響應面法優(yōu)化桂花發(fā)酵液及其抗氧化能力測定

王 玥，陳洪國，史玉敏，嚴 恒

（1.湖北科技學院，a.藥學院，b.核技術(shù)與化學生物學院∕國家林業(yè)草原桂花工程技術(shù)研究中心，湖北 咸寧 437100；2.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，武漢 437000）

桂花（Osmanthussp.）又名巖桂，系木犀科木犀屬，常綠灌木或小喬木，是中國十大傳統(tǒng)名花之一［1］。桂花富含酚類物質(zhì)，具有抗炎、防癌等功能活性［2］，還具有抗氧化和清除自由基作用［3］。桂花資源豐富、價格低廉、具有食療藥用雙重價值，可化痰、散瘀、利腎、舒筋活絡［4］。桂花含有糖類、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素C、黃酮及多種礦物質(zhì)元素。乳酸菌具有較高營養(yǎng)價值，不僅有調(diào)節(jié)腸胃功能、促進新陳代謝等各種營養(yǎng)保健作用，而且具有溶解乳糖不耐癥、改善腸道菌群、改善便秘和降低人體膽固醇水平等功能［5］。黃酮的提取方法很多，相對于其他提取方法，以微生物發(fā)酵法提取植物中活性成分毒副作用更?。?］，活性物質(zhì)的效力更大。因此，本研究通過微生物發(fā)酵法制備桂花發(fā)酵液，測定其抗氧化功能，以期為桂花在食品和化妝品配方中功效性的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

桂花，采摘盛花期新鮮的桂花花瓣，采自咸寧市；保加利亞乳桿菌，由上海寶藏生物技術(shù)中心提供；乙酸、乙醇等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

HH-S4 型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司；BJ-300A 型高速多功能粉碎機，德清拜杰電器有限公司；FA2004 型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；XSP-C204 型顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；FS-70B 型恒溫培養(yǎng)搖床，菲斯福儀器（河北）有限公司；UV-8000S 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桂花發(fā)酵液及水提液的制備 鮮桂花發(fā)酵液的制備：取-20 ℃鮮桂花6 g，按照料液比1∶25（g∶L，下同）加入去離子水，加入纖維素酶40 mg∕L，于45 ℃水浴酶解1 h 后于70 ℃恒溫水浴1.5 h，過濾后加入0.05 g∕L 抗壞血酸和0.04 g∕L 檸檬酸護色，滅菌后接入7%的乳酸菌培菌液，放于37 ℃、180 r∕min 培養(yǎng)箱中36 h。將桂花發(fā)酵液二次滅菌冷卻后，5 000 r∕min 離心10 min，取上清液過膜。桂花水提液的制備方法同發(fā)酵液（不接菌）。

干桂花發(fā)酵液的制備：取干桂花6 g，采用粉碎機磨成粉，按照料液比1∶25 加入去離子水，加入纖維素酶40 mg∕L，于45 ℃水浴酶解1 h 后于70 ℃恒溫水浴1.5 h，抽濾后加入0.05 g∕L 抗壞血酸和0.04 g∕L檸檬酸護色，滅菌后接入7%的乳酸菌培菌液，放于37 ℃、180 r∕min 培養(yǎng)箱中36 h。將桂花發(fā)酵液二次滅菌冷卻后，5 000 r∕min 離心10 min，取上清液過膜。干桂花水提液的制備方法同發(fā)酵液（不接菌）。

1.2.2 單因素試驗 對影響發(fā)酵結(jié)果的發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間［7］3 個因素進行單因素試驗逐一優(yōu)化，考察發(fā)酵溫度（22、25、28、31、34 ℃）、接種量（3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵時間（28、32、36、40、44 h），采用梯度稀釋平板計數(shù)法測其菌落數(shù)［8］。

1.2.3 響應面設(shè)計 以發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間3 個因素作為響應變量，利用Design-expertV8.0.6.1軟件，按照Box-Behnken 試驗設(shè)計，以桂花發(fā)酵液中活菌數(shù)為響應值，通過響應面曲面分析進行試驗條件的優(yōu)化，響應面因素與水平設(shè)計如表1 所示。

