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    云南省不同地區(qū)滇黃精的分子生物學(xué)鑒定

    2023-10-30 08:51:50寧晨晨劉強(qiáng)麗丁子航夏婷婷施建蓮
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年9期
    關(guān)鍵詞:卷葉黃精藥材

    寧晨晨,劉強(qiáng)麗,丁子航,夏婷婷,施建蓮,韋 瑾

    (1.云南新興職業(yè)學(xué)院,云南 昆明 650500;2.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院,云南 昆明 650106;3.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 武威 733006)

    滇黃精(Polygonatum kingianumColl.et Hem sl.)隸屬于百合科黃精屬,主要分布于云南、四川、貴州等地[1],其干燥根莖是中藥黃精的重要來源之一。大量的研究資料表明,滇黃精根莖較為粗大,有效成分含量高,是黃精藥材中質(zhì)量較好的品種之一[2]。根據(jù)其形態(tài)不同,又有“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”等不同習(xí)稱[3]。云南是滇黃精的主產(chǎn)區(qū),當(dāng)?shù)鼐用駥ⅫS精入藥的歷史悠久?!兜崮媳静荨贰对颇现参镏尽返戎芯悬S精藥用的記載,因此黃精是一種重要的“云藥”品種[4]。

    現(xiàn)代化學(xué)及藥理作用研究表明,黃精中含有多糖、甾體皂苷、三萜皂苷、黃酮類等多種重要成分,有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效,還有降血糖血脂、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老以及提高記憶能力的作用,在高血壓、高血脂、糖尿病等疾病的治療中廣泛應(yīng)用[5-8]。此外,黃精富含淀粉、多糖及其他營(yíng)養(yǎng)成分,保健功能突出,且味甜爽口,是優(yōu)良的藥食同源植物,在保健食品開發(fā)領(lǐng)域顯示出了較高的價(jià)值[9-10]。滇黃精作為藥用黃精的主要品種,產(chǎn)量及市場(chǎng)份額大,在當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中占據(jù)重要地位。

    滇黃精長(zhǎng)期以野生資源供應(yīng)市場(chǎng),隨著人們對(duì)滇黃精需求量的日益增加,野生藥材被過度采挖,導(dǎo)致野生黃精類群大量減少,已遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要,常常出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面[11]。董治程[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn),滇黃精主要分布在貴州、云南師宗和楚雄以及大理地區(qū),野外已很難發(fā)現(xiàn)其蹤跡。目前,人工栽培的滇黃精漸漸進(jìn)入市場(chǎng),在云南大理、紅河、普洱、臨滄等地種植面積已具備一定規(guī)模[13]。然而,人工種植的品種來源不一,加上本種形態(tài)變異相當(dāng)大[2],易與其他種混淆,因此種植品種混亂的情況常有發(fā)生,導(dǎo)致藥材質(zhì)量無法精準(zhǔn)控制,而傳統(tǒng)的鑒別方式有時(shí)難以區(qū)分,極易誤用,嚴(yán)重影響用藥效果和用藥安全[14]。

    DNA 分子鑒定具有分子信息量大,且不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響,準(zhǔn)確性高、客觀性強(qiáng),可快捷、準(zhǔn)確地進(jìn)行植物分類、系統(tǒng)發(fā)育和鑒定分析。中藥材DNA 條形碼已被納入《中國(guó)藥典》(2020),為中藥材建立了“基因身份證”,可從基因?qū)用娼鉀Q中草藥與混偽品的物種識(shí)別問題。Chen 等[15]建議將ITS2 作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA 條形碼,同時(shí)建議將ITS2 作為新的通用條形碼用于鑒定更廣泛的植物類群。楊培等[16]在黃精屬藥用植物的DNA 條形碼鑒定研究中認(rèn)為,葉綠體全序列或通過葉綠體全序列篩選合適的DNA 片段可能是該屬藥用植物分子鑒定的方向。叢悅等[17]采用葉綠體基因(cpDNA)非編碼區(qū)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbAtrnH序列探索3 種黃精的基源分子鑒定方法,認(rèn)為葉綠體rpl20-rps12 片段序列更適合黃精的基源鑒定。該研究在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用核糖體RNA(rRNA)基因轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS2序列及cpDNA 非編碼區(qū)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH序列對(duì)不同來源的滇黃精進(jìn)行分子鑒定,以初步了解實(shí)際流通中黃精藥材的基源,探究在滇黃精藥材資源利用過程中是否存在品種混淆的問題。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    該研究從云南省多個(gè)地區(qū)的黃精種植戶手中共收集22 份滇黃精樣品,大多為根狀莖,少數(shù)帶有莖和葉片,極個(gè)別為植物全株,全株樣品進(jìn)行了一段時(shí)間的培養(yǎng),各樣品信息見表1。

