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    RSRC1 通過靶向調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 通路抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移

    2023-10-30 03:31:10周家田尚觀勝張聰蔣德熊袁冬冬湯登堯周江
    新醫(yī)學(xué) 2023年10期
    關(guān)鍵詞:母細(xì)胞調(diào)節(jié)通路

    周家田 尚觀勝 張聰 蔣德熊 袁冬冬 湯登堯 周江

    食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一,該病被列為第七大最常見的癌癥和第六大癌癥死亡原因[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是目前食管癌主要組織學(xué)類型,病死率在全球所有腫瘤中排名第四,總體5 年生存率僅為15%~25%[2-4]。由于大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期,導(dǎo)致ESCC患者的預(yù)后不理想,5 年總生存率較差[5-7]。因此,探索ESCC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制,對(duì)ESCC 早期診斷和治療的新型生物標(biāo)志物具有重要意義。

    富含精氨酸和絲氨酸的卷曲螺旋1(RSRC1)也稱SRrp53,編碼富含精氨酸和絲氨酸家族的蛋白質(zhì),在細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[8-9]。RSRC1 被報(bào)道在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌等癌癥中低表達(dá),發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[8,10]。如Teplyuk 等[10]研究表明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,RSRC1 是微小RNA(miR)-10b的靶基因,miR-10b 通過調(diào)節(jié)RSRC1 的表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展。RSRC1 還被證明可以通過調(diào)節(jié)磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[10]。最近,一些研究表明 RSRC1 基因多態(tài)性與癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。如Tang 等[11]發(fā)現(xiàn)RSRC1 基因多態(tài)性與神經(jīng)母細(xì)胞瘤易感性有關(guān),該研究證實(shí)了攜帶RSRC1rs6441201A等位基因的參與者與神經(jīng)母細(xì)胞瘤風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān) 。目前關(guān)于RSRC1 在腫瘤進(jìn)展中的作用研究較少,且尚未有研究報(bào)道RSRC1 在ESCC 細(xì)胞發(fā)展中發(fā)揮的作用。因此,本研究將進(jìn)一步探究RSRC1對(duì)ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。本研究擬探討RSRC1 在ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用,揭示RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新作用機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

    材料與方法

    一、生信分析

    從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載ESCC mRN 表達(dá)矩陣(normal:11,tumor:81),利用edgeR 包進(jìn)行差異分析。本研究所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

    1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    人ESCC 細(xì)胞系(TE-1,Eca-109,EC9706)和正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A,培養(yǎng)在含10% FB 的RPMI-1640(Corning,美國)中,于37 ℃和5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并根據(jù)試劑盒操作說明書將blank、NC 和si-RSRC1 轉(zhuǎn)染到ESCC細(xì)胞。

    2.qRT-PCR

    通過TRIzol 試劑 (Merck,德國) 從ESCC 中提取總RNA。根據(jù)試劑盒說明,利用Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(Yeasen,中國)將總RNA 反轉(zhuǎn)錄。使用 Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen,中國)在ABI 12K 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 儀(ThermoFisher,美國)上進(jìn)行qRT-PCR。基于Eca-109 細(xì)胞構(gòu)建了以下細(xì)胞分組:blank 組;NC 組;si-RSRC1 組,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)RSRC1 表達(dá)水平,并將GAPDH 用作內(nèi)源性對(duì)照。引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR 引物

    3.蛋白免疫印跡法

    通過RIPAlysis buffer(Beyotime,中國)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒(Beyotime,中國) 檢測蛋白質(zhì)濃度。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析,細(xì)胞裂解物通過SDS-PAGE 電泳,隨后轉(zhuǎn)移到 PVDF。然后將膜在室溫下在脫脂牛奶中封閉約1 h,然后在4 ℃下與一抗過夜。用PBST 洗滌3 次,每次10 min 后,將膜與二抗在室溫下再孵育1 h。使用ECL 底物試劑盒以及凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc ?XRS+(Bio-rad,美國)檢測蛋白表達(dá)。

    4.細(xì)胞活力測定

    取慢病毒感染培養(yǎng)的 Eca-109 細(xì)胞接種到96孔板中。孵育0、24、48、72、96 h 后。向每孔中加入20 μL 的CCK-8 溶液,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。全功能微孔板檢測儀(PerkinElmer/envision,中國)檢測450 nm 處的吸光度。

    5.遷移和侵襲檢測

    細(xì)胞遷移的檢測:Eca-109 細(xì)胞(每孔1×105)重懸于無血清培養(yǎng)基,并接種于到上室,同時(shí)在下室加入10%的FBS(Thermo Fisher Scientific,美國)細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后,用4%多聚甲醇固定細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色。在顯微鏡下觀察成像情況并用Image J 軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞侵襲的檢測:在Transwell 實(shí)驗(yàn)裝置(Corning,美國)的上室涂50 μL 基質(zhì)凝膠(BD Biosciences,美國),其余步驟與細(xì)胞遷移步驟一致。