表1 響應面因素與水平設(shè)計

1.2.4 總黃酮含量測定 吸取1.0 mL 的鮮桂花發(fā)酵液及水提液和干桂花發(fā)酵液及水提液，分別測定總黃酮的含量。使用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量。標準曲線的制作與樣品中總黃酮含量的測定參考文獻［9］。

1.2.5 總酚含量測定 吸取0.5 mL 的鮮桂花發(fā)酵液及水提液和干桂花發(fā)酵液及水提液，分別測定總酚的含量。采用Folin-Ciocalteu 比色法測定總酚含量。精確稱取沒食子酸標準品0.01 g，添加去離子水溶解定容于100 mL 容量瓶，搖勻得0.1 mg∕mL 標準溶液，制作標準曲線。分別量取0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mL 標準溶液于12.5 mL 試管中，加蒸餾水至1 mL，分別加福林酚試劑0.5 mL搖勻，每組試驗重復3 次，避光反應2 h，在765 nm 波長下測吸光度［10］。

1.2.6 DPPH 自由基清除率測定 稱取DPPH 5.0 mg，用適量無水乙醇溶解，避光超聲使其充分溶解，再用無水乙醇定容至100 mL，配成50.0 μg∕mL 的DPPH 溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。檢測時移取100 μL 待測樣品于混合液中，快速搖勻，以無水乙醇為空白在波長517 nm 處測吸光度［11］。

式中，Ac為2 mL 無水乙醇加2 mL DPPH 溶液的吸光度；Ai為2 mL DPPH 溶液加100 μL 待測液的吸光度；Aj為2 mL無水乙醇加100 μL待測液的吸光度。1.2.7 ABTS 自由基清除率測定 吸取100 μL 待測液，測定ABTS 清除率。ABTS 溶液配制及測定方法參考文獻［12］。

式中，A空白為ABTS 溶液的吸光度，A樣品為2 mL ABTS 加100 μL 待測液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響 當接種量為7%、發(fā)酵時間為36 h，發(fā)酵溫度在22～28 ℃時，活菌數(shù)呈上升趨勢，然后隨發(fā)酵溫度升高而下降（圖1）。較低或較高溫度都不利于乳酸菌生長［13］，在發(fā)酵溫度為28 ℃時乳酸菌活菌數(shù)最多，因此選擇28 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

2.1.2 接種量對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響 當發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時間為36 h，接種量在3%～7%時，活菌數(shù)上升較快，當接種量為7%時活菌數(shù)最高。當接種量繼續(xù)增加，由于營養(yǎng)物質(zhì)無法保證乳酸菌正常生長所需，因此活菌數(shù)下降（圖2）。過大的接種量也會使營養(yǎng)物質(zhì)不充分，導致菌體產(chǎn)生過多的代謝副產(chǎn)物，進而造成菌體死亡［14］。因此，選擇7%為最佳接種量。

圖2 接種量對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響 當發(fā)酵溫度為28 ℃、接種量為7%，發(fā)酵時間在28～36 h 時，活菌數(shù)逐漸升高，而后活菌數(shù)逐漸下降（圖3）。發(fā)酵時間短使得發(fā)酵不充分；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵越完全，活菌數(shù)逐漸升高，但是時間過長會使乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生其他物質(zhì)，造成發(fā)酵液質(zhì)量下降，因此，選擇36 h 為最佳發(fā)酵時間。

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果

Box-Behnken 響應面試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。經(jīng)過Design-expertV8.0.6.1 軟件多元回歸擬合，得到桂花發(fā)酵液活菌數(shù)的預測模型方程Y=11.5 + 0.210A+ 0.910B+ 0.050C+ 0.000AB+0.075AC+0.025BC-3.000A2-1.950B2-1.970C2，其中，Y為桂花發(fā)酵液活菌數(shù)，A為發(fā)酵溫度，B為接種量，C為發(fā)酵時間。

