靶向MPO的次氯酸熒光探針用于細(xì)胞成像

徐輝軍，王玉婷，秦亞娟，厲廷有

南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）介導(dǎo)吞噬體內(nèi)鹵代氧化劑的產(chǎn)生，在細(xì)菌殺傷，保護(hù)身體免受疾病侵害中起關(guān)鍵作用［1］。Chen 等［2］研究發(fā)現(xiàn)MPO 活性與腦卒中相關(guān)，在短暫性大腦中動脈閉塞（transience middle cerebral artery occlusion，tMCAO）和永久性大腦中動脈閉塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）動物模型中，缺血皮層中的MPO 活性在缺血開始6 h 升高，在第5 天達(dá)到峰值，并在第15天逐漸恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。對缺血性卒中模型使用MPO 抑制劑KYC 可以減小腦梗死體積，保護(hù)血腦屏障，減輕神經(jīng)缺損［3-5］。大量研究表明MPO 可以作為腦卒中的標(biāo)志物，且MPO 抑制劑可以用于治療腦卒中。

次氯酸（hypochloric acid，HClO）常被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)殺傷微生物的活性物質(zhì)。當(dāng)過氧化氫存在時，F(xiàn)e3+-MPO（天然酶）經(jīng)歷雙電子氧化，形成化合物Ⅰ（·+por-Fe［IV］=O）和H2O?；衔颕 可以通過鹵化物（Cl-、Br-、I-，但不包括F-）或假鹵化物（SCN-）的雙電子還原轉(zhuǎn)化為天然酶，在還原過程中產(chǎn)生各自的次鹵酸（HClO、HBrO、HIO 或HOSCN），且由于血漿中Cl-的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他鹵化物，所以HClO 是MPO 鹵化循環(huán)中最豐富和最重要的產(chǎn)物［6］。腦卒中發(fā)生后，MPO 被激活，引發(fā)HClO大量產(chǎn)生。

近年來，HClO 熒光探針的研究取得了顯著進(jìn)展，雖然已發(fā)表的探針在體外對HClO 均有很好的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性，且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中獲得了優(yōu)秀的檢測效果，然而其較短的激發(fā)和發(fā)射波長（一般情況下λex＜600 nm，λem＜650 nm）會帶來多種問題，如可能會受到體內(nèi)自身熒光信號的干擾、對生物樣品產(chǎn)生光毒性以及可能出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象等［7-8］。且它們沒有靶向檢測MPO 的能力，在體內(nèi)使用受到限制。

本文以具有高光穩(wěn)定性和近紅外發(fā)射能力的硅羅丹明為熒光基團(tuán)，通過酰肼硫脲鍵連接MPO的靶向基團(tuán)KYC 合成SiRho-GABA-KYC（圖1）［9-10］。HClO存在時硅羅丹明-硫氨基脲會發(fā)生環(huán)化反應(yīng)并產(chǎn)生顯著的熒光啟動反應(yīng)［11］。該探針可在體外特異性檢測HClO，可用于細(xì)胞成像。

圖1 探針SiRho-GABA-KYC結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of SiRho-GABA-KYC

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器

1H NMR、13C NMR（400 MHz 核磁共振儀，JEOL公司，日本）；質(zhì)譜（Agilent-6410 LC/MS，Agilent 公司，美國）；硅膠板（薄層層析用，青島化工研究所）；多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY H1，BioTek 公司，美國）；氣浴恒溫振蕩器（CHA-S THZ-82 ZD-85，江蘇正基儀器有限公司）；臺式低速冷凍離心機(jī)（CenLee 5R，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（HERAcell 150i，Thermo Scientific 公司，美國）；紫外分光光度計(jì)（UV-2450，Shimadzu 公司，日本）；熒光分光光度計(jì)（FL-4600，Hitachi 公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（LSM 800，Zeiss公司，德國）。化學(xué)試劑除特殊說明外均為市售試劑。

1.1.2 細(xì)胞系與培養(yǎng)條件

HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，80 U/mL青霉素，0.08 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于5%CO2，37 益的培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 化合物的合成

