選擇性磁珠純化法結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用

吳 鑫，音海玲，殷 倩，盧守蓮，王俊宏，王 玨*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，2心內(nèi)科，江蘇 南京 210029

常見(jiàn)染色體數(shù)目異常包括21、18、13 號(hào)常染色體及性染色體的數(shù)目異常，是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因之一。對(duì)于染色體異?；純?，目前缺乏有效治療手段，而通過(guò)產(chǎn)前篩查可以顯著降低該類(lèi)出生缺陷的發(fā)生率。由于高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，以其為基礎(chǔ)的胎兒染色體非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal testing，NIPT）開(kāi)始在臨床發(fā)揮重要作用。NIPT 通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血漿中的游離DNA（cell free DNA，cfDNA）濃度，進(jìn)而評(píng)估胎兒21、18、13 號(hào)染色體非整倍體異常的風(fēng)險(xiǎn)［1］。國(guó)內(nèi)外研究表明，NIPT 的臨床應(yīng)用，大大減少了因血清學(xué)產(chǎn)前篩查假陽(yáng)性導(dǎo)致的侵入性產(chǎn)前診斷。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠早期和晚期，平均胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）占孕婦血漿總cfDNA的3.4%和6.2%［2］，而且其濃度變化呈現(xiàn)胎齡依賴性，NIPT檢測(cè)處于早中孕期，cffDNA的濃度水平較低，因此，如何在樣本制備過(guò)程中富集cffDNA，并進(jìn)一步提高NIPT的檢測(cè)效率，是臨床需要解決的問(wèn)題。

DNA 片段選擇性磁珠純化法（簡(jiǎn)稱(chēng)：片段選擇富集法）富集cffDNA，是基于孕婦血漿中不同類(lèi)型DNA 片段的分子特征，血漿DNA 分子主要是短的cfDNA。有研究提示，孕婦血漿中cfDNA長(zhǎng)度范圍約在105～798 bp，其中片段＞201 bp 的約占57%左右；而cffDNA 長(zhǎng)度范圍約在107～313 bp，其中＞193 bp的占比僅約20%［3］。基于孕婦血漿中母源DNA 比cffDNA 片段長(zhǎng)的特點(diǎn)，在樣本制備步驟中，調(diào)整不同羧基化超順磁珠的配比與樣本體積，可選擇性吸附不同長(zhǎng)度的核酸片段，從而達(dá)到富集cffDNA的目的［4-7］。

本研究對(duì)NIPT待測(cè)樣本采用了兩種DNA純化方法，傳統(tǒng)DNA 提取純化法（簡(jiǎn)稱(chēng)：傳統(tǒng)純化法）與片段選擇富集法，現(xiàn)將兩種方法的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控指標(biāo)、疾病檢出和臨床隨訪情況進(jìn)行比較分析，為該技術(shù)在NIPT中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

回顧性分析2019 年8 月—2021 年8 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行NIPT 檢測(cè)的孕婦共20 868 例，其中2019年8月—2020年4月共5 914例采 用傳統(tǒng)純化法，2020 年5 月—2021 年8 月共14 954 例采用片段選擇富集法。對(duì)其中NIPT 檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)者進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷排除胎兒染色體異常，產(chǎn)前診斷孕周為13～23周；所有孕婦均隨訪分娩結(jié)局。樣本排除標(biāo)準(zhǔn)：孕周＜12周，夫婦一方有明確染色體異常，接受過(guò)移植手術(shù)、干細(xì)胞治療，1 年內(nèi)接受過(guò)異體輸血、異體細(xì)胞免疫治療等，胎兒超聲檢查提示有結(jié)構(gòu)異常者，有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風(fēng)險(xiǎn)者，孕期合并惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦均進(jìn)行檢測(cè)前咨詢、檢測(cè)原理告知并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及血漿分離

