補(bǔ)元湯通過HIF-1/NOR-1途徑改善低氧性肺血管重構(gòu)的機(jī)制研究*

宋文龍 李 瑾

（浙江省建德市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江建德 311600）

缺氧性肺血管疾病是一類由缺氧引起的，以肺部中小動(dòng)脈管壁增厚，血管阻力增加為特點(diǎn)，囊括慢性肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等在內(nèi)的疾病統(tǒng)稱，患者可出現(xiàn)諸如呼吸困難、缺氧發(fā)紺、杵狀指（趾）、活動(dòng)耐量下降以及直立性缺氧等慢性呼吸系統(tǒng)典型癥狀體征［1-2］。這一類疾病在疾病早期癥狀多不典型，病情發(fā)展亦相對(duì)緩慢，診治存在困難，加之其病理改變難以逆轉(zhuǎn)，逐漸成為世界性難題。隨著國(guó)內(nèi)外研究的不斷深入，主流研究認(rèn)為機(jī)體缺血缺氧、低氧激活后遺傳修飾以及肺血管重構(gòu)是該病重要病理學(xué)基礎(chǔ)［3-5］。與此同時(shí)，我們觀察到缺氧環(huán)境和香煙煙霧暴露可以促進(jìn)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌的異常增殖，參與肺血管重構(gòu)過程，而補(bǔ)元湯能減輕COPD 大鼠氣道炎癥，改善COPD 大鼠氣道及肺血管重塑的程度［6］。大量研究指出肺血管重塑主要與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）的過度增生、遷移和程序性細(xì)胞死亡受到抑制有關(guān)［4］。低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）被廣泛認(rèn)為是對(duì)缺氧（低氧水平）應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子，參與控制機(jī)體多種過程（血管生成、代謝、增殖及凋亡）等。孤兒核受體-1（NOR-1）是一種進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于配體非依賴型NR4A 核受體家族，作為早期反應(yīng)基因，被認(rèn)為可調(diào)控人體細(xì)胞的基本功能，如炎癥、增殖等生物過程［7-8］。但HIF-1/NOR-1 在缺氧性肺血管重塑（HPVR）中的具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究對(duì)PASMCs 采用補(bǔ)元湯輔助治療，以期了解該治療方法對(duì)低氧狀態(tài)下HIF-1/NOR-1 及肺動(dòng)脈血管重構(gòu)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞：杭州赫貝提供。SD 大鼠，10周齡，體質(zhì)量300～330 g，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0012。合格證號(hào)：2017005012875。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)元湯：黨參30 g，麩炒白術(shù)15 g，生黃芪30 g，陳皮10 g，當(dāng)歸10 g，鎖陽15 g，山茱萸肉15 g，補(bǔ)骨脂10 g，升麻10 g，北柴胡10 g，炙甘草5 g。飲片均由本院藥劑科提供，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算出人鼠等效劑量為16 g/kg，并由煎藥室制成100%煎劑［9］，經(jīng)加熱到70 ℃后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將藥劑濃縮成每毫升含生藥量4.8 g。

1.3 試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（貨號(hào)R222-01）、定量PCR 試劑盒：ChamQ TM SYBR Color Qpcr Master Mix（貨號(hào)Q411-02），南京諾唯贊生物提供。RNA 提取試劑盒（離心柱型）：上海捷瑞生物工程，貨號(hào)GK3016；低糖DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基：索萊寶，貨號(hào)31600；胎牛血清FBS，貨號(hào)10099141（美國(guó)GIBCO 公司）。WB 試劑盒，購(gòu)自聯(lián)科生物；青霉素鈉，貨號(hào)69-57-8（大連美侖生物）；硫酸鏈霉素，貨號(hào)3810-74-0（大連美侖生物），0.45 μm PVDF 膜，Millipore 公司；脫脂奶粉，伊利；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）、膜蛋白提取細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司；Tris-Hcl/SDS（1.5 mM，pH8.8）、Tris-Hcl/SDS（0.5 mM，pH6.8）購(gòu)自上海生工生物工程；Tris 堿、SDS、過硫酸銨購(gòu)自Biosharp 公司。渦旋振蕩儀：QL-861 型，海門市其林貝爾儀器提供。電泳系統(tǒng)，Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD 公司。凝膠成像儀，ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD 公司。倒置顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司，型號(hào)XD202；定量PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD 公司，型號(hào)CFX Connect Real-Time System（96）。