    表1 22 份滇黃精樣品的基本信息

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 總DNA 提取 將樣品清洗干凈并干燥,根狀莖樣品取30~50 mg,葉類樣品取約20 mg,置于DNA 提取研磨機(jī)內(nèi)將樣品打碎至粉末。隨后利用植物組織基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行總DNA 提取。用滅菌雙蒸水溶解提取的DNA,保存于-20℃冰箱待用。

    1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 PCR 擴(kuò)增體系:在無菌PCR 管中分別加入10×擴(kuò)增緩沖液(含MgCl2)2.5 μL、前后引物各1 μL、原濃度dNTP 1 μL、DNA 模板1 μL、TaqDNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL),再加入滅菌的雙蒸水調(diào)節(jié)體積至25 μL。試驗(yàn)所用的PCR擴(kuò)增引物見表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件參考他人文獻(xiàn)[15,17]進(jìn)行設(shè)置。擴(kuò)增產(chǎn)物用加有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,在紫外儀下檢測(cè)顯示單一明亮條帶。PCR 產(chǎn)物純化后送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致,如果1/3 序列為重峰時(shí),需再用正向引物測(cè)序。

    表2 PCR 擴(kuò)增引物序列

    1.2.3 序列處理與數(shù)據(jù)分析 將測(cè)序色譜峰圖用Bioedit 打開,檢查測(cè)序質(zhì)量,確保堿基準(zhǔn)確性。經(jīng)Bioedit 檢查后的序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì),確認(rèn)其近緣種類,GenBank 中獲取的序列信息詳見表3。自測(cè)序列片段和GenBank 下載的序列全部轉(zhuǎn)換為 FASTA 格式,采用muscle 對(duì)序列進(jìn)行自動(dòng)比對(duì),用Bioedit 進(jìn)行人工校對(duì)和編輯,采用MEGA7.0.26構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹。

    表3 GenBank 中獲取的序列及其信息

    2 結(jié)果與分析

    通過DNA 提取及擴(kuò)增,除去少數(shù)樣品DNA 片段測(cè)序失敗或峰形重疊無法使用,共成功獲取rpl20-rps12 片段(700~900 bp)序列7 條,trnL-trnF片段(300~400 bp)序列13 條,psbA-trnH片段(400~600 bp)序列21 條,ITS2 片段(300~400 bp)序列22 條,測(cè)序結(jié)果及序列片段長(zhǎng)度見表4。

    表4 22 份滇黃精樣品的測(cè)序結(jié)果

    由于rpl20-rps12 片段、trnL-trnF片段擴(kuò)增成功率較低,且從GenBank 上能獲取的參考序列不足,因此未對(duì)上述2 個(gè)DNA 片段進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)發(fā)育分析。將各樣品的psbA-trnH片段序列、ITS2 片段序列和GenBank 下載的相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,分別得到psbA-trnH、ITS2 這2 個(gè)序列的NJ 樹(圖1 和圖2)。