化合物的合成方法如圖2所示。

圖2 化合物的合成方法Figure 2 Synthetic scheme for the compounds

1.2.1.1 xhj-2-1的合成

于氬氣保護(hù)下，將3-溴-N，N-二甲基苯胺（10 g，50 mmol）溶于30 mL 無水四氫呋喃（THF）中，冷卻至-78 益，加入正丁基鋰（n-BuLi）（2.5 mol/L 的己烷溶液，22 mL，55 mmol），反應(yīng)2 h 后，加入二氯二甲基硅烷（3.6 mL，30 mmol），升溫至室溫繼續(xù)反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加冰水淬滅，減壓濃縮除盡THF 后用乙酸乙酯（EA）萃取3 次，合并有機(jī)層，加無水硫酸鈉（Na2SO4）干燥。有機(jī)相減壓濃縮后通過硅膠柱層析［石油醚（PE）∶EA=50∶1］得淺黃色油狀液體4.8 g，產(chǎn)率：64.34%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.25（d，J=5.6 Hz，1H），7.22（d，J=7.8 Hz，1H），6.93（d，J=2.7 Hz，2H），6.91（d，J=7.1 Hz，2H），6.76（dd，J=8.3，2.4 Hz，2H），2.92（s，12H），0.53（s，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：150.13，139.15，128.68，122.94，118.53，113.76，40.89，-1.95。高分辨質(zhì)譜（HRMS）［離子源類型（ESI）］m/z：299.23［M+H］+。

1.2.1.2 xhj-2-2的合成

將xhj-2-1（1 g，3.35 mmol），2-羧基苯甲醛（2.52 g，16.8 mmol）和溴化銅（CuBr2）（75 mg，0.34 mmol）置于耐壓管中，升溫至140 益攪拌5 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液冷卻至室溫，二氯甲烷（DCM）稀釋后調(diào)節(jié)pH至堿性，用DCM 萃取3 次，收集有機(jī)相，無水Na2SO4干燥后減壓濃縮，通過硅膠柱層析（PE∶EA∶Et3N=50∶1∶1）得粗品，再次通過硅膠柱層析（PE∶DCM=1∶10），所得粗品用EA/PE（石油醚）重結(jié)晶得淡藍(lán)色固體300 mg，產(chǎn)率：20.86%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.95（d，J=7.6 Hz，1H），7.62（td，J=7.5，1.0 Hz，1H），7.53（dd，J=11.1，3.9 Hz，1H），7.29（d，J=7.7 Hz，1H），6.96（d，J=2.7 Hz，2H），6.78（d，J=8.8 Hz，2H），6.54（dd，J=8.9，2.8 Hz，2H），2.95（s，12H），0.64（s，3H），0.60（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：170.90，154.57，149.44，137.17，133.85，128.86，128.34，127.21，125.82，124.76，116.79，113.48，92.06，40.48，0.63，-1.32。HRMS（ESI）m/z：429.22［M+H］+。

1.2.1.3 xhj-2-3的合成

將xhj-2-2（44 mg，0.10 mmol）溶于5 mL 乙醇（EtOH）中，升溫至80 益，加入85%水合肼（0.2 mL，3.48 mmol），攪拌回流4 h，反應(yīng)結(jié)束后減壓濃縮。濃縮液用EA 稀釋，飽和食鹽水洗滌3 次，收集有機(jī)相，加無水Na2SO4干燥。有機(jī)相減壓濃縮后通過硅膠柱層析（PE∶EA=3∶1）得8 mg 無色油狀液體，產(chǎn)率：17.63%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.95～7.86（m，1H），7.34～7.26（m，2H），6.89（d，J=2.8 Hz，2H），6.88～6.85（m，1H），6.73（d，J=9.0 Hz，2H），6.63（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），3.68（s，2H），2.94（s，12H），0.60（s，3H），0.57（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：167.79，153.66，149.02，135.79，132.59，130.33，128.82，127.90，127.48，123.83，122.95，116.19，115.34，73.72，40.43，1.12，0.27。HRMS（ESI）m/z：443.26［M+H］+。

1.2.1.4 isoGABA的合成

將二硫化碳（1.74 mL，28.93 mmol）加入到γ-氨基丁酸（GABA）（1 g，9.7 mmol）和Et3N（3.4 mL，24.5 mmol）的THF/H2O（7 mL/7 mL）溶液中，于室溫?cái)嚢?4 h 后，冷卻至0 益，緩慢滴加碘（I2）（2.7 g，10.6 mmol）的THF（7 mL）溶液，滴加完畢后于0 益繼續(xù)反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液加入6 mL 2 mol/L稀鹽酸 和Na2SO3（0.24 g，1.9 mmol），加 入EA 分層，取有機(jī)層減壓濃縮后通過硅膠柱層析（PE∶EA=2∶1）得淺棕色油狀液體1.34 g，產(chǎn)率：95.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.32（s，1H），3.67～3.55（m，2H），2.50（dd，J=9.0，5.3 Hz，2H），2.06～1.90（m，2H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.69，131.06，44.35，30.83，25.04。

