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    斯里蘭卡木薯花葉病毒TVM3 分離物侵染性克隆構(gòu)建及鑒定

    2023-10-29 12:54:18余乃通冼淑麗尹慧祥趙羽涵鄭小寶劉志昕
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:木薯擬南芥侵染

    余乃通,冼淑麗,尹慧祥,趙羽涵,鄭小寶,劉志昕

    (1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,海南 海口 571101;2.海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 571101;3.清華大學(xué)附屬中學(xué)文昌學(xué)校,海南 文昌 571300)

    【 研究意義】木薯(Manihot esculentaCrantz)是世界熱區(qū)的重要口糧,也是重要的熱帶能源作物之一。木薯具有較強(qiáng)的耐旱、耐貧瘠能力,適應(yīng)性強(qiáng),目前已在世界熱區(qū)廣泛種植[1-2]。然而,由木薯雙生病毒(Cassava mosaic geminivirus,CMVs)感染引起的木薯花葉?。–assava mosaic disease,CMD)是世界木薯產(chǎn)業(yè)的主要限制因素,在非洲和東南亞廣泛流行。引起CMD 的CMVs 病原及其變種有11 種,包括非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus,ACMV)、斯里蘭卡木薯花葉病毒(SLCMV)、南非木薯花葉病毒(South African cassava mosaic virus,SACMV)等[3]。20 世紀(jì)初,SLCMV首先在斯里蘭卡被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道,目前已在亞洲的柬埔寨、泰國(guó)、越南、老撾、印度和中國(guó)等國(guó)家發(fā)現(xiàn)[4]。2018 年,在我國(guó)的福建和海南木薯上首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了木薯花葉病的病原,即SLCMV[5-6],序列分析顯示,SLCMV 中國(guó)分離株和斯里蘭卡分離株以及印度分離株序列高度相似,同源性在98.5%以上。中國(guó)學(xué)者對(duì)SLCMV 及其他木薯雙生病毒研究尚屬起步階段,且國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源對(duì)SLCMV的抗性背景也不清楚。此外,從亞洲各地區(qū)分離的不同SLCMV 株系,其致病性差異還未有研究。因此,開(kāi)展SLCMV 病毒侵染性克隆及鑒定是解決上述問(wèn)題的重要前期基礎(chǔ)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】SLCMV 是雙生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色黃花葉病毒屬(Begomovirus)成員,其基因組由2 條大小約2 800 nt 的單鏈環(huán)狀DNA 組分組成,即DNA-A 組分和DNA-B組分[7-8]。本研究中SLCMV TVM3株系的DNA-A組分(GenBank序列號(hào):KP455486.1)全長(zhǎng)為2 747 nt,其正義鏈上含有2 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF):AV1 和AV2,分別編碼外殼蛋白(Coat protein,CP)和AV2 蛋白;反義鏈含有4個(gè)ORF:AC1、AC2、AC3 和AC4,分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Replication-associated protein,Rep)、轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Transcriptional activator protein,TrAP)、復(fù)制增強(qiáng)子(Replication enhancer,REn)和RNA 沉默抑制子AC4 蛋白。DNA-B 組分(GenBank 序列號(hào):KP455487.1)全長(zhǎng)為2 741 nt,其正義鏈和反義鏈各含有1 個(gè)ORF,即BV1 和BC1,分別編碼核穿梭蛋白(Nuclear shuttle protein,NSP)和運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein,MP)[9]。根據(jù)DNA-A組分全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Legg 等[10]把11種CMVs 及其變種分成3 組,分別為南亞組、西非組和東南非組。在亞洲地區(qū),木薯花葉病由印度木薯花葉病毒(Indian cassava mosaic virus,ICMV)和SLCMV 的2 個(gè)株系感染引起,均屬南亞組[11]。早在1993 年,就有學(xué)者成功構(gòu)建了木薯花葉病毒侵染性克?。?2]。2002年,Saunders等[13]也成功構(gòu)建了SLCMV 的侵染性克隆,初步闡明SLCMV 最早可能是單組分病毒,進(jìn)化過(guò)程中獲取了DNA-B 組分從而成為雙組分病毒。