1.4 含藥血清制備

依照臨床用藥習(xí)慣，分早晚2 次對(duì)SD 大鼠進(jìn)行補(bǔ)元湯灌胃，每次1 mL，連續(xù)1 周，結(jié)束后休息1 h，采用乙醚麻醉后腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h，離心過濾除菌，水浴0.5 h滅活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 采用10%FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)基，平滑肌細(xì)胞放入37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取正常培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期的大鼠PASMC，用0.25% Typsin 消化，1 000 r/min 離心5 min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，鋪3 塊6 孔板，每板2 孔，每孔均加入3×105個(gè)細(xì)胞，分為：常氧對(duì)照組、常氧含藥組、10%氧氣對(duì)照組、10%氧氣含藥組、1%氧氣對(duì)照組、1%氧氣含藥組。每組設(shè)9 個(gè)復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中靜置過夜。每孔分別加250 μL 對(duì)照血清和含藥血清，并用培養(yǎng)基補(bǔ)充至1 500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將各組細(xì)胞在低氧培養(yǎng)箱中于不同氧濃度下（21%，10%，1%）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后。48 h后收取細(xì)胞做檢測(cè)。經(jīng)上述步驟處理后的大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞先經(jīng)過濃度為3%戊二醛固定，再予10 mg/mL 鋨酸固定，逐級(jí)酒精脫水，氧化丙烯浸透，樹脂包埋、切片后在電鏡下觀察并攝像。

1.5.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力 取大鼠PASMC，經(jīng)0.25%Typsin消化，1 000 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，鋪9塊6孔板，每板12孔，每孔均加入2×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱中靜置過夜。每孔分別加25 μL 對(duì)照血清和含藥血清，并用培養(yǎng)基補(bǔ)充至150 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將各組細(xì)胞在低氧培養(yǎng)箱中于不同氧濃度下（21%、10%、1%）繼續(xù)培養(yǎng)。加藥處理24 h 后，去掉上清，加入10%CCK8工作液，37 ℃避光反應(yīng)1 h，450 nm、650 nm 處讀取各孔OD 值，最終OD 值為450～650 nm。按下式計(jì)算：細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組（OD450-OD650）÷CK 組（OD450-OD650）×100%，以CK組為存活率100%。

1.5.3 qPCR 檢測(cè)大鼠肺上皮Ⅱ細(xì)胞中B 細(xì)胞淋巴因子2（Bcl-2）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞抗凋亡蛋白2（cIAP2）、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 將樣本從-80 ℃中取出化凍，Trizol 一步法提取細(xì)胞中總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取適量CDNA，加入相應(yīng)引物后PCR 擴(kuò)增（各組引物序列詳見表1），最終反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增條件為85 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s（56.8 ℃、64.8 ℃）退火30 s，融化曲線從70 ℃延伸95℃1 min，0.5 ℃/min，電泳后凝膠成像，行掃描定量分析，以各組凈光密度與β-actin 間比值代表半定量值。

表1 引物序列

1.5.4 WB 檢測(cè)HIF-1、Cyclin D1、NOR-1、Rb1、Bcl-2及cIAP2 蛋白表達(dá)水平 將各組細(xì)胞樣品收集到1.5 EP 管中，每管中加入200 μL 蛋白提取試劑（使用前加入PMSF），混勻后4 ℃靜置30 min，超聲1 min后4 ℃離心機(jī)、14 000g離心處理10 min。取20 μg 樣品，加入樣品量2倍體積的上樣緩沖液Buffer，再加入上述總體積1/10的β-巰基乙醇，電泳分離蛋白質(zhì)，濕法轉(zhuǎn)膜，加入合適濃度一抗溶液，4 ℃下完成轉(zhuǎn)膜，取出已封閉的PVDF 膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜（Bcl-2、Cyclin D1、NOR-1、cIAP2、Rb1、HIF-1 稀釋比為1∶1 000，β-Actin，1∶5 000）。浸于1×TBST 緩沖液中10 min，于搖床上洗滌，該步驟重復(fù)3次。加入二抗（Goat anti-Mouse IgG、Goat anti-Rabbit IgG，1∶5 000），于室溫?fù)u床上孵育1 h。洗膜后將PVDF 膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A 液和B 液混合，移入凝膠成像分析儀中，曝光顯影。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。時(shí)間為48 h，以對(duì)照血清為對(duì)照。

