0.899 8和0.909 1。通過對化合物活性預測值和實驗值相關系數(shù)的分析,本研究傾向選擇P3和P5進行后續(xù)的虛擬篩選,以發(fā)現(xiàn)新型SHP2催化位點抑制劑。

圖3 5個藥效團模型對訓練集和測試集化合物活性預測值和實驗值回歸分析結果

除了測試集方法,本研究采用Fisher驗證法對藥效團進行隨機交叉驗證分析。在本次驗證中,置信水平設為95%,程序將訓練集化合物結構和活性值隨機混亂組合,產(chǎn)生19個輸入表單,這些表單參數(shù)與構建藥效團模型時使用的參數(shù)設置完全相同,程序將產(chǎn)生95個藥效團型。圖4顯示了新建的95個藥效團模型和原始表單產(chǎn)生的5個藥效團模型的Total cost值,比較發(fā)現(xiàn)原始表單產(chǎn)生的5個藥效團模型除藥效團P2外的Total cost值比隨機表單產(chǎn)生的95個藥效團的Total cost值低的多,這說明構建的藥效團模型P1、P3、P4和P5具有很強的可信性。

為了進一步分析藥效團模型P1、P3、P4和P5的有效性,將這4個藥效團模型與訓練集活性最高和活性最低的2個化合物進行匹配疊合。圖5顯示了定量藥效團模型P1、P3、P4和P5與訓練集中活性最高的化合物1(IC50= 0.2 μmol/L)和活性最低化合物16(IC50= 500 μmol/L)的匹配情況,從圖5(a-d)可見,各藥效團和化合物1匹配得非常完美,其每個藥效特征元素均與化合物1中的相應化學功能基團匹配,而在圖5(e-h)中藥效團模型只與化合物16有部分匹配。因此,這些結果在一定程度上反映了各藥效團的有效性。

圖5 藥效團和訓練集活性最高的化合物1(IC50:0.2 μmol/L)和活性最低化合物16(IC50:500 μmol/L)的匹配效果圖(a～d)P1、P3、P4和P5與活性最高的化合物1的匹配圖;(e～h)P1、P3、P4和P5與活性最低的化合物16的匹配圖(綠色:氫鍵受體;玫紅色:氫鍵供體;藍色:疏水特征;黃色:芳香環(huán)特征;灰色:排斥球)

根據(jù)藥效團模型對訓練集和測試集化合物的活性預測能力,Fisher驗證法分析,藥效特征元素的組成和空間排布,及藥效團和訓練集化合物的匹配情況,最終選擇藥效團P3和P5進行后續(xù)的虛擬篩選。

3.3 分子對接參數(shù)和評分函數(shù)的確定

由于分子對接參數(shù)和評分函數(shù)對最終對接結果具有很大影響,因此在進行基于分子對接的虛擬篩選之前需要確定最優(yōu)對接參數(shù)和評分函數(shù)。本研究選擇SHP2催化結構域結合1個頭孢磺啶衍生物的晶體復合物結構(PDB ID:4RDD)作為對接研究的受體,因為在所有已結晶SHP2催化結構域與催化位點抑制劑的復合物結構中,4RDD具有高分辨率(0.16 nm)。為了確定最佳的對接參數(shù)和評分函數(shù),將已經(jīng)與SHP2催化位點共結晶的4種活性化合物重新對接到SHP2的活性位點,調整對接參數(shù)和評分函數(shù),直到小分子化合物對接構象盡可能與原來的結晶構象重合。經(jīng)過不斷測試,對接參數(shù)設置如:Fitness Function選用Chemscore,GA Parameters選用GOLD Default,Generate Diverse Solution設為True,Early Termination 設為False,其它參數(shù)保留軟件默認參數(shù)。選用參數(shù)和評分函數(shù)的組合,使配體的對接構象與它們在晶體結構中的相應結合構象之間有最小均方根偏差(RMSD)值。表3列出了計算的RMSD值。4個化合物中3LU具有最小RMSD值0.186 95 nm,此值可接受。其它3個化合物的RMSD值都高于0.5 nm,這是因為這3個化合物本身柔性較大,與SHP2催化位點結合不夠緊密,化合物三分之二的結構暴露于溶劑中與受體蛋白無任何相互作用,故對接構象與原結晶構象差別較大。基于化合物3LU的對接結果及對接軟件GOLD5.1 在其它研究中的可靠性[29],表明GOLD軟件在一定程度上能夠重現(xiàn)配體的正確結合構象,可用于本研究中的分子對接研究。

表3 SHP2催化位點抑制劑的結晶構象和對接構象之間RMSD值

3.4 新型SHP2催化位點抑制劑的虛擬篩選

本研究采用3種計算機輔助藥物發(fā)現(xiàn)技術,即貝葉斯分類模型,藥效團模型和分子對接技術,進行多步驟的組合虛擬篩選以發(fā)現(xiàn)潛在新型SHP2活性位點抑制劑。虛擬篩選工作流程如圖6所示。本研究所用3種計算機輔助藥物發(fā)現(xiàn)技術中,基于貝葉斯分類模型的虛擬篩選速度最快,所以首先利用貝葉斯分類模型對包含129 087個化合物的大型商業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫進行SHP2催化位點抑制劑的預測;把預測為陽性的48 507個化合物構建為可用藥效團模型進行篩選的3D數(shù)據(jù)庫,利用比分子對接速度快很多的藥效團模型進行3D數(shù)據(jù)庫篩選;將篩選化合物與藥效團匹配值高于4(FitValue 大于4.0)的158個化合物進行最后的分子對接篩選,根據(jù)對接化合物的打分值高低和觀察對接構象與活性位點關鍵氨基酸殘基的相互作用,最終選取了8個化合物進行購買和后續(xù)的酶水平活性驗證。圖7顯示8個購買化合物的分子結構,表4列出8個化合物的篩選參數(shù)。

