Notch1在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷中的作用及機(jī)制

邵宇云，王 涵，王 瀟，戴晶晶，李 軍，蔣龍鳳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，江蘇 南京 210029

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是臨床上最常見的肝臟疾病，由某種特定的藥物或/和其代謝產(chǎn)物直接或間接作用于肝臟導(dǎo)致，其臨床表現(xiàn)多樣［1］。一項(xiàng)來(lái)自308個(gè)醫(yī)學(xué)中心25 927例患者的回顧性研究顯示，DILI 發(fā)生率為0.023 8%［2］。對(duì)乙酰氨基酚（acetyl-para-aminophenol，APAP）是臨床上最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，過(guò)量的APAP 攝入是導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷最常見的病因［3］。然而APAP 導(dǎo)致DILI的發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

在APAP誘導(dǎo)的肝損傷（APAPinducedliver injury，AILI）中，肝臟固有免疫反應(yīng)激活和肝細(xì)胞死亡是其發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。既往研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）是核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB（p-65）信號(hào)通路激活過(guò)程中的關(guān)鍵激酶，在機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，如在巨噬細(xì)胞中，TAK1可調(diào)控gasdermin D（GSDMD）的水解，從而調(diào)控細(xì)胞死亡［4］。而在巨噬細(xì)胞中，caspase-8（Casp-8）已被證明是NLRP3 炎癥小體形成、耶爾森菌誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子表達(dá)及焦亡過(guò)程中必需的［5］。進(jìn)一步研究顯示，抑制Casp-8 的表達(dá)或敲除Casp-8 后，受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）-RIPK3-混合譜系激酶域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）途徑被激活，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）釋放，加劇細(xì)胞損傷，甚至死亡［6-8］；說(shuō)明Casp-8 可能是控制細(xì)胞死亡并防止組織損傷的關(guān)鍵。在AILI中，肝巨噬細(xì)胞（如Kupffer細(xì)胞）通過(guò)釋放大量的促炎因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而加重肝細(xì)胞死亡，參與肝損傷的進(jìn)展［1］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細(xì)胞Notch1 信號(hào)可以加重AILI［9］；但Notch1信號(hào)調(diào)控APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究構(gòu)建腹腔注射APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，探索髓系特異性Notch1 敲除（myeloid-specific Notch1 knockout，Notch1M-KO）誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，髓系特異性Notch1 敲除通過(guò)上調(diào)TAK1 的表達(dá)，從而抑制Casp-8，調(diào)控RIPK1-MLKL壞死性凋亡信號(hào)，加重肝組織損傷。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6J背景的髓系特異性Notch1敲除（Notch1M-KO）和對(duì)照f(shuō)loxed Notch1（Notch1FL/FL）小鼠，6～8 周齡，來(lái)自美國(guó)Jackson 實(shí)驗(yàn)室。ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司），APAP（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）。Notch1 抗體、TAK1 抗體、p65抗體、p-p65抗體、Casp-8抗體、RIPK1抗體、p-MLKL抗體（CST 公司，美國(guó)），p-TAK1 抗體（賽默飛公司，美國(guó)），熒光標(biāo)記二抗（Jackson Immunoresearch，美國(guó)），CD11b 抗體（Abcam 公司，美國(guó)），H2DCFDA 活性氧熒光探針（ThermoFisher 公司，美國(guó)）。熒光顯微鏡（Keyence 公司，日本），全自動(dòng)生化分析儀（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞分離

小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±1）°C，濕度（55±5）%，光照時(shí)間維持12 h 光照和12 h 黑暗周期，并給予充足的食物和無(wú)菌蒸餾水供其自由采食，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-2206039）。