1.2.1.5 SiRho-GABA-OH的合成

將xhj-2-3（550 mg，1.24 mmol）和isoGABA（4.32 g，29.76 mmol）溶于干燥無水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（20 mL）中，在氬氣保護(hù)下于90 益攪拌過夜，通過TLC 監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，EA反復(fù)萃取3 次，收集有機(jī)層。有機(jī)層用飽和食鹽水沖洗3 次后，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮后通過硅膠柱層析（PE∶EA=1∶1）得淡綠色固體440 mg，產(chǎn)率：60.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.97（d，J=7.1 Hz，1H），7.63～7.51（m，2H），7.12（d，J=7.5 Hz，1H），6.88（s，1H），6.83（d，J=2.8 Hz，2H），6.56（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），6.48（d，J=8.9 Hz，2H），5.72（t，J=5.8 Hz，1H），3.22（dd，J=13.0，6.7 Hz，2H），2.92（s，12H），2.08～1.99（m，2H），1.44～1.32（m，2H），0.53（d，J=4.3 Hz，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：182.91，177.83，168.00，153.26，149.24，137.95，134.40，129.88，129.35，129.20，128.72，124.72，123.93，115.92，114.76，73.75，43.92，40.22，31.07，23.83，0.36，-0.59。質(zhì)譜MS（ESI）m/z：586.41［M-H］-。

1.2.1.6 SiRho-GABA-KYC的合成

樹脂溶脹：稱取Rink Amide 樹脂（0.97 g，0.71 mmol），加入DMF（9 mL）充分振搖使溶脹樹脂，30 min后抽干DMF。DMF洗滌6次，振搖5 min/次。

肽鍵的形成：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振搖5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振搖40 min，抽干；DMF 洗滌6 次。加入Fmoc-Cys（Trt）-OH（2.5 eq，1 038 mg），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBop）（2.5 eq，927 mg），1-羥基苯并三唑（HOBT）（2.5 eq，240 mg），N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），26 益恒溫振搖4 h。抽干，DMF 洗滌6 次，每次振搖5 min，抽干。

二肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振搖5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振搖40 min，抽干；DMF 洗滌6 次。加入Fmoc-Tyr（tBu）-OH（2.5 eq，815 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），恒溫26 益振搖4 h。抽干，DMF 洗滌6 次，振搖5 min/次，抽干。

三肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振搖5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振搖40 min，抽干；DMF 洗滌6 次。加入Fmoc-Lys（Boc）-OH（2.5 eq，834 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），恒溫26 益振搖4 h。抽干，DMF 洗滌6 次，振搖5 min/次，抽干。

四肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振搖5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振搖40 min，抽干；DMF 洗滌6次。加入SiRho-GABAOH（1.05 eq，440 mg），PyBop（1.2 eq，460 mg），HOBT（1.2 eq，120 mg），DIPEA（2.0 eq，236 μL），DMF（9 mL），恒溫26 益振搖4 h。抽干，DMF 洗滌6 次，振搖5 min/次，抽干。

樹脂后處理：DMF 洗滌3 次，DCM 洗滌3 次，MeOH 洗滌3 次，DCM 洗滌3 次，MeOH 洗滌洗滌3 次，振搖5 min/次，洗滌后放入真空干燥器充分干燥。

在上述充分干燥的樹脂中加入三氟乙酸（9.5 mL）和三異丙基硅烷（0.5 mL），恒溫26 益振搖2 h，抽濾，濾液保存待用。此步驟重復(fù)2 次，合并3 次切割所得濾液，減壓濃縮至小體積，加入冰乙醚析出沉淀，過濾干燥得粗品。溶解后用液相進(jìn)行半制備。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.65（s，1H），8.00（dd，J=11.0，8.0 Hz，2H），7.90（d，J=6.9 Hz，1H），7.83（d，J=7.8 Hz，1H），7.76～7.56（m，5H），7.24（d，J=13.6 Hz，2H），7.04～6.93（m，5H），6.72～6.27（m，6H），2.97（dd，J=16.0，5.4 Hz，3H），2.89（d，J=3.2 Hz，12H），2.83～2.67（m，5H），2.25～2.18（m，1H），1.87（t，J=7.2 Hz，2H），1.63～1.35（m，4H），1.21（d，J=6.9 Hz，4H），0.49（d，J=14.1 Hz，6H）。MS（ESI）m/z：491.34［1/2M+H］+。

1.2.2 活性測試

1.2.2.1 光譜測量

紫外測定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）與HClO（50 μmol/L，PBS）于37 益孵育30 min后檢測紫外吸收光譜。

