云南省不同地區(qū)滇黃精的分子生物學(xué)鑒定

寧晨晨，劉強(qiáng)麗，丁子航，夏婷婷，施建蓮，韋 瑾

（1.云南新興職業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南 昆明 650106；3.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733006）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hem sl.）隸屬于百合科黃精屬，主要分布于云南、四川、貴州等地[1]，其干燥根莖是中藥黃精的重要來源之一。大量的研究資料表明，滇黃精根莖較為粗大，有效成分含量高，是黃精藥材中質(zhì)量較好的品種之一[2]。根據(jù)其形態(tài)不同，又有“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”等不同習(xí)稱[3]。云南是滇黃精的主產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)鼐用駥ⅫS精入藥的歷史悠久?！兜崮媳静荨贰对颇现参镏尽返戎芯悬S精藥用的記載，因此黃精是一種重要的“云藥”品種[4]。

現(xiàn)代化學(xué)及藥理作用研究表明，黃精中含有多糖、甾體皂苷、三萜皂苷、黃酮類等多種重要成分，有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎之功效，還有降血糖血脂、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老以及提高記憶能力的作用，在高血壓、高血脂、糖尿病等疾病的治療中廣泛應(yīng)用[5-8]。此外，黃精富含淀粉、多糖及其他營(yíng)養(yǎng)成分，保健功能突出，且味甜爽口，是優(yōu)良的藥食同源植物，在保健食品開發(fā)領(lǐng)域顯示出了較高的價(jià)值[9-10]。滇黃精作為藥用黃精的主要品種，產(chǎn)量及市場(chǎng)份額大，在當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中占據(jù)重要地位。

滇黃精長(zhǎng)期以野生資源供應(yīng)市場(chǎng)，隨著人們對(duì)滇黃精需求量的日益增加，野生藥材被過度采挖，導(dǎo)致野生黃精類群大量減少，已遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要，常常出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面[11]。董治程[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，滇黃精主要分布在貴州、云南師宗和楚雄以及大理地區(qū)，野外已很難發(fā)現(xiàn)其蹤跡。目前，人工栽培的滇黃精漸漸進(jìn)入市場(chǎng)，在云南大理、紅河、普洱、臨滄等地種植面積已具備一定規(guī)模[13]。然而，人工種植的品種來源不一，加上本種形態(tài)變異相當(dāng)大[2]，易與其他種混淆，因此種植品種混亂的情況常有發(fā)生，導(dǎo)致藥材質(zhì)量無法精準(zhǔn)控制，而傳統(tǒng)的鑒別方式有時(shí)難以區(qū)分，極易誤用，嚴(yán)重影響用藥效果和用藥安全[14]。

DNA 分子鑒定具有分子信息量大，且不受外界因素和生物體發(fā)育階段及器官組織差異的影響，準(zhǔn)確性高、客觀性強(qiáng)，可快捷、準(zhǔn)確地進(jìn)行植物分類、系統(tǒng)發(fā)育和鑒定分析。中藥材DNA 條形碼已被納入《中國(guó)藥典》（2020），為中藥材建立了“基因身份證”，可從基因?qū)用娼鉀Q中草藥與混偽品的物種識(shí)別問題。Chen 等[15]建議將ITS2 作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA 條形碼，同時(shí)建議將ITS2 作為新的通用條形碼用于鑒定更廣泛的植物類群。楊培等[16]在黃精屬藥用植物的DNA 條形碼鑒定研究中認(rèn)為，葉綠體全序列或通過葉綠體全序列篩選合適的DNA 片段可能是該屬藥用植物分子鑒定的方向。叢悅等[17]采用葉綠體基因（cpDNA）非編碼區(qū)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbAtrnH序列探索3 種黃精的基源分子鑒定方法，認(rèn)為葉綠體rpl20-rps12 片段序列更適合黃精的基源鑒定。該研究在借鑒前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用核糖體RNA（rRNA）基因轉(zhuǎn)錄區(qū)ITS2序列及cpDNA 非編碼區(qū)rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH序列對(duì)不同來源的滇黃精進(jìn)行分子鑒定，以初步了解實(shí)際流通中黃精藥材的基源，探究在滇黃精藥材資源利用過程中是否存在品種混淆的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該研究從云南省多個(gè)地區(qū)的黃精種植戶手中共收集22 份滇黃精樣品，大多為根狀莖，少數(shù)帶有莖和葉片，極個(gè)別為植物全株，全株樣品進(jìn)行了一段時(shí)間的培養(yǎng)，各樣品信息見表1。