圖6 本研究的虛擬篩選流程

圖7 8個命中化合物的化學結構

表4 8個命中化合物的篩選參數(shù),包括藥效團匹配值、3D-QSAR藥效團模型預測的活性值和對接打分

3.5 新型SHP2催化位點抑制劑活性檢測

化合物由LifeChemical化合物數(shù)據(jù)庫國內代理商上海陶術購買(根據(jù)化合物售賣公司提供的材料顯示,所有化合物純度均大于等于90%),每種化合物皆用DMSO溶解,精確配置成10 mmol/L的母液,每個待測化合物取20 μL母液,寄往英國Eurofins Discovery公司完成酶水平活性檢測。圖8顯示化合物在10 μmol/L濃度下對SHP2活性的抑制率,化合物cpd2、cpd4和cpd6在濃度為10 μmol/L時對SHP2催化活性具有明顯抑制能力,抑制率分別為79%,71%和67%。為了進一步檢測活性最高化合物抑制不同磷酸酶催化活性的選擇性,檢測了cpd2 在10 μmol/L濃度時,對SHP1、PTP1B和DUSP22催化活性的抑制。如圖9所示,化合物cpd2 在10 μmol/L濃度時,對SHP1、PTP1B和DUSP22的酶活抑制率分別為42%,41%和34%,與同濃度cpd2對SHP2酶活抑制率21%相比較,提示化合物cpd2具有一定潛在選擇性。酶活檢測表明,化合物cpd2是一個具有潛在選擇性的SHP2催化位點抑制劑,具有進一步改構的價值。

圖8 8個篩選命中化合物抑制SHP2酶活性結果

3.6 活性化合物cpd2與藥效團模型的匹配及分子對接結果分析

為了更好地解釋化合物cpd2結構和活性間的關系,分析了該化合物和藥效團的匹配情況,及其與SHP2催化活性位點的對接結果,以闡明化合物cpd2為何會抑制SHP2催化活性。

從圖10(a)中可以看到,命中化合物cpd2與藥效團模型P3匹配效果較好。具體地說,2個疏水特征與cpd2的苯基匹配,解離負電荷特征與羧基匹配,氫鍵受體與硫氧代噻唑啉上的氧原子匹配,芳香環(huán)特征沒有匹配到化合物cpd2的結構上。相比較,化合物cpd2與藥效團模型P5匹配效果好于其與P3的匹配效果,如圖10(b)。具體來說,解離負電荷特征與羧基匹配,氫鍵受體與硫氧代噻唑啉上的氧原子匹配,氫鍵受體與羥基匹配,疏水特征與甲氧基匹配。圖10(c)顯示了cpd2在SHP2催化活性位點中可能的結合構象,水楊酸結合在SHP2底物磷酸化部位的結合位點,其中羧基與GLN510和GLY464形成氫鍵相互作用,羥基和CYS459形成氫鍵相互作用,苯環(huán)與ALA461形成疏水相互作用并與LYS366形成正電荷-π相互作用;硫氧代噻唑啉上的氧原子與SER460形成氫鍵相互作用,硫氧代噻唑啉的五元環(huán)與LYS364形成疏水相互作用;鄰二甲氧基苯上的一個甲氧基與ARG278形成弱氫鍵相互作用?；衔颿pd2與藥效團的匹配結果與其和SHP2催化活性位點結合形成的相互作用相吻合,說明藥效團預測的cpd2活性構象和分子對接預測的活性構象基本吻合,化合物cpd2極可能是采取此種構象結合在SHP2催化位點抑制其催化活性。藥效團匹配和分子對接的結果闡明了化合物cpd2抑制SHP2催化活性的作用機制。

圖10 (a)和(b)分別是藥效團P3和P5與化合物cpd2的匹配結果(綠色:氫鍵受體,玫紅色:氫鍵供體,藍色:疏水特征,黃色:芳香環(huán)特征,灰色:排斥球);(c)cpd2在SHP2催化活性位點中可能的結合構象(綠色:氫鍵,淺粉:疏水相互作用,橙色:靜電相互作用,灰綠:弱氫鍵)

4 結論

本研究利用計算機輔助藥物設計技術結合酶水平活性測試,發(fā)現(xiàn)了3個新型SHP2催化位點抑制劑,其中活性最高化合物cpd2具有一定的潛在選擇性。通過分析cpd2與SHP2催化位點抑制劑3D-QSAR藥效團的匹配結果以及cpd2與SHP2催化活性位點的對接結果,發(fā)現(xiàn)藥效團預測的活性構象與分子對接預測的活性構象相當吻合,且cpd2與藥效團關鍵藥效特征的匹配與其和SHP2催化活性位點關鍵氨基酸殘基的相互作用基本一致,所以闡明了cpd2抑制SHP2酪氨酸磷酸酶活性的作用機制。