    【本研究切入點(diǎn)】雖然木薯花葉病已在中國(guó)福建和海南等地方出現(xiàn),但目前尚未在我國(guó)發(fā)生流行和大面積危害;國(guó)內(nèi)木薯品種抗性不明及抗病種質(zhì)資源缺乏的現(xiàn)狀仍然存在,木薯花葉病一旦流行,將對(duì)我國(guó)木薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害和經(jīng)濟(jì)損失。因此,開(kāi)展病毒侵染性克隆構(gòu)建是探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的有效手段。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的病毒侵染性克隆,可通過(guò)農(nóng)桿菌將含有目的病毒片段的質(zhì)粒介導(dǎo)到植物體內(nèi),從而激活病毒蛋白表達(dá)和產(chǎn)生病毒全長(zhǎng)基因組,最后包裝成有侵染活性的病毒粒子,用于SLCMV 與宿主相互作用研究。本研究以SLCMV TVM3 株系為研究對(duì)象,旨在構(gòu)建不含有編碼區(qū)重復(fù)序列的病毒侵染性克隆,且能成功感染本生煙和擬南芥等模式植物,為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的精準(zhǔn)鑒定、病毒基因功能鑒定以及病毒致病機(jī)理研究等提供重要前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301 由本實(shí)驗(yàn)保存;EasyTaq DNA Polymerase、GV3101(pSoupp19)農(nóng)桿菌感受態(tài)、大腸桿菌DH5a 感受態(tài)、質(zhì)??焖傩√嵩噭┖?、2k DNA Marker、12k DNA Marker 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;快速植物DNA 提取試劑盒(RaPure Plant DNA Mini Kit)購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司;T4 DNA 連接酶、SacI、SalI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;本生煙(Nicotiana benthamiana)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆載體構(gòu)建

    以全長(zhǎng)為2 747 nt 的SLCMV DNA-A 為模板,構(gòu)建DNA-A 侵染性克隆載體。如圖1A 所示,該侵染性克隆序列除了含有完整的DNA-A 全長(zhǎng)序列外,其5′端還額外含有145 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-A+2603~+2747),3′端也額外含有137 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-A+1~+137),兩端分別含有SacI 和SalI 酶切位點(diǎn)。將此DNA-A侵染性克隆序列送往通用生物(安徽)股份有限公司合成,通過(guò)T4 DNA 連接酶(16 ℃)構(gòu)建到pCAMBIA1301 載體中,即pCAMBIA1301-DNA-A(pDNA-A)。通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pDNA-A 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑取1 個(gè)重組子進(jìn)行Sanger 測(cè)序,所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-A-seq1~DNA-A-seq4(表1);同時(shí)提取質(zhì)粒,用SacI 和SalI 雙酶切驗(yàn)證。

    表1 所使用的引物列表Table 1 Primers used in this study

    圖1 pDNA-A(A)和pDNA-B(B)侵染性克隆構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the construction of pDNA-A(A) and pDNA-B (B) infectious clone

    以全長(zhǎng)為2 741 nt 的SLCMV DNA-B 為模板,構(gòu)建DNA-B 侵染性克隆載體。如圖1B 所示,該侵染性克隆序列除了含有DNA-B 完整的全長(zhǎng)序列外,其5′端還額外含有106 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-B+2636~+2741),同樣,其3′端也額外含有119 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-B+1~+119)。其他步驟同DNA-A,所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-B-seq1~DNA-B-seq4(表1)。

    1.3 侵染性克隆接種本生煙和擬南芥植株

    采用液氮凍融法,將pDNA-A、pDNA-B 分別轉(zhuǎn)入GV3101(pSoup-p19)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性單菌落至500 μL 含有抗生素(50 μg/mL Kan,50 μg/mL Rif,50 μg/mL Strep)的LB 液體培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng),28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h;按照1:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng),同時(shí)加入終濃度為20 mol/L 的AS 和10 mmol/L 的Mes,28 ℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng);4 ℃、5 000 r/min 離心10 min,去上清,菌體沉淀用500 μL 溶液(150 μmol/L AS,10 mmol/L Mes,10 μmol/L MgCl2)重懸,測(cè)定菌液OD600值,使兩者的菌液OD600值一致(濃度范圍0.4~0.6);然后1:1 混合兩者的菌液,室溫靜置3~5 h;用0.2 mL 的無(wú)針頭注射器將50 μL 處理好的農(nóng)桿菌注入本生煙(5~6 葉期)葉片下表皮的葉脈之間,每個(gè)葉片注射1 個(gè)點(diǎn),每株注射3 個(gè)葉片,共接種10 棵本生煙植株,同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的本生煙為對(duì)照,置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

