不同波長(zhǎng)光照對(duì)周氏嚙小蜂黑視蛋白基因表達(dá)的影響

劉新宇，王 靜，潘麗娜，李 敏

（1.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心，河南 漯河 462300）

多數(shù)種類的昆蟲存在趨光行為，這對(duì)尋找食物、交配和搜尋產(chǎn)卵場(chǎng)所等行為起到重要作用［1］。了解昆蟲對(duì)光的趨向性有助于對(duì)昆蟲的研究和管理，對(duì)趨光性加以利用，可應(yīng)用于如標(biāo)本采集、檢查檢疫、害蟲治理、昆蟲的監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)等工作?；谌找鎳?yán)峻的生態(tài)環(huán)境及人類健康問(wèn)題，利用昆蟲趨光性進(jìn)行害蟲防治具有重要的優(yōu)勢(shì)，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)昆蟲趨光性機(jī)理領(lǐng)域的研究日益增多與深入。

不同昆蟲對(duì)特定范圍光譜的趨性反應(yīng)有正負(fù)之分，其對(duì)特定波長(zhǎng)的光具有敏感性，是因?yàn)閺?fù)眼小眼或單眼內(nèi)有對(duì)特定頻率光波響應(yīng)的視覺(jué)細(xì)胞，這些細(xì)胞的細(xì)胞膜上存在感光的視蛋白［2，3］。其中，黑視蛋白是一種研究較廣泛的視蛋白［4-7］，Provencio等［8］從爪蟾（Xenopus laevis）皮膚黑素細(xì)胞和眼中提取分離出具有視蛋白基本結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在其敏感光波方面，Panda 等［9］測(cè)定黑視蛋白對(duì)479 nm 波長(zhǎng)的光波有最大響應(yīng)。此外，有文獻(xiàn)記載，人類黑視蛋白最大波長(zhǎng)為483 nm、獼猴的為482 nm、小鼠的為481 nm、大鼠的為84 nm［10］。還有研究表明，黑視蛋白的感光功能獨(dú)立于視覺(jué)系統(tǒng)［11］。黑視蛋白有著調(diào)節(jié)生物晝夜節(jié)律、成像反應(yīng)的功能［8］，關(guān)于黒視蛋白的研究主要集中在脊椎動(dòng)物中［12-15］，在無(wú)脊椎動(dòng)物中較少涉及。經(jīng)NCBI 上檢索，在昆蟲中僅有瓜實(shí)蠅（Bactrocera cucurbitae）、切葉蟻（Acromyrmexechinatior）、豆莢草盲蝽（Lygus hesperus）、掠猛蟻屬（Harpegnathos）、柑橘木虱（Diaphorina citri）和中華蜜蜂（Apis cerana）等物種的相關(guān)序列信息。

美國(guó)白蛾（Hyphantria cunea），又名美國(guó)燈蛾、秋幕毛蟲，屬鱗翅目燈蛾科白蛾屬，是中國(guó)重要的入侵農(nóng)業(yè)害蟲，可危害200 多種林木、果樹(shù)、農(nóng)作物和野生植物，最嗜食桑、白蠟槭，其次為梧桐、李、櫻桃等［16］，已被列入中國(guó)首批外來(lái)入侵物種。由于化學(xué)防治對(duì)環(huán)境造成的危害嚴(yán)重，并且美國(guó)白蛾的寄主分布廣泛，美國(guó)白蛾的生物防治逐步引起人們的重視，常用周氏嚙小蜂來(lái)控制美國(guó)白蛾的數(shù)量。

周氏嚙小蜂（Chouioia cuneaYang）是美國(guó)白蛾蛹期的重要寄生性天敵，體長(zhǎng)1.1～1.5 mm，群集內(nèi)寄生于美國(guó)白蛾蛹中，是美國(guó)白蛾的主要天敵，對(duì)抑制美國(guó)白蛾的危害起到重要作用［17］。試驗(yàn)觀察中證實(shí)周氏嚙小蜂對(duì)光具有很強(qiáng)的趨性，但其趨光性分子機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

本研究對(duì)周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因進(jìn)行了克隆及分析，并研究了經(jīng)不同波長(zhǎng)光照處理后，利用qPCR 技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)差異，繼而探究周氏嚙小蜂趨光性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及處理

周氏嚙小蜂為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：于PQX-350H 型人工氣候箱中，溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，光周期L∶D = 14 h∶10 h。接種于柞蠶蛹中，待成蟲羽化后，從蛹中飛出，收集羽化24 h 內(nèi)的周氏嚙小蜂進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

選取試驗(yàn)光源為紅色光（波長(zhǎng)在625～740 nm）、黃色光（565～590 nm）、藍(lán)色光（440～490 nm）和白色光4 種顏色的LED 燈，4 個(gè)經(jīng)過(guò)DEPC 水處理與高溫蒸氣滅菌處理的透明離心管。南孚電池、導(dǎo)線、電池盒（用于為不同波長(zhǎng)光源供電），TES1330A 型照度計(jì)（臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司），紗布，脫脂棉，并利用瓦楞紙自制暗室。