    圖1 基于葉綠體psbA-trnH 序列的NJ 樹

    圖2 基于ITS2 序列的NJ 樹

    由圖1 和圖2 可知,2 個(gè)基因片段均可在一定程度上將不同種的黃精屬植株區(qū)分開來,具有一定的物種鑒別能力,但總體來說,分辨能力并不強(qiáng),分支支持率不高,尤其是ITS2序列較psbAtrnH序列鑒別能力更弱,不能明顯地從ITS2序列的NJ 樹上看出同一物種的分布趨勢(shì)。而psbA-trnH序列基本能將大多數(shù)物種區(qū)分開來,除多花黃精(P.cyrtonema)、卷葉黃精(P.cirrhifolium)分散在多個(gè)分支中,其余物種聚類較明顯,參考序列與樣品序列在NJ 樹中的分布有一定的規(guī)律性,可初步作為物種鑒定的依據(jù)。

    由 圖1 可 以 看 出, 樣 品LQL01、LQL9、LQL10、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 顯 示 與多花黃精聚在一起形成多個(gè)分支,而在ITS2 序列的NJ 樹中,LQL01 更傾向于與滇黃精聚在一起,LQL09、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 與 多 花黃精聚在一起,而LQL10 與玉竹(P.odoratum)聚為一支,LQL21 則不能明確鑒定。結(jié)合樣品植物形態(tài)的觀察,LQL09、LQL16、LQL19、LQL20 和LQL21 同多花黃精相似,均為連珠狀或結(jié)節(jié)成塊根莖,葉互生,橢圓形、卵狀披針形至矩圓狀披針形,由此可初步將上述5 個(gè)樣品鑒定為多花黃精,而LQL10 與玉竹形態(tài)特征相似,因此初步鑒定為玉竹。

    樣 品LQL03、LQL13、LQL22 在psbA-trnH序列NJ 樹中較好地與輪葉黃精(P.verticillatum)聚為一支,而在ITS2 序列的NJ 樹中,LQL13、LQL22與輪葉黃精聚在一起,但LQL03 獨(dú)自為一支。根據(jù)形態(tài)特征,LQL03、LQL13、LQL22 這3 個(gè)樣品形態(tài)與輪葉黃精比較一致,根狀莖一頭粗,一頭較細(xì),粗的一頭有短分枝,葉多為3 葉輪生,條狀披針形,植株較高,因此可鑒定為輪葉黃精。

    樣 品LQL12、LQL17 在psbA-trnH序 列NJ 樹中與卷葉黃精(P.cirrhifolium)聚為一支,而在ITS2 序列NJ 樹中這2 個(gè)樣品同樣與卷葉黃精聚在一起但形成2 個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)特征,初步鑒定這2 個(gè)樣品為卷葉黃精,形態(tài)上均呈現(xiàn)出根狀莖連珠狀,葉4~6 枚輪生,細(xì)條形至條狀披針形,先端拳卷或彎曲成鉤狀,花序輪生。

    樣品LQL04、LQL05、LQL06、LQL07 在2 種NJ 樹中均聚在一起,在psbA-trnH序列NJ 樹中位置與滇黃精靠近。結(jié)合樣品本身形態(tài),根狀莖近圓柱形或近連珠狀,多枚葉片輪生,條形、條狀披針形或披針形,先端拳卷。綜合考慮將上述4 個(gè)樣品鑒定為滇黃精。

    此外,樣品LQL02、LQL08、LQL11、LQL14、LQL15 在2 個(gè)NJ 樹中位置比較模糊,但總體來說比較接近滇黃精的位置,且形態(tài)特征上支持其為滇黃精或卷葉黃精。另外,LQL01 雖然在psbA-trnH序列NJ 樹中與多花黃精聚在一起,但形態(tài)上更接近于滇黃精,需要結(jié)合更多證據(jù)進(jìn)一步研究。

    綜上所述,得到初步鑒定結(jié)果如表5 所示,在收集的22 份樣品中,初步判定可能為滇黃精的有11份,可能為卷葉黃精的有7 份,其中暫無法確定為滇黃精或者卷葉黃精的有5 份,鑒定為輪葉黃精的有3 份,玉竹1 份,多花黃精5 份。