1.5.5 流式細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況 用無EDTA的胰酶消化離心收集細(xì)胞，1×PBS 洗滌細(xì)胞兩次（1 000 r/min，5 min），用500 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，并設(shè)置單染管，搖勻后于4 ℃避光下孵育5 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 常氧與低氧組大鼠PASMCs電鏡下形態(tài)變化

大鼠PASMCs 分別于常氧和低氧下培養(yǎng)，根據(jù)CCK-8 所示結(jié)果，我們分別對(duì)常氧及1%氧濃度下培養(yǎng)72 h后的PASMCs進(jìn)行攝片。如圖1所示，常氧下條件下，大鼠PASMCs 正常傳代生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形或多角形，外形相對(duì)圓潤(rùn)；低氧下環(huán)境下（1%氧濃度）PASMCs數(shù)量減少，密度下降，細(xì)胞變細(xì)變長(zhǎng)，細(xì)胞間隙增寬。

圖1 PASMCs在常氧和低氧條件下細(xì)胞形態(tài)特征（100倍）

2.2 各組CCK8活力檢測(cè)結(jié)果比較

見表2。經(jīng)10%氧濃度處理24 h 后，PASMC 細(xì)胞活力較常氧組下降（P＜0.01），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PASMC 細(xì)胞活力逐漸回升，并在48 h 后超過常氧組，72 h后，與常氧組有顯著差異（P＜0.05）；而在1%氧濃度下，PASMC 細(xì)胞活力隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力較常氧組顯著下降（P＜0.01）；經(jīng)補(bǔ)元湯含藥血清處理后，各組PASMC細(xì)胞活力均較各對(duì)照組下降（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞存活率比較（%，±s）

注：與常氧組對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與10%氧氣對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與同種條件的對(duì)照血清組比較，*P＜0.05。下同。

組 別常氧對(duì)照組常氧含藥組10%氧氣對(duì)照組10%氧氣含藥組1%氧氣對(duì)照組1%氧氣含藥組24 h 100.00±4.72 88.95±11.60 66.78±8.87△△76.65±8.74▲89.88±22.33 84.50±9.81 48 h 100.00±6.50 103.86±7.73 123.00±4.97△83.72±13.96*80.56±9.32△64.48±15.51△△72 h 100.00±4.27 109.91±8.98 123.00±4.97△119.86±5.50 63.50±5.25△△▲▲53.70±6.47△△▲▲

2.3 各組PASMC 細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA表達(dá)比較

見表3。和常氧對(duì)照組相比，隨著氧氣濃度降低，Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 mRNA 水平升高，NOR-1、Rb1 mRNA 水平降低；與對(duì)照血清組相比，含藥血清組在1%氧氣濃度下Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 mRNA水平降低比較明顯，NOR-1、Rb1、蛋白水平升高比較明顯（均P＜0.05）。

表3 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA比較（±s）

表3 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1 mRNA比較（±s）

組別常氧對(duì)照組常氧含藥組10%氧氣對(duì)照組10%氧氣含藥組1%氧氣對(duì)照組1%氧氣含藥組HIF-1 0.98±0.06 0.83±0.07 1.00±0.00 0.67±0.25 1.46±0.13**▲▲1.25±0.10*▲NOR-1 1.51±0.55 0.80±0.29 0.25±0.08*0.56±0.27 0.10±0.03*▲0.43±0.13*Cyclin D1 0.81±0.11 0.92±0.17 1.09±0.34 1.60±0.43*1.26±0.53 0.65±0.08▲Bcl-2 0.35±0.09 0.58±0.15 1.28±0.17**0.51±0.12##1.79±0.35**1.33±0.50*Rb1 1.29±0.29 1.32±0.17 0.85±0.18 0.62±0.22*0.56±0.13*0.67±0.12*cIAP2 0.58±0.37 0.74±0.49 0.49±0.35 0.43±0.27 2.27±1.69 0.61±0.47