熒光測定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）與HClO（50 μmol/L，PBS）于37 益孵育30 min后，檢測激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

pH 穩(wěn)定性：在不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5）的PBS 緩沖液（50% DMF）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）與HClO（50 μmol/L）于37 益孵育30 min后，用620 nm激發(fā)檢測波長681 nm處的熒光強(qiáng)度。

濃度依賴性：在PBS（50% DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）與HClO（0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、25.00、40.00、50.00 μmol/L）于37 益孵育30 min后檢測熒光光譜。

選擇性：在PBS（50% DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）與不同底物（50 μmol/L）于37 益孵育30 min后，用620 nm激發(fā)檢測波長681 nm處的熒光強(qiáng)度。各組底物：①Control；②H2O2；③HBrO；④·OH；⑤tBuOO·；⑥ROO·；⑦TBHP；⑧ONOO-；⑨NO；⑩ NO；? NO；? Na+；? K+；? Ca2+；? Mg2+；? Zn2+；? Cu2+；? Fe3+；? Cl-；? I-；? Arg；? Gly；? Glu；? Cys；? H2S；? GSH；? HOCl。

1.2.2.2 細(xì)胞毒性

取處于對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞制成懸液并接種到96 孔板中（細(xì)胞密度約為5×104個/孔），于37 益，5% CO2的孵育環(huán)境中培養(yǎng)12 h，加入SiRho-GABA-KYC溶液（相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度為0、5、10、20、30、50 μmol/L），另設(shè)空白組（無細(xì)胞），每組設(shè)6 個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，棄去上清液，加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm 處測量各孔的吸光值。

1.2.2.3 外源性HClO細(xì)胞成像

取處于對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞制成懸液，加入到預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，于37 益，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗1 次，加入不同濃度的次氯酸鈉（相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度為0、5、10、15、20、30 μmol/L）和opti-MEM 預(yù)孵育30 min后，更換opti-MEM，然后加入SiRho-GABA-KYC（細(xì)胞培養(yǎng)基中濃度為10 μmol/L，1%DMF）和Hoechst 33258（8 μmol/L）孵育30 min后，棄去上清液，用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次，加4%多聚甲醛于室溫下固定15 min后，用PBS清洗3次，取出蓋玻片，細(xì)胞貼壁面朝下置于載玻片（滴加5 μL 抗熒光猝滅劑）上，蓋玻片四周用指甲油密封，避光，使用Zeiss LSM 800激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用GraphPad Prism7軟件分析，符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探針的光譜特性

SiRho-GABA-KYC 加入HClO后，如圖3A所示，紫外最大吸收波長位于660 nm。隨后檢測SiRho-GABA-KYC 與HClO 反應(yīng)后的熒光發(fā)射，如圖3B 所示，探針SiRho-GABA-KYC 和HClO 反應(yīng)后，其最大激發(fā)波長位于660 nm，最大發(fā)射波長位于681 nm，但是使用660 nm 激發(fā)會影響發(fā)射光譜，所以使用620 nm作為激發(fā)波長。

圖3 SiRho-GABA-KYC的光譜特性Figure 3 Spectral characteristics of SiRho-GABA-KYC

2.2 探針對HClO的濃度依賴性

檢測SiRho-GABA-KYC 與不同濃度HClO 反應(yīng)的熒光發(fā)射，如圖4A 所示，發(fā)現(xiàn)隨著HClO 濃度（0～25 μmol/L）的升高，熒光也逐漸增強(qiáng)。將681 nm處的熒光強(qiáng)度與HClO濃度（0～50 μmol/L）進(jìn)行線性擬合，如圖4B 所示，HClO 在0～25 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系（y=276.5x+70.51，R2=0.996）。

圖4 SiRho-GABA-KYC的濃度依賴性Figure 4 Concentration dependence of SiRho-GABA-KYC

2.3 探針對pH的穩(wěn)定性

為了檢測探針在不同pH 環(huán)境中的穩(wěn)定性及檢測HClO 的效果，測定了pH 從4.0～8.5 共10 個pH 的純探針以及與次氯酸反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。如圖5 所示，探針本身在不同pH 的緩沖液中熒光強(qiáng)度基本不發(fā)生變化，說明探針受pH變化的影響很小，對pH穩(wěn)定。當(dāng)探針用于檢測HClO 時，在pH 值為5.0 時熒光最強(qiáng)，于生理pH（7.35～7.45）范圍時，探針對HClO仍有較強(qiáng)響應(yīng)，因此該探針適用于細(xì)胞及體內(nèi)成像。