采集孕婦靜脈血5mL于DNA采血管中。1600 r/min離心10 min，吸取上層血漿，16 000 r/min離心10 min，再次吸取血漿。

1.2.2 血漿cfDNA提取及文庫(kù)構(gòu)建

1.2.2.1 傳統(tǒng)純化法

按照北京安諾優(yōu)達(dá)公司試劑說(shuō)明書(shū)提取血漿游離核酸。簡(jiǎn)要步驟如下：配制提取液，血漿中加入含分離磁珠的提取液，37 益孵育后置于磁力架靜置5 min，混勻后棄上清，清洗；加入緩沖液，混勻靜置后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；將從母體血漿中提取的cfDNA片段末端修復(fù)平整；在3′端加堿基A，堿基的特殊接頭連接；通過(guò)PCR 擴(kuò)增技術(shù)，引入帶有特定序列標(biāo)簽的DNA片段，并對(duì)各階段產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.2.2 DNA片段選擇性磁珠純化法

片段選擇富集法按安諾優(yōu)達(dá)公司試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體步驟如下：采集靜脈血，按傳統(tǒng)純化法提取母體血漿中的cfDNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，修復(fù)DNA，在待分選體系中，按樣品∶分選磁珠=1∶1.5 比例，加入羧基化納米磁珠選擇吸附大片段DNA，室溫混勻，靜置10 min；磁力架吸附磁珠，留取上清；按樣品∶分選磁珠=3∶1 比例，在上清中加入分選磁珠以選擇吸附小片段DNA，對(duì)小片段cfDNA 進(jìn)行富集，室溫靜置，磁力架吸附磁珠，棄上清；清洗后緩沖液洗脫，洗去分選磁珠，完成后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建，采用Qubit熒光計(jì)測(cè)量提取DNA產(chǎn)物的濃度。

1.2.3 上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)生信分析

采用NextSeq 500AR 高通量測(cè)序儀測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)直接傳遞到生信分析工作站；每一個(gè)測(cè)序Reads，比對(duì)到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的hg19 參考基因組序列，計(jì)算Z值。

結(jié)果判斷：以Z值區(qū)間在-3.0～3.0，作為13號(hào)染色體、18 號(hào)染色體、21 號(hào)染色體三體型的正常參考值?！?.0或≤-3.0為可疑陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用U檢驗(yàn)分析；為排除在效應(yīng)量微弱情況下，因超大樣本量而造成的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況，研究中引入效應(yīng)量（effect size，以cohen’s d表示）來(lái)反映組間是否真實(shí)存在差異性（cohen’s d ＜0.4 提示弱效應(yīng)，組間不存在差異性；cohen’s d 0.4～0.8 為中等效應(yīng)，臨界區(qū)間；cohen’s d ＞0.8 為強(qiáng)效應(yīng)，組間存在顯著性差異）。

不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，分類(lèi)變量以數(shù)值和百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。將NIPT 結(jié)果與胎兒染色體分析結(jié)果及妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（positive predict value，PPV），PPV=真陽(yáng)性病例數(shù)/（真陽(yáng)性病例+假陽(yáng)性病例），以PPV評(píng)估NIPT對(duì)胎兒染色體檢查的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 孕婦基本資料情況

共計(jì)20 868 例孕婦納入研究，其中傳統(tǒng)純化法組孕婦年齡為（30.40±4.42）歲，片段選擇富集法組孕婦年齡為（30.11±4.20）歲（P＜0.001，cohen’s d=0.07），兩組孕婦年齡無(wú)顯著差異。傳統(tǒng)純化法組孕婦抽血行NIPT 檢測(cè)的孕周為（16.59±2.28）周，而片段選擇富集法組的孕周為（16.30±1.91）周（P＜0.001，cohen’s d=0.14），兩組間孕周無(wú)顯著差異（表1）。

表1 孕婦基線資料、臨床情況及外周血循環(huán)DNA測(cè)序質(zhì)控及濃度比較

2.2 兩種方法cffDNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量比較

傳統(tǒng)純化法組中共有33 例（0.56%，33/5 914）因提取的cffDNA 濃度過(guò)低而需再次抽血檢測(cè)，而片段選擇富集法組中只有2 例因cffDNA 過(guò)低（0.01%，2/14 954）需再次抽血檢測(cè)，兩組間存在顯著差異（P＜0.001）。