2.4 各組PASMC 細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白表達(dá)比較

見圖2、表4。和常氧對(duì)照組相比，隨著氧氣濃度降低，Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 蛋白水平升高，NOR-1、Rb1、蛋白水平降低，且1%氧氣對(duì)照組均具有顯著性差異（P＜0.05）；與對(duì)照血清組相比，含藥血清組在1%氧氣濃度下Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1 蛋白水平顯著降低，NOR-1、Rb1、蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。

圖2 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白條帶

圖3 各組細(xì)胞凋亡率

表4 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白灰度值比值比較（±s）

表4 各組Bcl-2、Cyclin D1、cIAP2、HIF-1、NOR-1、Rb1蛋白灰度值比值比較（±s）

組別常氧對(duì)照組常氧含藥組10%氧氣對(duì)照組10%氧氣含藥組1%氧氣對(duì)照組1%氧氣含藥組Bcl-2 0.66±0.10 0.61±0.04 0.77±0.03 1.07±0.04##1.37±0.12**▲▲0.97±0.06##Cyclin D1 0.93±0.16 0.90±0.12 1.20±0.16 1.08±0.11 1.57±0.18**1.10±0.14#NOR-1 1.19±0.07 1.29±0.04 0.92±0.08*1.08±0.01#0.81±0.17*1.14±0.06#▲cIAP2 0.67±0.10 0.53±0.06 0.75±0.03 0.70±0.05 1.31±0.09**▲▲1.09±0.00#▲Rb1 0.92±0.16 1.01±0.06 0.74±0.11 0.87±0.11 0.49±0.05**▲▲0.75±0.15#HIF-1 0.32±0.05 0.30±0.01 0.50±0.07*0.40±0.04 0.76±0.06**▲▲0.59±0.05#

2.5 各組PASMC細(xì)胞凋亡率比較

流式凋亡測(cè)定不同氧氣濃度下補(bǔ)元湯含藥血清對(duì)大鼠PASMC 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果示常氧對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（9.43±0.12）%，常氧含藥組為（5.70±0.42）%，10%氧氣對(duì)照組為（15.98±1.25）%，10%氧氣含藥組為（12.32±0.61）%，1%氧氣對(duì)照組為（28.62±1.54）%，1%氧氣含藥組為（4.06±0.28）%。隨著氧氣含量的下降，細(xì)胞凋亡程度增加（P＜0.01）；與同條件對(duì)照血清組相比，含藥血清的細(xì)胞凋亡程度減弱（P＜0.05）。

3 討 論

低氧可引起肺動(dòng)脈壓生理性升高，機(jī)體發(fā)生低氧性肺血管收縮，若低氧持續(xù)存在時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致不可逆性的肺血管重構(gòu)，肺循環(huán)阻力逐漸升高，出現(xiàn)不同程度的右心衰竭，甚至導(dǎo)致死亡。這也是低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）發(fā)病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。肺血管重構(gòu)包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、平滑肌細(xì)胞的增殖以及外膜纖維組織的增多等多種解剖性改變，其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的增殖和凋亡失衡是導(dǎo)致肺血管重塑的主要原因［5，10］。調(diào)節(jié)低氧導(dǎo)致的PASMCs 增殖和凋亡機(jī)制，對(duì)低氧性肺血管重構(gòu)治療干預(yù)非常重要。在該階段中，許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子觸發(fā)了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始的復(fù)雜而又交錯(cuò)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。但是，控制這些過程的基因尚未明確。亦有多項(xiàng)研究運(yùn)用基因表達(dá)分析技術(shù)，使此機(jī)制中新的轉(zhuǎn)錄因子不斷得到確認(rèn)，其間就有HIF-1、核受體NR4A 亞家族（NR4A3 為主，即NOR-1，屬于孤兒NR 類固醇/甲狀腺受體超家族，是早期反應(yīng)基因）及多種細(xì)胞周期蛋白。在HPVR 發(fā)生、炎癥反應(yīng)的復(fù)雜蛋白網(wǎng)絡(luò)中，是潛在的相關(guān)參與者。