    另將混勻的農(nóng)桿菌侵染液倒入淺口容器中,將擬南芥植株(5~6 葉期)的花絮和莖浸入侵染液,靜置1 min,共接種10 棵擬南芥植株,同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的擬南芥為對(duì)照,置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

    1.4 癥狀觀察及PCR 檢測(cè)

    SLCMV 侵染性克隆通過(guò)GV3101 農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥植株后,每隔2~3 d 觀察并記錄植株癥狀。接種14 d(擬南芥接種18 d)后,采集本生煙和擬南芥植株的第3 片或第4 片新生葉片,用試劑盒(RaPure Plant DNA Mini Kit)提取其總DNA,利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R(擴(kuò)增目的片段約400 bp)、以及DNA-B 370F 和DNA-B 800R(擴(kuò)增目的片段約430 bp)兩對(duì)引物分別對(duì)病毒兩個(gè)組分進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 程序:95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取5 μL 于1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

    1.5 SLCMV 侵染性克隆感染率檢測(cè)

    本生煙和擬南芥植株接種SLCMV 侵染性克隆后,每隔2~3 d 觀察并記錄植株癥狀,在第30 d 采集本生煙(10 株)和擬南芥(10 株)植株的新生葉片,利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R 對(duì)病毒進(jìn)行PCR 檢測(cè),PCR 程序同上。取5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳,置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后,分別計(jì)算SLCMV 在本生煙和擬南芥植株中的感染率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建

    將獲得的pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果顯示均得到了3.1 kb左右的目的片段和12 kb 左右的載體片段(圖2),Sanger 測(cè)序表明其序列與目標(biāo)序列一致,說(shuō)明pDNA-A、pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功;即成功獲得了SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒pCAMBIA1301-SLCMV,可用于下一步的病毒接種實(shí)驗(yàn)。

    圖2 SLCMV DNA-A 和DNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建Fig. 2 Construction of SLCMV DNA-A and DNA-B infectious clone plasmids

    2.2 SLCMV 侵染本生煙和擬南芥植株癥狀觀察及分子檢測(cè)

    本生煙接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后,大部分本生煙植株新生葉片無(wú)明顯癥狀;而在接種第10 d,本生煙植株的新生葉片開(kāi)始出現(xiàn)扭曲、斑點(diǎn)褪綠等癥狀;接種第14 d,本生煙植株新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀;對(duì)照組新生葉片無(wú)癥狀(圖3A)。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,在接種SLCMV 的第14 d,染病本生煙植株新生葉片DNA中可檢測(cè)出DNA-A和DNA-B的特異性條帶,而對(duì)照植株無(wú)任何條帶(圖3B),表明SLCMV 病毒已在本生煙植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

    圖3 SLCMV 侵染本生煙癥狀(A)及分子檢測(cè)(B)Fig. 3 Symptoms (A) and molecular detection (B) of tobacco plants infected by SLCMV

    接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后,大部分?jǐn)M南芥植株新生葉片無(wú)明顯癥狀;而在接種第11 d,擬南芥植株的新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲癥狀;第18 d,新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲、老葉黃化等癥狀;對(duì)照組新生葉片無(wú)癥狀(圖4A)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,接種SLCMV 18 d 后,染病擬南芥植株新生葉片可見(jiàn)DNA-A 和DNA-B 的特異性條帶,而對(duì)照組無(wú)任何條帶(圖4B),表明SLCMV 病毒已在擬南芥植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

    圖4 SLCMV 侵染擬南芥癥狀(A)及分子檢測(cè)(B)Fig. 4 Symptoms (A) and molecular detection (B) of Arabidopsis plants infected by SLCMV

