腮腺皮脂腺癌的全外顯子組基因測(cè)序結(jié)果分析

鄭奔容 江博雄 王一娜 楊茂生 梁亞樂(lè) 王玉娥

皮脂腺癌（SC）是一種罕見(jiàn)的、具有侵襲性的皮膚惡性腫瘤，好發(fā)于老年人，常表現(xiàn)為紅色結(jié)節(jié)或者斑塊，有時(shí)可出現(xiàn)潰瘍，偶爾呈淡黃色。據(jù)報(bào)道，SC 的常見(jiàn)部位為眼瞼、面部、頭皮等處。按生長(zhǎng)部位，SC 可分為眼周的SC 和眼外的SC，其中眼外SC 有不足2%發(fā)生于腮腺［1］。1953 年，F(xiàn)oote和Frazell 在一篇唾液腺腫瘤綜述中首次報(bào)道了一例皮脂腺腺瘤（SA）。6 年后，Rauch 和Masshoff報(bào)道了腮腺中的SC。截至2022 年12 月，外文文獻(xiàn)共報(bào)道了35 例腮腺SC 和10 例腮腺SA［2-3］。由于其罕見(jiàn)性，腮腺SC 的臨床病理特征和組織發(fā)生尚未完全闡明，而對(duì)于相關(guān)基因突變目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本文對(duì)一例腮腺SC 進(jìn)行了腫瘤的全外顯子組測(cè)序，由于腮腺SA 更加罕見(jiàn)，本研究選擇了同為眼外皮脂腺良性腫瘤的頭皮SA 樣本作為對(duì)照，檢測(cè)全外顯子組基因突變?cè)趦烧咧械牟町愖兓瑥亩醪教接懭賁C 發(fā)生的可能機(jī)制及治療的靶點(diǎn)。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

病例1 患者女，89 歲。因發(fā)現(xiàn)耳后腫物2 年于2022 年9 月至中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診就診。彩色多普勒超聲（彩超）檢查提示右側(cè)腮腺內(nèi)實(shí)性腫物，腫物大小約4.0 cm×4.0 cm×3.5 cm，考慮惡性腫瘤性病變。手術(shù)切除腫物后行病理學(xué)活組織檢查（活檢），診斷為腮腺SC。

病例2 患者女，51 歲。因發(fā)現(xiàn)頭皮腫物5 年于2020 年6 月至中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診就診。通過(guò)詳細(xì)有全身檢查，排除頭皮外其他部位的腫瘤。體格檢查可見(jiàn)頭皮隆起型腫物，腫物大小約2.5 cm×2.0 cm×1.5 cm，邊界欠清，質(zhì)硬。手術(shù)切除腫物后行活檢，診斷為SA。

本研究方案經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：中大附三醫(yī)倫RG2023-117-01），患者均已簽署知情同意書(shū)。

二、方 法

1.取 樣

切取石蠟標(biāo)本中的腫瘤及瘤旁組織或瘤旁組織，體積約0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm。

2.DNA 的提取及建庫(kù)

提取石蠟包埋組織的DNA，用Qubit 對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量，以O(shè)D 值在1.8～2.0，DNA 含量＞1.0 μg 為建庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。將符合標(biāo)準(zhǔn)的DNA 進(jìn)行建庫(kù)，具體操作同文獻(xiàn)［4］ 。

3.數(shù)據(jù)處理及分析

篩選用于后續(xù)信息分析的高質(zhì)量讀序（clean reads），使用BWA 軟件將clean reads 比對(duì)至人的參考基因組上，并通過(guò)Samtools 軟件處理，得到bam 文件，再用picard 軟件去除PCR 導(dǎo)致的重復(fù)reads，然后使用GATK 進(jìn)行矯正；之后基于比對(duì)結(jié)果，使用基因組分析工具箱（GATK）軟件檢測(cè)單核苷酸位點(diǎn)變異（SNV）及長(zhǎng)度小于50 bp 的插入和缺失（InDel），最后使用ANNOVAR 軟件對(duì)突變結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)注釋。