圖5 SiRho-GABA-KYC的pH穩(wěn)定性Figure 5 pH stability of SiRho-GABA-KYC

2.4 探針對HClO的選擇性

為了驗(yàn)證探針檢測HClO 的選擇性，對該探針與其他可能會與探針反應(yīng)的活性氧或活性氮（H2O2、HBrO、·OH、tBuOO·、ROO·、TBHP、ONOO-、NO、、），生物硫醇（Cys、H2S、GSH），金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+），鹵素離子（Cl-、I-）和氨基酸（Arg、Gly、Glu）的響應(yīng)活性進(jìn)行了檢測，如圖6 所示。探針對HClO 的選擇性優(yōu)于其他生物相關(guān)分子，只有HClO促進(jìn)了熒光發(fā)射的顯著增強(qiáng)，而在其他底物的存在下，探針的熒光光譜沒有觀察到明顯的變化。在681 nm 處，探針對HClO 響應(yīng)后的熒光增強(qiáng)相較其他檢測底物＞30倍。

圖6 SiRho-GABA-KYC的選擇性Figure 6 Selectivity of SiRho-GABA-KYC

2.5 探針的響應(yīng)機(jī)制

氧（硅）雜蒽螺環(huán)開環(huán)是檢測次氯酸常用的一個識別基團(tuán)，依照已有的研究猜測，它與HClO反應(yīng)后，硅羅丹明-氨基硫脲基團(tuán)成環(huán)，氧（硅）雜環(huán)形成共軛結(jié)構(gòu)，如圖7所示。

圖7 SiRho-GABA-KYC與HClO的響應(yīng)機(jī)制圖Figure 7 Response mechanism of SiRho-GABA-KYC with HClO

為了研究探針與次氯酸是否如預(yù)期反應(yīng)，設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)設(shè)置如下3組實(shí)驗(yàn)：①探針溶液，②探針與HClO 混合溶液，③產(chǎn)物溶液，在37 益孵育5 min后，使用液相進(jìn)行分析，收集探針與目標(biāo)產(chǎn)物的信號（圖8）。探針與次氯酸的混合溶液中出現(xiàn)的新峰與產(chǎn)物峰保留時間一致，說明探針與次氯酸按照設(shè)想的機(jī)制進(jìn)行反應(yīng)。

圖8 HPLC分析結(jié)果Figure 8 HPLC analysis

2.6 細(xì)胞毒性

用CCK-8 比色法進(jìn)行探針的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖9，HeLa 細(xì)胞與50 μmol/L 以下的SiRho-GABA-KYC孵育24 h后，細(xì)胞存活率超過90%，表明SiRho-GABA-KYC對HeLa細(xì)胞的毒性很小，生物相容性好，細(xì)胞對10 μmol/L的探針是完全可以耐受的。

圖9 SiRho-GABA-KYC對HeLa細(xì)胞活力的影響Figure 9 Effect of SiRho-GABA-KYC on relative of cell viability of HeLa cells

2.7 外源性次氯酸成像

為了考察探針對細(xì)胞中外源性HClO 的成像能力，用不同濃度的HClO 處理HeLa 細(xì)胞（圖10）。熒光強(qiáng)度隨外源性HClO 濃度升高而增強(qiáng)，加入30 μmol/L HClO 孵育的熒光強(qiáng)度比對照組增強(qiáng)＞2 倍，表明探針能夠有效檢測HeLa 細(xì)胞的外源性HClO，且與HClO呈濃度依賴性增強(qiáng)。

圖10 SiRho-GABA-KYC對細(xì)胞中外源性HClO的成像能力Figure 10 Imaging ability of SiRho-GABA-KYC for exogenous HClO in cells

3 討論

HClO 是氧化應(yīng)激中非常重要的一類生物標(biāo)志物，它的過量產(chǎn)生與多種疾病密切相關(guān)。腦卒中發(fā)生后，MPO 表達(dá)量和催化活性上調(diào)，HClO 生成增加。目前，HClO 熒光探針的研究取得了顯著進(jìn)展，雖然這些HClO 探針在體外對HClO 均有很好的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性，但沒有靶向檢測MPO 的能力。在此前提下，設(shè)計(jì)合成了SiRho-GABA-KYC。該探針對HClO 響應(yīng)較高，選擇性好。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針對細(xì)胞毒性小，對細(xì)胞外源性的HClO有較好的檢測能力。希望可以對該探針進(jìn)行深入的研究，用于生物活體成像，以期最終應(yīng)用于腦卒中的診斷和治療。