表1 22 份滇黃精樣品的基本信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取 將樣品清洗干凈并干燥，根狀莖樣品取30～50 mg，葉類樣品取約20 mg，置于DNA 提取研磨機(jī)內(nèi)將樣品打碎至粉末。隨后利用植物組織基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行總DNA 提取。用滅菌雙蒸水溶解提取的DNA，保存于－20℃冰箱待用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 PCR 擴(kuò)增體系：在無菌PCR 管中分別加入10×擴(kuò)增緩沖液（含MgCl2）2.5 μL、前后引物各1 μL、原濃度dNTP 1 μL、DNA 模板1 μL、TaqDNA 聚合酶0.2 μL（5 U/μL），再加入滅菌的雙蒸水調(diào)節(jié)體積至25 μL。試驗(yàn)所用的PCR擴(kuò)增引物見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件參考他人文獻(xiàn)[15,17]進(jìn)行設(shè)置。擴(kuò)增產(chǎn)物用加有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外儀下檢測(cè)顯示單一明亮條帶。PCR 產(chǎn)物純化后送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致，如果1/3 序列為重峰時(shí)，需再用正向引物測(cè)序。

表2 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2.3 序列處理與數(shù)據(jù)分析 將測(cè)序色譜峰圖用Bioedit 打開，檢查測(cè)序質(zhì)量，確保堿基準(zhǔn)確性。經(jīng)Bioedit 檢查后的序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì)，確認(rèn)其近緣種類，GenBank 中獲取的序列信息詳見表3。自測(cè)序列片段和GenBank 下載的序列全部轉(zhuǎn)換為 FASTA 格式，采用muscle 對(duì)序列進(jìn)行自動(dòng)比對(duì)，用Bioedit 進(jìn)行人工校對(duì)和編輯，采用MEGA7.0.26構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹。

表3 GenBank 中獲取的序列及其信息

2 結(jié)果與分析

通過DNA 提取及擴(kuò)增，除去少數(shù)樣品DNA 片段測(cè)序失敗或峰形重疊無法使用，共成功獲取rpl20-rps12 片段（700～900 bp）序列7 條，trnL-trnF片段（300～400 bp）序列13 條，psbA-trnH片段（400～600 bp）序列21 條，ITS2 片段（300～400 bp）序列22 條，測(cè)序結(jié)果及序列片段長(zhǎng)度見表4。

表4 22 份滇黃精樣品的測(cè)序結(jié)果

由于rpl20-rps12 片段、trnL-trnF片段擴(kuò)增成功率較低，且從GenBank 上能獲取的參考序列不足，因此未對(duì)上述2 個(gè)DNA 片段進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)發(fā)育分析。將各樣品的psbA-trnH片段序列、ITS2 片段序列和GenBank 下載的相關(guān)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，分別得到psbA-trnH、ITS2 這2 個(gè)序列的NJ 樹（圖1 和圖2）。

圖1 基于葉綠體psbA-trnH 序列的NJ 樹

圖2 基于ITS2 序列的NJ 樹

由圖1 和圖2 可知，2 個(gè)基因片段均可在一定程度上將不同種的黃精屬植株區(qū)分開來，具有一定的物種鑒別能力，但總體來說，分辨能力并不強(qiáng)，分支支持率不高，尤其是ITS2序列較psbAtrnH序列鑒別能力更弱，不能明顯地從ITS2序列的NJ 樹上看出同一物種的分布趨勢(shì)。而psbA-trnH序列基本能將大多數(shù)物種區(qū)分開來，除多花黃精（P.cyrtonema）、卷葉黃精（P.cirrhifolium）分散在多個(gè)分支中，其余物種聚類較明顯，參考序列與樣品序列在NJ 樹中的分布有一定的規(guī)律性，可初步作為物種鑒定的依據(jù)。