對(duì)測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行比較，兩組間cffDNA 的GC 比率無(wú)顯著差異，分別為（40.19±4.25）%和（39.87±2.71）%（P＜0.001，cohen’s d=0.11）。兩組Q30 分別為（97.05±0.49）%和（96.98±0.42）%（P＜0.001，cohen’s d=0.15），兩組間無(wú)顯著差異（表1）。

兩組提取的cffDNA 濃度分別為（341.59±93.92）nmol/L 和（252.52±120.76）nmol/L（P＜0.001，cohen’s d=0.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 兩種方法NIPT篩查準(zhǔn)確性比較

共計(jì)20 868例孕婦行NIPT篩查，其中采用傳統(tǒng)純化法行NIPT檢測(cè)的共5 914例，共檢測(cè)出23例染色體異常，陽(yáng)性率為0.39%（23/5 914），而采用片段選擇富集法行NIPT篩查的孕婦共計(jì)14 954例，檢出47例染色體異常，陽(yáng)性率為0.31%（47/14 954），兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.401）。

對(duì)篩查高風(fēng)險(xiǎn)病例的產(chǎn)前診斷結(jié)果和分娩結(jié)局進(jìn)行隨訪，結(jié)果提示，傳統(tǒng)純化法組NIPT 檢出23 例高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，21、18和13三體陽(yáng)性例數(shù)分別為13、6 和4 例，經(jīng)隨訪確診為21 三體、18 三體和13三體者分別為6、5和2例，其中21三體陽(yáng)性孕婦中有2例拒絕隨訪。片段選擇富集法組中21三體、18三體和13三體高風(fēng)險(xiǎn)分別為38、5和4例，經(jīng)隨訪確診為21三體、18三體和13三體者分別為24、3和1例，其中21 三體陽(yáng)性孕婦中有2 例拒絕電話隨訪。同時(shí)，隨訪結(jié)果提示，兩組各有1 例假陰性，兩組間目標(biāo)染色體異常漏檢率無(wú)顯著差異（0.02%vs.0.01%，P=0.486）。

兩種方法的目標(biāo)疾病陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為：21三體（54.55%vs.66.7%）、18 三體（83.33%vs.60.00%）和13 三體（50.00%vs.25.00%），均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05，表2）。

表2 兩種方法檢測(cè)胎兒染色體非整倍體異常類(lèi)型及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較

3 討論

隨著基礎(chǔ)科學(xué)發(fā)現(xiàn)和技術(shù)發(fā)展的相互促進(jìn)，自1997 年在母血中發(fā)現(xiàn)cffDNA，到2011 年NIPT 篩查胎兒21三體技術(shù)推出至今，其高準(zhǔn)確性得到大量臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，推動(dòng)了NIPT在胎兒染色體非整倍體疾病篩查方面的大規(guī)模臨床應(yīng)用，大大減少了因血清學(xué)產(chǎn)前篩查假陽(yáng)性導(dǎo)致的介入性產(chǎn)前診斷數(shù)量。

NIPT 技術(shù)通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血中胎兒游離的DNA來(lái)發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶21、18、13 號(hào)染色體非整倍體異常的風(fēng)險(xiǎn)。它的臨床應(yīng)用大大降低了侵入性產(chǎn)前診斷率。但由于本身cffDNA 釋放至母體外周血液循環(huán)中含量較少，NIPT 檢測(cè)時(shí)孕周范圍多為孕12～20 周，因此由于母體血漿中cffDNA 濃度達(dá)不到NIPT 檢測(cè)質(zhì)控要求而重復(fù)采血的情況并不少見(jiàn)。有研究報(bào)道，不同檢測(cè)平臺(tái)NIPT 初次檢測(cè)失敗率為1%～8%［8］，目前對(duì)于初次NIPT 失敗病例則通常建議再次抽血，而再次抽血檢測(cè)的成功率仍僅約為50%～60%［9］。所以如何高效富集母體外周血液中cffDNA 以最大程度降低NIPT 檢測(cè)過(guò)程中的假陰性率和假陽(yáng)性率，減輕孕婦家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