采用“兩步灌注法”分離Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠的原代肝細(xì)胞及肝臟巨噬細(xì)胞［10］。每組取3 只小鼠，打開小鼠腹腔，暴露門靜脈，門靜脈穿刺成功后固定，10 mL/min 流量經(jīng)過(guò)門靜脈灌注含1%雙抗的EGTA 溶液（9.5 mg EGTA 粉末加至50 mL HBSS中，37 益預(yù)熱30 min），總量為40 mL，再用含1%雙抗的Ⅱ型膠原酶（0.01 g 膠原酶加至40 mL GBSS 溶液中，37 益預(yù)熱30 min）灌注肝臟，灌注完成后可見肝臟呈土黃色。灌注完畢后用組織剪將肝臟從腹腔分離后置入含有膠原酶維持液的培養(yǎng)皿中，用鑷子鈍性分離肝臟直至無(wú)明顯塊狀組織，制成細(xì)胞懸液。70目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后離心，GBSS重懸離心（50g，5 min）清洗2 次，Percoll 密度梯度離心純化，分別獲得原代肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞，0.4%臺(tái)酚藍(lán)測(cè)定細(xì)胞狀態(tài)并計(jì)數(shù)，DMEM+10%胎牛血清（FBS）+1%青鏈霉素培養(yǎng)，接種至6 孔板中，細(xì)胞數(shù)為1.0×106～1.5×106個(gè)/孔，培養(yǎng)箱（37 益、5%CO2）中培養(yǎng)3 h后，37 益預(yù)熱的PBS 清洗細(xì)胞3 次，去除非貼壁細(xì)胞。24 h換液，并收集上清液，-80 益儲(chǔ)存。按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL RIPA，混勻后冰浴靜置30 min 充分裂解細(xì)胞。BCA定量蛋白，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.2 小鼠AILI模型的制備及生存率分析

取Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠各6 只，腹腔注射APAP 以構(gòu)建AILI 模型，APAP 溶液在實(shí)驗(yàn)使用前1 h配制，將APAP溶解在PBS中，濃度為10 mg/mL，并在水浴箱中加熱到40 益。雄性小鼠禁食16 h，然后用400 mg/kg APAP 腹腔注射。在注射后的72 h內(nèi)每12 h觀察小鼠存活情況并記錄。

1.2.3 小鼠分組及處理

Notch1M-KO和Notch1FL/FL小鼠各12 只，分別隨機(jī)取6 只，通過(guò)腹腔注射APAP 構(gòu)建AILI 模型（Notch1FL/FL+APAP組、Notch1FL/FL+APAP組），具體方法同前。其余6只腹腔注射PBS作為對(duì)照（Notch1FL/FL+PBS 組、Notch1M-KO+PBS 組）。24 h 后通過(guò)乙醚吸入對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死，收集血液和肝臟組織。

1.2.4 肝功能及細(xì)胞因子檢測(cè)

小鼠的血液樣本室溫靜置30 min，3 000 r/min離心12 min，收集上清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）。TNF-α、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1 使用ELISA檢測(cè)。

1.2.5 肝臟組織切片染色

收集小鼠肝組織，部分肝組織石蠟包埋后切片（5 μm）行HE 染色觀察肝臟病理情況，Suzuki 評(píng)分評(píng)估肝組織損傷程度。部分肝組織OCT包埋后，冰凍切片（10 μm）行免疫熒光染色觀察肝組織CD11b和p-TAK1 的表達(dá)情況；冰凍切片室溫復(fù)溫30 min，4%福爾馬林固定10 min，0.1% Triton X-100 破膜（2.5%BSA），CD11b 抗體、p-TAK1 抗體（1∶100）4 益孵育過(guò)夜，熒光標(biāo)記二抗（1∶250）室溫避光孵育1 h，DAPI封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測(cè)

50 mg 肝組織加入RIPA 蛋白裂解液超聲碾磨后提取總蛋白，BCA 試劑盒定量，確保蛋白上樣量為30 μg/孔。經(jīng)過(guò)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，Notch1 抗體、TAK1 抗體、p-TAK1 抗體、p65 抗體、p-p65 抗體、Casp-8 抗體、RIPK1 抗體、p-MLKL 抗體（1∶1 000）4 益孵育過(guò)夜，根據(jù)一抗種屬進(jìn)行二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，曝光得到條帶后經(jīng)Image J 分析灰度值。

1.2.7 原代肝細(xì)胞ROS檢測(cè)

分離Notch1FL/FL+APAP 組、Notch1M-KO+APAP 組小鼠（每組4 只）原代肝細(xì)胞進(jìn)行ROS 檢測(cè)，DCF 探針（1∶500）加入不含血清培養(yǎng)基的原代肝細(xì)胞，37 益孵育20～30 min。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Kaplan-Meier 法進(jìn)行小鼠生存分析；計(jì)量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓系特異性Notch1敲除驗(yàn)證

分別分離Notch1FL/FL、Notch1M-KO小鼠的原代肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞，提取蛋白，Western blot 檢測(cè)Notch1的表達(dá)。結(jié)果顯示，Notch1M-KO小鼠肝巨噬細(xì)胞不表達(dá)Notch1，而Notch1FL/FL小鼠的原代肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞中Notch1正常表達(dá)（圖1A）。