本病可由多種肺系疾病反復(fù)發(fā)作，遷延而來。中醫(yī)學(xué)根據(jù)其臨床表現(xiàn)及疾病演變過程的認(rèn)識(shí)，可歸屬于“肺脹”“短氣”“喘促”的范疇［11-13］。該類患者大多體虛病久，損傷正氣，臟氣虛損，血行不暢，故痰凝血瘀，阻滯經(jīng)絡(luò)，主要責(zé)之于肺、心、腎，涉及肝脾，痰濁、血瘀、水飲為標(biāo)，氣虛為主。又因肺主氣、朝百脈，故將氣虛血瘀認(rèn)為是低氧性肺血管重構(gòu)中醫(yī)發(fā)病基礎(chǔ)，這也同時(shí)與HPVR時(shí)肺的微循環(huán)病理改變相對(duì)應(yīng)。

基于對(duì)HPVR 中醫(yī)病機(jī)的認(rèn)識(shí)，我們?cè)趪?guó)醫(yī)大師洪廣祥補(bǔ)元湯［14］的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，取得一定臨床療效，并通過前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的香煙煙霧及低氧環(huán)境暴露可以促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌的異常增殖，參與肺血管重構(gòu)，而補(bǔ)元湯能減輕大鼠肺部充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善COPD 大鼠氣道及肺血管重塑的程度。為了深入研究補(bǔ)元湯對(duì)低氧所致肺動(dòng)脈重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制，我們將大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于不同氧濃度下培養(yǎng)，模擬PASMC 所受低氧環(huán)境，鏡下大鼠PASMCs 在低氧環(huán)境下，數(shù)量變少、細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)型改變。

有研究［15］將肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，缺氧條件下，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡指數(shù)并無明顯差異，指出缺氧性肺血管改變與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡指數(shù)無相關(guān)性，認(rèn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在增殖過程中或不伴有凋亡水平的明顯改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)置于中度缺氧環(huán)境下（10%氧濃度），PASMC 細(xì)胞Bcl-2、cIAP2 上升，凋亡率較常氧組上升，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1 表達(dá)上升，信號(hào)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，使NOR-1 水平下調(diào)，Cyclin D1 上升，通過結(jié)合并激活G1 時(shí)期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1 期周期抑制蛋白（Rb1）被磷酸化，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1 時(shí)期進(jìn)入到S 時(shí)期，細(xì)胞增殖活力增加，可在一定程度上平衡甚至超過凋亡水平，從而促進(jìn)血管新生，造成肺動(dòng)脈的新生和重塑。當(dāng)氧濃度下降至1%后，隨著暴露時(shí)間的增加，PASMC 細(xì)胞活力較常氧及中度低氧環(huán)境明顯下降，表明長(zhǎng)期暴露于過度缺氧環(huán)境可使PASMC 細(xì)胞活力明顯下降，凋亡率亦上升，導(dǎo)致肺血管的萎縮、閉塞。經(jīng)補(bǔ)元湯含藥血清干預(yù)后，HIF-1、Cyclin D1 表達(dá)水平下調(diào)，NOR-1、Rb1 表達(dá)上調(diào)，使細(xì)胞周期停滯于G1 期，而Bcl-2、cIAP2 表達(dá)下調(diào)后，PASMC 細(xì)胞活力較常氧下降，但凋亡亦處于較低水平，這有可能延緩肺動(dòng)脈的重構(gòu)，維持肺部血管功能［16-20］。

綜上所述，本研究通過建立PASMC 低氧模型驗(yàn)證了補(bǔ)元湯抑制HIF-1、Cyclin D1 表達(dá)，上調(diào)NOR-1、Rb1，抑制Bcl-2 及cIAP2 表達(dá)水平，降低PASMC 細(xì)胞增殖活力，并使其凋亡亦處于較低水平，從而發(fā)揮對(duì)HPVR 的治療作用。由于HPVR 發(fā)病因素復(fù)雜，病情發(fā)展過程受眾多因素調(diào)控，補(bǔ)元湯對(duì)于HPVR 是否有其他作用機(jī)制尚有待深入研究。