    表5 DNA 分子初步鑒定結(jié)果

    3 討 論

    該研究對(duì)收集自云南省不同地區(qū)的22 份滇黃精樣品進(jìn)行了DNA 序列的分析,從分子水平探究了實(shí)際流通中黃精藥材的基源。結(jié)果表明,收集的22 份樣品都屬于黃精屬植物,其中大部分基源是準(zhǔn)確的,有11 份初步判斷或者推測(cè)可能是真正的滇黃精,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有一部分可能是與其形態(tài)較為相似的如多花黃精、輪葉黃精、卷葉黃精或玉竹等種類。由此可見,云南省目前各地種植的滇黃精存在一定量的混淆品,這些混淆品也可以作為黃精藥用,但藥效、成分都與滇黃精有所區(qū)別,如果混用將影響用藥的安全性和有效性。這些混淆品藥用部位形態(tài)與滇黃精基本相似,均為不規(guī)則塊狀或連珠狀,但通過進(jìn)一步觀察植株形態(tài)可發(fā)現(xiàn),它們的地上部分還是有所差別的。例如多花黃精,其根莖雖與黃精形似,但植物葉片生長(zhǎng)方式為對(duì)生,而滇黃精的葉片為輪生,其次植株高度、花的形態(tài)、葉片形態(tài)也均有差別。因此,如果僅以根莖部位作為辨認(rèn)藥材的依據(jù),很容易與其相似植物混淆。其次,有些混淆品與滇黃精在植株整體形態(tài)上確實(shí)很難區(qū)分,如卷葉黃精,無論葉的形態(tài)還是根莖均與滇黃精極為相似,從形態(tài)上很難辨別,這無疑增加了準(zhǔn)確使用黃精藥材的難度。另外,根據(jù)筆者的調(diào)研采訪,發(fā)現(xiàn)大多種植戶對(duì)于自家種植的滇黃精的基源并不十分清楚,這是導(dǎo)致滇黃精種植基源模糊的重要原因。

    《中國(guó)藥典》中標(biāo)明,藥材黃精來自于黃精屬植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖,按形狀不同,習(xí)稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”。但這些習(xí)稱分別代表何種黃精物種并沒有明確區(qū)分,可見黃精藥材包括滇黃精等植物,由于形態(tài)多變,依據(jù)傳統(tǒng)的方法無法準(zhǔn)確鑒定。因此,有必要找尋更方便有效的基源鑒別方式,如DNA 分子鑒定。目前,基于ITS 序列的植物類藥材DNA 條形碼鑒定體系已經(jīng)初步建立,但該研究顯示,以ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)于鑒定黃精屬植物依然存在困難,ITS2 序列無法高效地將不同種的黃精屬植物辨別開來,而葉綠體基因psbA-trnH序列分辨效果相對(duì)較好,可初步將其作為黃精屬藥材分子鑒定的片段使用。然而,對(duì)于根莖類藥材,市場(chǎng)上多見為干燥藥材或者中藥飲片及粉末,DNA 破壞嚴(yán)重,提取困難,加上葉綠體基因片段提取技術(shù)要求高,難以廣泛推廣使用。該研究嘗試用不同的引物序列(rpl20-rps12、trnLtrnF、psbA-trnH、ITS2)來擴(kuò)增黃精的DNA,從而獲取不同的片段進(jìn)行聚類分析,初步探索了分子鑒定在滇黃精基源鑒別上的應(yīng)用效果。筆者認(rèn)為DNA分子鑒定在一定程度上確實(shí)可以作為黃精類藥材基源鑒定的依據(jù),但該技術(shù)仍需進(jìn)一步完善和驗(yàn)證。

    因時(shí)間和條件限制,該研究所采集的樣品數(shù)量有限,只對(duì)云南省內(nèi)的滇黃精進(jìn)行了取樣,樣品含量不夠充足;另外,該研究?jī)H限于常用的幾個(gè)DNA片段的分析,未能綜合顯微結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等方面進(jìn)行研究,得出的結(jié)論較為局限。但初步的結(jié)果表明,利用分子生物學(xué)方法對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定的確是一種較簡(jiǎn)便、可靠的方法,在中藥鑒定、中藥材質(zhì)量控制上有一定的幫助。

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