圖1 Notch1M-KO加重APAP誘導(dǎo)的肝損傷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Figure 1 Myeloid-specific Notch1 knockout exacerbates APAP-induced liver injury and immune cell accumulation

2.2 Notch1M-KO加重APAP誘導(dǎo)的肝損傷

APAP 腹腔注射構(gòu)建小鼠AILI 模型，觀察小鼠死亡率。結(jié)果顯示，與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠死亡率有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。

HE染色結(jié)果顯示，PBS處理的小鼠肝臟病理未見明顯異常。小鼠腹腔注射APAP 后，肝臟病理提示肝細(xì)胞體積增大，竇道淤血，并出現(xiàn)廣泛的壞死。與Notch1FL/FL+APAP 組相比，經(jīng)APAP 腹腔注射的Notch1M-KO小鼠肝竇淤血，肝細(xì)胞體積增大及空泡樣變性，細(xì)胞邊界形態(tài)模糊等更為嚴(yán)重，出現(xiàn)廣泛細(xì)胞的壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；兩組Suzuki 評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1C）。血清轉(zhuǎn)氨酶是評(píng)價(jià)肝功能損傷的一個(gè)重要標(biāo)志，PBS 處理的小鼠血清ALT及AST水平正常，而APAP處理組表達(dá)明顯升高。與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠血清ALT 和AST 水平升高更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1D）。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色觀察肝臟切片中CD11b 的表達(dá)情況，APAP處理后，肝組織切片中CD11b 表達(dá)明顯升高，說(shuō)明肝損傷后肝內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多；而與Notch1FL/FL+APAP 組相比，Notch1M-KO+APAP 組肝臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001，圖1E）。

2.3 Notch1M-KO通過(guò)激活TAK1 信號(hào)抑制細(xì)胞壞死性凋亡

Notch1 敲除后，APAP 處理組小鼠肝組織中p-TAK1 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001），同時(shí)伴有p-p65 表達(dá)上調(diào)（圖2A），但Casp-8 表達(dá)受到抑制，RIPK1 和p-MLKL 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.001，圖2A）。而PBS 處理的Notch1FL/F和Notch1M-KO小鼠肝組織中p-TAK1、p-p65、Casp-8、RIPK1 和p-MLKL 蛋白的表達(dá)未見明顯差異。說(shuō)明APAP可激活壞死性凋亡通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死增加，符合組織學(xué)結(jié)果。進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)p-TAK1 在肝組織中表達(dá)情況，經(jīng)APAP 腹腔注射的Notch1M-KO小鼠肝組織中p-TAK1陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多（P＜0.001，圖2B）。結(jié)合Western blot和免疫熒光染色結(jié)果，說(shuō)明Notch1敲除后，激活p-TAK1 的表達(dá)促進(jìn)肝臟細(xì)胞凋亡壞死，加重APAP誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生。

圖2 Notch1M-KO通過(guò)激活TAK1信號(hào)抑制細(xì)胞壞死性凋亡Figure 2 Myeloid-specific Notch1 knockout inhibits necroptosis through activation of TAK1 signaling

2.4 Notch1M-KO 加重全身炎癥反應(yīng)及原代肝細(xì)胞ROS產(chǎn)生

與Notch1FL/FL+APAP組小鼠相比，Notch1M-KO+APAP組小鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A～D）。進(jìn)一步通過(guò)DCF探針檢測(cè)原代肝細(xì)胞ROS情況，結(jié)果顯示Notch1M-KO小鼠肝細(xì)胞的ROS水平明顯升高（P＜0.01，圖3E）。

圖3 Notch1M-KO加重全身炎癥反應(yīng)及原代肝細(xì)胞ROS產(chǎn)生Figure 3 Myeloid-specific Notch1 knockout exacerbates systemic inflammatory response and ROS generation in primary hepatocytes

3 討論

AILI可能不是DILI首位病因，卻是導(dǎo)致急性肝損傷的主要病因之一［3］。在美國(guó)，46%的急性肝損傷是服用過(guò)量APAP導(dǎo)致的［11］。急性肝損傷隨后引起各種并發(fā)癥甚至是多器官衰竭，進(jìn)一步危及患者生命，最終需要行肝移植手術(shù)，而肝源缺乏導(dǎo)致只有少數(shù)患者才能得到救治。因此，進(jìn)一步研究AILI發(fā)病機(jī)制，為臨床提供潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)防策略顯得非常重要。