對(duì)孕婦血漿中不同類(lèi)型DNA 片段的分子特征研究提示，孕婦血漿中母源DNA 比cffDNA 片段長(zhǎng)；孕婦血漿中游離DNA長(zhǎng)度范圍約在105～798 bp，而cffDNA 長(zhǎng)度范圍約在107～313 bp，其中＜193 bp 的約占80%［3］。對(duì)短片段的游離DNA 進(jìn)行區(qū)分并純化是富集提取cffDNA的方法之一。

磁珠法為常用的核酸純化方法，磁珠法進(jìn)行核酸純化主要分為兩類(lèi)，其一為無(wú)差別的吸附和回收，主要用于核酸的純化和濃縮，其二為通過(guò)特殊手段修飾磁珠以特異性吸附目的核酸。研究發(fā)現(xiàn)，將納米磁珠進(jìn)行羧基化修飾后，控制納米磁珠與樣本DNA 的配比在特定范圍區(qū)間時(shí)，可以分步驟，先特異性吸附長(zhǎng)片段的游離核酸，再特異性吸附短片段的游離核酸，從而到達(dá)分離、純化、富集cffDNA的目的［4，6］，有文獻(xiàn)報(bào)道，采用該方法富集小片段DNA可以將cffDNA濃度提高1倍以上［7］。

本研究從2020 年5 月開(kāi)始，采用羧基化修飾的具有DNA 片段選擇能力的納米分選磁珠富集cffDNA 用于NIPT 篩查。按照是否使用該技術(shù)將病例分為傳統(tǒng)純化法組和片段選擇富集法組，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，兩組提取的cffDNA 濃度分別為（341.59±93.92）nmol/L和（252.52±120.76）nmol/L（P＜0.001）。分析原因，可能與兩組DNA 片段長(zhǎng)度有關(guān)，片段選擇富集后血漿DNA 提取產(chǎn)物中以短片段DNA 為主，其絕對(duì)質(zhì)量相對(duì)較低，所以濃度也低。

通過(guò)比較還發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)純化法期間，因cffDNA 濃度過(guò)低導(dǎo)致的復(fù)檢抽血率為0.56%，與文獻(xiàn)報(bào)道的0.47%～0.50%接近［8，10］，采用新的片段選擇富集法以后，因cffDNA濃度過(guò)低導(dǎo)致的復(fù)檢抽血率降低到0.01%，與傳統(tǒng)純化法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。DNA 片段選擇性磁珠純化法，通過(guò)富集孕婦血漿樣本中的cffDNA，減少了孕婦再次抽血帶來(lái)的焦慮情緒，縮短了檢測(cè)周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT），提高了檢測(cè)效率，有助于臨床及時(shí)召回高風(fēng)險(xiǎn)病例。

對(duì)兩組樣本的高通量測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，游離DNA的GC比率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，測(cè)序質(zhì)量指標(biāo)Q30分別為傳統(tǒng)純化法組（97.05±0.49）%、片段選擇富集法組（96.98±0.42）%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在樣本制備環(huán)節(jié)，采用片段選擇富集法不會(huì)對(duì)高通量測(cè)序的質(zhì)量指標(biāo)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

根據(jù)胎兒產(chǎn)前診斷及分娩結(jié)局的隨訪，對(duì)NIPT篩查準(zhǔn)確性進(jìn)行比較，應(yīng)用片段選擇富集法前后，胎兒目標(biāo)染色體異常的陽(yáng)性檢出率并無(wú)顯著差異（0.36%vs.0.32%），21 三體、18 三體和13 三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均無(wú)顯著性差異。而兩組均發(fā)生1例染色體異常漏診（0.02%vs.0.01%，P=0.49）。由此提示，采用新的片段選擇富集法在富集cffDNA的同時(shí)，并不會(huì)導(dǎo)致富集DNA質(zhì)量的下降，也未影響染色體異常識(shí)別的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究表明采用羧基化修飾的具有DNA 片段選擇能力的納米分選磁珠富集cffDNA，可以對(duì)短片段cffDNA 進(jìn)行有效富集，且不影響后續(xù)高通量測(cè)序的穩(wěn)定性，從而可以減少因cffDNA濃度過(guò)低導(dǎo)致的重采血，提高檢測(cè)效率。該法在保證cffDNA產(chǎn)物提取質(zhì)量的同時(shí)，并不影響目標(biāo)染色體疾病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。