由 圖1 可 以 看 出， 樣 品LQL01、LQL9、LQL10、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 顯 示 與多花黃精聚在一起形成多個(gè)分支，而在ITS2 序列的NJ 樹中，LQL01 更傾向于與滇黃精聚在一起，LQL09、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 與 多 花黃精聚在一起，而LQL10 與玉竹（P.odoratum）聚為一支，LQL21 則不能明確鑒定。結(jié)合樣品植物形態(tài)的觀察，LQL09、LQL16、LQL19、LQL20 和LQL21 同多花黃精相似，均為連珠狀或結(jié)節(jié)成塊根莖，葉互生，橢圓形、卵狀披針形至矩圓狀披針形，由此可初步將上述5 個(gè)樣品鑒定為多花黃精，而LQL10 與玉竹形態(tài)特征相似，因此初步鑒定為玉竹。

樣 品LQL03、LQL13、LQL22 在psbA-trnH序列NJ 樹中較好地與輪葉黃精（P.verticillatum）聚為一支，而在ITS2 序列的NJ 樹中，LQL13、LQL22與輪葉黃精聚在一起，但LQL03 獨(dú)自為一支。根據(jù)形態(tài)特征，LQL03、LQL13、LQL22 這3 個(gè)樣品形態(tài)與輪葉黃精比較一致，根狀莖一頭粗，一頭較細(xì)，粗的一頭有短分枝，葉多為3 葉輪生，條狀披針形，植株較高，因此可鑒定為輪葉黃精。

樣 品LQL12、LQL17 在psbA-trnH序 列NJ 樹中與卷葉黃精（P.cirrhifolium）聚為一支，而在ITS2 序列NJ 樹中這2 個(gè)樣品同樣與卷葉黃精聚在一起但形成2 個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)特征，初步鑒定這2 個(gè)樣品為卷葉黃精，形態(tài)上均呈現(xiàn)出根狀莖連珠狀，葉4～6 枚輪生，細(xì)條形至條狀披針形，先端拳卷或彎曲成鉤狀，花序輪生。

樣品LQL04、LQL05、LQL06、LQL07 在2 種NJ 樹中均聚在一起，在psbA-trnH序列NJ 樹中位置與滇黃精靠近。結(jié)合樣品本身形態(tài)，根狀莖近圓柱形或近連珠狀，多枚葉片輪生，條形、條狀披針形或披針形，先端拳卷。綜合考慮將上述4 個(gè)樣品鑒定為滇黃精。

此外，樣品LQL02、LQL08、LQL11、LQL14、LQL15 在2 個(gè)NJ 樹中位置比較模糊，但總體來說比較接近滇黃精的位置，且形態(tài)特征上支持其為滇黃精或卷葉黃精。另外，LQL01 雖然在psbA-trnH序列NJ 樹中與多花黃精聚在一起，但形態(tài)上更接近于滇黃精，需要結(jié)合更多證據(jù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，得到初步鑒定結(jié)果如表5 所示，在收集的22 份樣品中，初步判定可能為滇黃精的有11份，可能為卷葉黃精的有7 份，其中暫無法確定為滇黃精或者卷葉黃精的有5 份，鑒定為輪葉黃精的有3 份，玉竹1 份，多花黃精5 份。