本研究通過(guò)對(duì)Notch1 特異性敲除小鼠腹腔注射APAP 構(gòu)建AILI 動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)，與PBS 處理組相比，APAP 處理組小鼠肝臟病理提示肝細(xì)胞水腫及肝細(xì)胞壞死，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明AILI造模成功。與Notch1FL/FL+APAP組相比，Notch1M-KO+APAP 組小鼠肝組織損傷更嚴(yán)重，使用Suzuki 量化肝組織損傷程度，Suzuki評(píng)分明顯高于對(duì)照組，且血清ALT、AST表達(dá)明顯升高，說(shuō)明髓系特異性Notch1敲除后加重了APAP誘導(dǎo)的肝損傷。

肝臟巨噬細(xì)胞在肝臟遭遇損傷應(yīng)激后扮演重要角色，研究顯示，在AILI中，有51.5%的Kupffer細(xì)胞被激活［12］。本研究采用免疫熒光染色觀察CD11b的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，經(jīng)APAP 處理后，Notch1M-KO組CD11b+細(xì)胞比例明顯升高，說(shuō)明肝內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加。浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞隨后釋放各種細(xì)胞因子，如TNF-α等，與靶細(xì)胞膜表面的TNF受體相結(jié)合，激活RIPK1-MLKL 信號(hào)通路放大炎癥信號(hào)［13］，甚至啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡［14］。程序性死亡是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激損傷的一個(gè)重要方式。既往研究表明可通過(guò)NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)調(diào)控炎癥反應(yīng)［15］。APAP誘導(dǎo)肝損傷后，壞死的肝細(xì)胞釋放損傷相關(guān)的分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）招募炎性細(xì)胞。浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞隨后釋放多種促炎因子，導(dǎo)致“炎性因子風(fēng)暴”或炎癥因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），進(jìn)一步危及機(jī)體的生命［16］。本研究結(jié)果顯示，APAP 處理后小鼠RIPK1、p-MLKL表達(dá)增加，且Notch1M-KO組表達(dá)增加更明顯，說(shuō)明巨噬細(xì)胞Notch1 缺乏導(dǎo)致炎性因子釋放增加，從而促進(jìn)肝細(xì)胞壞死性凋亡通路激活，進(jìn)一步加重肝損傷的發(fā)生。

既往研究發(fā)現(xiàn)，TAK1 是NF-κB 和c-Jun N 端激酶的上游細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，它被眾多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和微生物產(chǎn)物激活［17］。而TAK1和RIPK1的相互作用在多種模型中被證實(shí)［18-20］。本研究通過(guò)Western blot 和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)在Notch1M-KO組AILI 模型中p-TAK1 表達(dá)明顯升高，說(shuō)明Notch1 缺乏可促進(jìn)肝臟TAK1 的磷酸化。進(jìn)一步研究顯示，p-p65的表達(dá)上調(diào)，而Casp-8的表達(dá)下調(diào)，最終激活RIPK1-MLKL 信號(hào)通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死性凋亡增加。ROS 是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的一個(gè)重要標(biāo)志，過(guò)量的APAP 在體內(nèi)耗盡谷胱甘肽后形成APAP 蛋白結(jié)合物，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，ROS 釋放，從而進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激，最終使細(xì)胞裂解死亡［1］。通過(guò)DCF 探針檢測(cè)肝細(xì)胞中ROS，進(jìn)一步證實(shí)Notch1M-KO組ROS水平明顯升高。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建小鼠AILI 模型，并通過(guò)髓系特異性敲除進(jìn)一步探討固有免疫Notch1信號(hào)缺陷對(duì)AILI 肝細(xì)胞死亡機(jī)制的作用。結(jié)果顯示，髓系特異性Notch1 敲除加重肝細(xì)胞損傷，其可能機(jī)制是通過(guò)上調(diào)肝內(nèi)TAK1 信號(hào)，抑制Casp-8 的表達(dá)，從而激活RIPK1-MLKL 信號(hào)通路啟動(dòng)肝細(xì)胞壞死性凋亡，最終導(dǎo)致?lián)p傷加重。本研究有可能為DILI 提供潛在的治療靶點(diǎn)，但也存在一定的缺陷。如沒有通過(guò)Notch1 過(guò)表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證下游信號(hào)通路表達(dá)情況，Notch1 信號(hào)在巨噬細(xì)胞中如何調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的釋放，以及細(xì)胞間接觸相互影響如何，TAK1 如何調(diào)控Casp8 和RIPK1 的表達(dá)等，均有待進(jìn)一步研究。