以并聯(lián)方式連接好LED 燈，用照度計(jì)測(cè)量LED燈垂直照射6 cm 處的光照度，通過(guò)添加LED 燈或在燈上用棉花和紗布使其光照度穩(wěn)定在50～60 lx。將測(cè)完光照度的LED 燈按照顏色分別從暗室頂部插入，插入時(shí)可從暗室頂部開(kāi)出小孔。取羽化24 h 內(nèi)的周氏嚙小蜂于離心管中，在4 種光波下照射2 h，之后立即浸于RNAlater（Ambion 公司，AM7020）中備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)之前周氏嚙小蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果得到的黑視蛋白Melanopsin基因，由Primer5 和DNAman 軟件設(shè)計(jì)目的基因Melanopsin實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增引物。目的片段大小為100～200 bp，其中內(nèi)參基因?yàn)間lyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GADPH），引物序列見(jiàn)表1，由北京奧維森基因科技有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 中使用的引物序列

1.4 總RNA 提取

總RNA 的提取參照RNeasyMini Kit 說(shuō)明書步驟，用RNase 處理總RNA，去除總RNA 中殘存的基因組DNA（均為TRAN公司產(chǎn)品）。超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）在波長(zhǎng)260、280 nm 處測(cè)定其濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.5 cDNA 合成

取不同處理總RNA 各5 μL 分別與1 μL 的Random Primer（N9）（0.1 μg∕μL）、10 μL 的2×TS Reaction Mix、1 μL 的TransScript?RT∕RI Enzyme Mix，然后用Rnase-free Water 補(bǔ)足20 μL，將混合體系于恒溫水浴鍋中先于25 ℃孵育10 min，再于42 ℃中孵育30 min，最后在85 ℃加熱5 min 失活TransScript?RT，將cDNA 樣品于-20 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量檢測(cè)Melanopsin表達(dá)

Real-time PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中3 μL cDNA 樣品（水為空白對(duì)照），引物為100 ng∕μL。實(shí)時(shí)定量PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。

檢測(cè)每個(gè)樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，每個(gè)樣品設(shè)置3 次重復(fù)，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品所含的模板量，比較目的基因Mel和內(nèi)參基因GADPH的初始模板量，即可得出目的基因的表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析4 種顏色的光處理對(duì)黑視蛋白基因表達(dá)的影響，采用ANOVA 方差分析交配對(duì)Mel表達(dá)的影響。數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 16.0 進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 試驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示。不同波長(zhǎng)的光對(duì)周氏嚙小蜂黑視蛋白基因的表達(dá)量具有一定影響。白色光對(duì)黑視蛋白基因的表達(dá)無(wú)明顯的促進(jìn)作用。在單色光中，黃色光激發(fā)的表達(dá)量最大（9.99），顯著大于其他光處理（P＜0.05），其次為藍(lán)色光（6.66），其表達(dá)量顯著高于紅色光和白色光；最小的是紅色光（1.18），其表達(dá)量低于白色光（2.41），但二者之間差異不顯著。由此可知，周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因?qū)S色光波最敏感。此外，根據(jù)白色光和黃色光激發(fā)的表達(dá)量，在黃色光波段，光強(qiáng)對(duì)黑視蛋白基因的激發(fā)量有顯著影響。

圖1 4 種波長(zhǎng)的光照射周氏嚙小蜂2 h 后黑視蛋白基因表達(dá)量

3 小結(jié)與討論

已知黑視蛋白在脊椎動(dòng)物中對(duì)波長(zhǎng)在481 nm（屬于藍(lán)色光范圍）附近的光波最為敏感［10］。本試驗(yàn)表明，在周氏嚙小蜂中，最能促進(jìn)黑視蛋白基因表達(dá)的是黃色光波（565～590 nm）。此外，相對(duì)于特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光波，復(fù)合的白色光波對(duì)黑視蛋白并無(wú)明顯的促進(jìn)作用。白色光是具有連續(xù)光譜的復(fù)合光，在光子層面表現(xiàn)為能量分布符合E=hv（E為能量，h為普朗克常量，v為光的頻率），該公式表明在一定光強(qiáng)度下，單位時(shí)間內(nèi)LED 燈發(fā)射有限的特定能量的光子，當(dāng)光照度在恒定的范圍內(nèi)，光子的總能量保持不變，當(dāng)光子的頻率范圍拓寬時(shí)（白光），高頻率的光子數(shù)量減少，導(dǎo)致頻率處于黃色光范圍內(nèi)的光子數(shù)量減少，進(jìn)而使得黑視蛋白表達(dá)量下降。

結(jié)果表明，周氏嚙小蜂的黑視蛋白基因?qū)S色光波敏感，可能與基因中存在對(duì)565～590 nm 波長(zhǎng)光敏感的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有關(guān)。此外，根據(jù)白色光和黃色光激發(fā)的表達(dá)量，在黃色光波段，光強(qiáng)對(duì)黑視蛋白基因的激發(fā)量有顯著影響。

光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子屬于天然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子位于環(huán)境應(yīng)答基因的上游。在植物中，光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較常見(jiàn)，其常有若干個(gè)光應(yīng)答原件，如G-box、Z-Box、AT-rich 序列等，這些元件對(duì)光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活是必須的［18］。本研究結(jié)果將有助于了解周氏嚙小蜂的趨光性機(jī)理，為更加科學(xué)合理地利用周氏嚙小蜂積累相關(guān)數(shù)據(jù)。但關(guān)于周氏嚙小蜂體內(nèi)的黃色光敏感的黑視蛋白基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。