表5 DNA 分子初步鑒定結(jié)果

3 討 論

該研究對(duì)收集自云南省不同地區(qū)的22 份滇黃精樣品進(jìn)行了DNA 序列的分析，從分子水平探究了實(shí)際流通中黃精藥材的基源。結(jié)果表明，收集的22 份樣品都屬于黃精屬植物，其中大部分基源是準(zhǔn)確的，有11 份初步判斷或者推測(cè)可能是真正的滇黃精，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有一部分可能是與其形態(tài)較為相似的如多花黃精、輪葉黃精、卷葉黃精或玉竹等種類。由此可見，云南省目前各地種植的滇黃精存在一定量的混淆品，這些混淆品也可以作為黃精藥用，但藥效、成分都與滇黃精有所區(qū)別，如果混用將影響用藥的安全性和有效性。這些混淆品藥用部位形態(tài)與滇黃精基本相似，均為不規(guī)則塊狀或連珠狀，但通過進(jìn)一步觀察植株形態(tài)可發(fā)現(xiàn)，它們的地上部分還是有所差別的。例如多花黃精，其根莖雖與黃精形似，但植物葉片生長(zhǎng)方式為對(duì)生，而滇黃精的葉片為輪生，其次植株高度、花的形態(tài)、葉片形態(tài)也均有差別。因此，如果僅以根莖部位作為辨認(rèn)藥材的依據(jù)，很容易與其相似植物混淆。其次，有些混淆品與滇黃精在植株整體形態(tài)上確實(shí)很難區(qū)分，如卷葉黃精，無論葉的形態(tài)還是根莖均與滇黃精極為相似，從形態(tài)上很難辨別，這無疑增加了準(zhǔn)確使用黃精藥材的難度。另外，根據(jù)筆者的調(diào)研采訪，發(fā)現(xiàn)大多種植戶對(duì)于自家種植的滇黃精的基源并不十分清楚，這是導(dǎo)致滇黃精種植基源模糊的重要原因。

《中國(guó)藥典》中標(biāo)明，藥材黃精來自于黃精屬植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，按形狀不同，習(xí)稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”。但這些習(xí)稱分別代表何種黃精物種并沒有明確區(qū)分，可見黃精藥材包括滇黃精等植物，由于形態(tài)多變，依據(jù)傳統(tǒng)的方法無法準(zhǔn)確鑒定。因此，有必要找尋更方便有效的基源鑒別方式，如DNA 分子鑒定。目前，基于ITS 序列的植物類藥材DNA 條形碼鑒定體系已經(jīng)初步建立，但該研究顯示，以ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)于鑒定黃精屬植物依然存在困難，ITS2 序列無法高效地將不同種的黃精屬植物辨別開來，而葉綠體基因psbA-trnH序列分辨效果相對(duì)較好，可初步將其作為黃精屬藥材分子鑒定的片段使用。然而，對(duì)于根莖類藥材，市場(chǎng)上多見為干燥藥材或者中藥飲片及粉末，DNA 破壞嚴(yán)重，提取困難，加上葉綠體基因片段提取技術(shù)要求高，難以廣泛推廣使用。該研究嘗試用不同的引物序列（rpl20-rps12、trnLtrnF、psbA-trnH、ITS2）來擴(kuò)增黃精的DNA，從而獲取不同的片段進(jìn)行聚類分析，初步探索了分子鑒定在滇黃精基源鑒別上的應(yīng)用效果。筆者認(rèn)為DNA分子鑒定在一定程度上確實(shí)可以作為黃精類藥材基源鑒定的依據(jù)，但該技術(shù)仍需進(jìn)一步完善和驗(yàn)證。

因時(shí)間和條件限制，該研究所采集的樣品數(shù)量有限，只對(duì)云南省內(nèi)的滇黃精進(jìn)行了取樣，樣品含量不夠充足；另外，該研究?jī)H限于常用的幾個(gè)DNA片段的分析，未能綜合顯微結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分等方面進(jìn)行研究，得出的結(jié)論較為局限。但初步的結(jié)果表明，利用分子生物學(xué)方法對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定的確是一種較簡(jiǎn)便、可靠的方法，在中藥鑒定、中藥材質(zhì)量控制上有一定的幫助。