4.篩選高頻基因和驅(qū)動(dòng)基因

去除位于Intron、UTR、IGR、RNA、Flank 的SNP 位點(diǎn)以及位于目標(biāo)區(qū)域（突變function 為“.”或“unkown”）的InDel，利用MutSigCV 軟件篩選出高頻基因，同時(shí)參考文獻(xiàn)［4］比較體細(xì)胞變異與已知驅(qū)動(dòng)基因，篩選出該腫瘤樣本中的已知驅(qū)動(dòng)基因，具體操作同文獻(xiàn)［5］ 。

5.腫瘤異質(zhì)性及亞克隆分析

利用SciClone 軟件將2 例腫瘤標(biāo)本的變異等位基因頻率（VAF）及拷貝數(shù)變異（CNV）的拷貝數(shù)作為輸入文件，通過(guò)識(shí)別體細(xì)胞突變的數(shù)量及分析亞克隆的組成，追蹤亞克隆進(jìn)化，得到每例腫瘤樣本的克隆性圖譜信息。

結(jié) 果

一、病理結(jié)果

病例1 腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞排列成大的巢團(tuán)狀，部分巢團(tuán)中央可見(jiàn)壞死，巢團(tuán)周邊腫瘤細(xì)胞多呈基底細(xì)胞樣，核質(zhì)比高，細(xì)胞異型性明顯，中央見(jiàn)散在體積較大、胞質(zhì)呈多空泡狀的皮脂腺分化細(xì)胞，符合SC。見(jiàn)圖1。

病例2 腫瘤邊界清楚，由基底樣細(xì)胞和成熟的皮脂腺細(xì)胞構(gòu)成，基底樣細(xì)胞大小形態(tài)較一致，細(xì)胞核呈卵圓形，可見(jiàn)小核仁，成熟皮脂腺細(xì)胞胞質(zhì)豐富、呈多空泡狀，細(xì)胞異型性不明顯，未見(jiàn)確切核分裂及壞死，符合SA。見(jiàn)圖2。

圖1 一例腮腺SC 組織的HE 染色結(jié)果

圖2 一例頭皮SA 組織的HE 染色結(jié)果

二、全外顯子組測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果

腮腺SC 及其癌旁組織、頭皮SA 及其瘤旁組織的測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)的結(jié)果均達(dá)到要求，與參考基因組比對(duì)能達(dá)到 94%以上的比對(duì)率；平均100 倍測(cè)序深度時(shí)10 倍以上覆蓋度達(dá)到95%以上，見(jiàn)表1。腮腺SC 組織的SNV 數(shù)目為2012，頭皮SA 組織的SNV 數(shù)目為205，腮腺SC 組織的SNV 數(shù)目約為頭皮SA 組織的10 倍。腮腺SC 組織中的SNV 僅新發(fā)突變（未注釋上千人基因組或dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)）數(shù)目為1 495（占75%），頭皮SA新發(fā)突變數(shù)目?jī)H178（占86%），見(jiàn)表2。腮腺SC組織的SNV 類型（圖3）多于頭皮SA 組織（檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)文獻(xiàn)［5］ ）。腮腺SC 組織、頭皮SA 的InDel數(shù)目分別為2017、50，新發(fā)突變數(shù)目為1 070、50。而CNV 的結(jié)果則分別為92 和90。

表1 全外顯子測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)比對(duì)統(tǒng)計(jì)情況總覽

表2 驅(qū)動(dòng)基因突變篩選結(jié)果

圖3 一例腮腺SC 的體細(xì)胞突變信息整合環(huán)狀圖

體細(xì)胞突變的數(shù)量及VAF 顯示腮腺SC 和頭皮SA 的亞克隆模式是有差異的，并且腫瘤倍性也不一致，腮腺SC 的多拷貝變異數(shù)量（圖4）多于頭皮SA 組織（檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)文獻(xiàn)［5］）。在腮腺SC組織中還發(fā)現(xiàn)不同于頭皮SA 的57 個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變，包括ABL1、β-肌動(dòng)蛋白（ACTB）、異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白（ASPM）、鋅指同源框3（ZFHX3）和細(xì)胞核受體輔激活物基因（NCOA3）等基因。