    二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用 SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),服從正態(tài)分布的資料以表示,2 組間比較采用t 檢驗(yàn),重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量方差分析,P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、RSRC1 在ESCC 中下調(diào)表達(dá)

    qRT-PCR 結(jié)果顯示,與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A 組相比,RSRC1 在人ESCC 細(xì)胞系(TE-1,Eca-109,EC9706)中的表達(dá)均下降(P 均< 0.05)。見圖1。因此,我們選擇了RSRC1 表達(dá)量相對(duì)較高的Eca-109 細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    圖1 RSRC1 在ESCC 中的表達(dá)

    二、RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

    與NC 組相比,敲低RSRC1 的Eca-109 細(xì)胞中RSRC1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低(P 均<0.01),見圖2A 和圖2B。隨后,通過CCK-8 檢測各組細(xì)胞活力,結(jié)果表明與NC 組相比,敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了Eca-109 的細(xì)胞活力,見圖2C。最后,通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示與NC 組相比,敲低RSRC1明顯增加了Eca-109 中的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量,見圖2D 和圖2E。

    三、RSRC1 可以調(diào)控PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路

    圖2 RSRC1 抑制 ESCC 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

    生信分析結(jié)果表明PTEN 在ESCC 組織中明顯低表達(dá),見圖3A。以PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路為研究對(duì)象,基于Eca-109 細(xì)胞構(gòu)建了以下細(xì)胞分組:blank 組;NC 組;si-RSRC1 組,然后通過蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá),結(jié)果顯示敲低RSRC1 明顯抑制了p-PTEN 的蛋白表達(dá),而敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了p-PI3K、p-AKT 的蛋白表達(dá),見圖3B。

    討 論

    ESCC 是一種常見的人類惡性腫瘤,晚期ESCC患者的5 年總生存率相對(duì)較低[12]。ESCC 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰,這使得難以發(fā)現(xiàn)晚期 ESCC 的有效治療方法。因此,進(jìn)一步探索ESCC 病理生理學(xué)的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā) ESCC 的新療法非常重要。在本研究中,我們通過分子實(shí)驗(yàn)首次證明RCRC1在ESCC 細(xì)胞中低表達(dá),可能是ESCC 中潛在的腫瘤抑制因子。先前研究發(fā)現(xiàn),RSRC1 通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體β 的SUMO 化來抑制雌激素受體β 轉(zhuǎn)錄活性。此外,RSRC1 在腫瘤發(fā)展中起重要作用。Tang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 基因多態(tài)性增加了兒童對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的易感性。Yu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。然而,RSRC1 在ESCC 發(fā)展中的作用尚未闡明。本研究通過CCK-8 檢測各組細(xì)胞活力,結(jié)果表明與對(duì)照相比,敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了Eca-109 的細(xì)胞活力;通過Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示與對(duì)照相比,敲低RSRC1明顯增加了Eca-109 中的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量,首次發(fā)現(xiàn)RSRC1 能夠抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移,這與前人研究結(jié)果一致,這一結(jié)果豐富了我們對(duì)ESCC 發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),并提示靶向RSRC1可能是治療ESCC 的新策略。

    有學(xué)者認(rèn)為PTEN 是一種腫瘤抑制基因,可以通過直接抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路來抑制癌癥進(jìn)展[13]。PTEN 是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及存活的脂質(zhì)和蛋白磷酸酶,被充分證明為關(guān)鍵的腫瘤抑制因子,可以在多種癌癥(包括ESCC)中發(fā)揮腫瘤抑制作用[14-16]。Kuo 等[17]研究發(fā)現(xiàn)芝麻素能夠通過促進(jìn) PTEN 表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。Zhang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-155 通過下調(diào)PTEN 促進(jìn)ESCC 的遷移和侵襲。更重要的是,PTEN 是PI3K/AKT 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子[19]。據(jù)報(bào)道,miR-93-5p 可通過抑制PTEN 的表達(dá)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[20]。蛇床子素通過激活PTEN抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞的凋亡[21]。為了確定RSRC1 抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,我們通過查閱文獻(xiàn)得到RSRC1 通過促進(jìn)PTEN 表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展,推測RSRC1 和PTEN 呈正相關(guān),本研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)PTEN 在ESCC組織中表達(dá)下調(diào),進(jìn)一步通過蛋白免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá),結(jié)果顯示敲低RSRC1 明顯抑制了p-PTEN的蛋白表達(dá),而敲低RSRC1 明顯促進(jìn)了p-PI3K、p-AKT 的蛋白表達(dá),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RSRC1 可以通過調(diào)節(jié)PTEN/ PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和遷移,這與前人的研究結(jié)果一致。

    本研究證明RSRC1 是ESCC 中潛在的腫瘤抑制基因,并且能夠抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路。因此,RSRC1可能是ESCC 的潛在診斷生物標(biāo)志物,可以作為ESCC 治療的新靶點(diǎn),并在未來的藥物開發(fā)中起到作用。然而,我們的研究還存在不足,缺少RSRC1 在體內(nèi)的研究,以及這種類型的調(diào)控是否與mRNA 替代剪接有關(guān)。這也是我們未來研究的重要方向,我們將在細(xì)胞、分子以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)這一課題進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

    綜上所述,RSRC1 可能通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制ESCC 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,為豐富ESCC 的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向,為RSRC1可以作為ESCC 治療的潛在靶點(diǎn)提供理論支持。

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