表2 Box-Behnken 響應面試驗因素水平及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3 可知，該回歸方程模型顯著（P＜0.000 1）可以很好地描述各變量與響應值的變化關(guān)系；擬合模型方程的R2=0.999 1，證明因變量與自變量線性關(guān)系顯著，模型可解釋99.91%的響應變化。調(diào)整后R2為0.997 9，證明模型可解釋99.79%的響應值變化。通過比較F值可知，影響因素排序為B＞A＞C，即接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。

兩兩因子的相互作用對響應值影響的響應面分析結(jié)果見圖4。響應面和等高線反映了3 個因素之間的交互作用對響應值的影響，若等高線的坡度較平緩，形近圓形，則交互作用不明顯；若等高線的坡度較陡峭，形狀偏橢圓形，則說明交互作用較明顯。由圖4 可知，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度、接種量與發(fā)酵時間的交互作用較明顯。采用響應面尋優(yōu)分析方法描述回歸模型，預測最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、發(fā)酵時間34 h。

為了驗證試驗結(jié)果，采用以上工藝條件進行調(diào)配，得到桂花發(fā)酵液活菌數(shù)的平均值為14.47×108CFU∕mL，與理論預測值14.10×108CFU∕mL 僅相差0.37×108CFU∕mL，說明試驗結(jié)果準確性較好。

2.3 鮮/干桂花水提液與發(fā)酵液總黃酮和總酚含量測定結(jié)果

試驗結(jié)果見圖5，鮮桂花發(fā)酵液總黃酮含量（0.250 mg∕g）比水提液（0.225 mg∕g）提高了11.1%，發(fā)酵液總酚含量（0.450 mg∕g）比水提液（0.400 mg∕g）提高了12.5%；干桂花發(fā)酵液總黃酮含量（2.000 mg∕g）比水提液（1.750 mg∕g）提高了14.3%，發(fā)酵液總酚含量（3.500 mg∕g）比水提液（3.000 mg∕g）提高了16.7%。由此可知，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可以提高桂花中總黃酮和總酚的含量。

圖5 鮮/干桂花水提液與發(fā)酵液總黃酮和總酚含量對比

2.4 桂花發(fā)酵液抗氧化功效評價

2.4.1 DPPH 自由基清除率 桂花發(fā)酵液與水提液對DPPH 自由基的清除效果如圖6 所示。鮮桂花發(fā)酵液與水提液DPPH 自由基清除率分別為67.00%、60.00%；干桂花發(fā)酵液與水提液DPPH 自由基清除率分別為84.00%、59.00%。由此可知，干桂花發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率與水提液的自由基清除率差異較大，而鮮桂花則差異不大。

圖6 鮮/干桂花水提液與發(fā)酵液DPPH 與ABTS 自由基清除率對比

2.4.2 ABTS 自由基清除率 桂花發(fā)酵液與水提液對ABTS 自由基清除效果見圖6，鮮桂花發(fā)酵液與水提液ABTS 自由基清除率分別為72.00%、31.83%；干桂花發(fā)酵液與水提液ABTS 自由基清除率分別為73.71%、69.65%。對該數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，鮮桂花發(fā)酵液與水提液對ABTS 自由基清除率差異較大，而干桂花則差異較小。

3 結(jié)論

本研究利用響應面法優(yōu)化了桂花發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、發(fā)酵時間34 h，該條件下桂花發(fā)酵液活菌數(shù)最多。

以乳酸菌分別對鮮桂花和干桂花進行發(fā)酵得到桂花發(fā)酵液，干桂花發(fā)酵液對DPPH、ABTS 自由基清除率分別為84.00%、73.71%，干桂花水提液對DPPH、ABTS 自由基清除率分別為59.00%、69.65%；干桂花發(fā)酵液較發(fā)酵前對DPPH、ABTS 自由基清除率分別提高了25.00、4.06 個百分點。干桂花發(fā)酵液中總黃酮含量為2.000 mg∕g，比發(fā)酵前提高了14.3%，總酚含量為3.500 mg∕g，比發(fā)酵前提高了16.7%。說明桂花發(fā)酵可有效提升桂花中總黃酮和總酚含量，其抗氧化能力也有明顯提升。