討 論

雖然SC 的病因未明，但研究表明其可能與DNA 錯(cuò)配修復(fù)（MMR）異常有關(guān)［5］。基因突變導(dǎo)致癌基因激活、抑癌基因失活，部分正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化出現(xiàn)異常，出現(xiàn)惡性失控從而形成惡性腫瘤。已報(bào)道的有關(guān)SC 基因突變多集中在眼部，針對(duì)眼部SC 的全外顯子組測(cè)序分析顯示腫瘤蛋白P53（TP53）、ZNF750、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（RB1）是最常見(jiàn)的3 個(gè)基因突變，而PCDH15 是一種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的新突變［6-9］。

圖4 一例腮腺SC 的亞克隆組成圖

目前有關(guān)眼外SC 的基因檢測(cè)分析數(shù)據(jù)極其罕見(jiàn)，尤其是腮腺SC 的結(jié)果尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)腮腺SC 和頭皮SA 進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)腮腺SC 的基因突變總數(shù)和各突變類型均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)頭皮SA，說(shuō)明腮腺SC 的基因突變非?；钴S。此外，腮腺SC 中發(fā)現(xiàn)有別于頭皮SA 的57 個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變，其中比較明確的癌癥相關(guān)基因 有ABL1、ACTB、ASPM、ZFHX3 和NCOA3 基因等。ABL1 基因是與白血病相關(guān)的原癌基因。當(dāng)其易位到 22 號(hào)染色體長(zhǎng)臂上時(shí)，會(huì)與斷裂點(diǎn)叢集區(qū)（BCR）基因發(fā)生融合從而形成 BCR-ABL 融合基因，該基因編碼的BCR-ABL 融合蛋白持續(xù)性活化，導(dǎo)致了白血?。?0］。ABL1 激酶在實(shí)體瘤中的活化并不是因?yàn)榘l(fā)生染色體易位形成BCR-ABL 融合蛋白，而是由于 ABL1 激酶表達(dá)上調(diào)或ABL1 蛋白的上游激酶活化從而提高了 ABL1 的酪氨酸激酶活性。ACTB 被廣泛用于量化腫瘤表達(dá)水平。然而，ACTB 聚合與ACTB 細(xì)胞骨架形成的驅(qū)動(dòng)細(xì)胞突起和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)參與了癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。ASPM 基因位于人類1 號(hào)染色體，ASPM 在多種癌癥中異常表達(dá)，且與肝癌、卵巢癌、肺腺癌、胰腺癌和膀胱癌等多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［12-14］。其缺失會(huì)影響細(xì)胞有絲分裂、分裂方向和分化方式，造成DNA 損傷增加和細(xì)胞凋亡。ZFHX3 作為非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點(diǎn)阻斷的生物標(biāo)志物，是已知的原癌基因，也是基底細(xì)胞癌相關(guān)基因［15-16］。NCOA3基因與癌癥相關(guān)，其體細(xì)胞基因拷貝數(shù)發(fā)生變化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，從而導(dǎo)致乳腺癌和胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

頭頸部腫瘤的發(fā)展是一個(gè)綜合作用的結(jié)果，多種基因的突變相互作用，相互促進(jìn)，形成了惡性循環(huán)。腫瘤異質(zhì)性即腫瘤組織內(nèi)部不同的腫瘤細(xì)胞或亞群中體細(xì)胞突變不完全相同。大部分的腫瘤存在亞克隆，而亞克隆突變與耐藥性相關(guān)。分析腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)有利于揭示腫瘤組織的異質(zhì)性。分析腫瘤異質(zhì)性和克隆結(jié)構(gòu)有助于研究腫瘤的發(fā)展、進(jìn)化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及藥物反應(yīng)等。本研究中，腮腺SC 的腫瘤異質(zhì)性較頭皮SA 高，亞克隆多。本研究在腮腺SC 中發(fā)現(xiàn)了ABL1 基因的突變，而針對(duì)ABL1 突變發(fā)生的腫瘤，臨床有潛在作用的治療藥物包括伊馬替尼、達(dá)沙替尼、尼洛替尼、波蘇替尼、泊那替尼等。

綜上所述，腮腺SC 具有不同于良性腫瘤的基因突變及突變的模式。但本研究樣本量有限，進(jìn)一步的研究需要更多的樣本進(jìn)行相關(guān)基因突變的驗(yàn)證。