    2.3 SLCMV 在本生煙和擬南芥中的病毒感染率

    接種SLCMV 侵染性克隆后,本生煙植株前14 d 的病程與2.2 相似,而在15~30 d,表現(xiàn)出嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀,且癥狀進(jìn)一步加重。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A組分進(jìn)行PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示,染病本生煙植株新生葉片均可檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶,pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶,而對(duì)照組無(wú)任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,SLCMV 侵染性克隆在本生煙中的病毒感染率為96.67%(圖5)。

    圖5 本生煙和擬南芥接種SLCMV 侵染性克隆后的病毒感染率Fig. 5 Viral infection rate of tobacco and Arabidopsis plants inoculated with SLCMV infectious clone

    接種SLCMV 侵染性克隆后,擬南芥植株前18 d 的病程與2.2 相似;在第19~30 d,其癥狀未有明顯變化,部分新生葉片仍出現(xiàn)輕微扭曲、老葉出現(xiàn)黃化等癥狀。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A 組分進(jìn)行PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示,僅從部分?jǐn)M南芥植株新生葉片中檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶,而其他擬南芥植株新生葉片未檢測(cè)到特異條帶;pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶,對(duì)照組無(wú)任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,SLCMV 侵染性克隆在擬南芥中的病毒感染率為40 %(圖5)。因此,SLCMV 侵染性克隆通過(guò)農(nóng)桿菌接種本生煙的病毒感染率達(dá)到96.67%,遠(yuǎn)高于在擬南芥植株中的病毒感染率,差異顯著(P< 0.05)。

    3 討論

    病毒侵染性克隆是病毒反向遺傳學(xué)操作的重要研究手段,也是病毒基因功能研究的基礎(chǔ)工具。通過(guò)植物雙向表達(dá)載體可將有侵染活性的病毒全長(zhǎng)cDNA 在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá),或體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 產(chǎn)物從而成功侵染宿主植物,兩者都能產(chǎn)生病毒粒子。以此獲得的病毒侵染性克隆,可用于病毒基因組的突變、缺失、插入、置換等研究,從而在寄主植物水平開(kāi)展和鑒定病毒功能基因。植物DNA 病毒的侵染性克隆是1983 年在番茄金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)上首先構(gòu)建成功的[14],隨后其發(fā)展極為迅速,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和農(nóng)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。大量研究表明,植物環(huán)狀DNA 病毒的侵染性克隆構(gòu)建需要大于一個(gè)病毒基因組的全長(zhǎng)序列,一般為1.3~1.9 倍(mer)于病毒基因組[15-16]。本研究構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆,其pDNA-A和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 的1.1 倍(mer)和1.08 倍(mer),其重復(fù)序列主要來(lái)自非編碼區(qū),不含有編碼區(qū)序列。因此,該SLCMV 病毒侵染性克隆在研究病毒功能基因的突變、缺失、插入、置換等DNA 重組技術(shù)帶來(lái)更簡(jiǎn)便、更高效的研究方法。

    本研究的SLCMV 病毒侵染性克隆(TVM3株系)通過(guò)農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥,其病毒接種率存在一定的差異。如通過(guò)葉下表皮注射本生煙葉片,其96.67%的本生煙植株均能感染SLCMV 病毒,而擬南芥植株的感染率僅為40%,兩者差異顯著(P<0.05)。其可能原因一是接種方法不同,擬南芥由于葉片偏小,主要采用的浸泡植物組織的方法,在效率上比直接注射體內(nèi)會(huì)低一些。另一個(gè)原因是宿主植物差異,已有研究表明,菜豆金色黃花葉病毒屬病毒更容易感染本生煙且表現(xiàn)出明顯的癥狀,而在擬南芥中對(duì)SLCMV 敏感性低,在植物中表現(xiàn)的癥狀也較輕[17-18],因此在進(jìn)化上,病毒在侵染宿主方面會(huì)更好的選擇本生煙植株。

    王國(guó)芬等[19]構(gòu)建了SLCMV 兩個(gè)中國(guó)分離物的侵染性克隆,SLCMV-Col 和SLCMV-DG1922。強(qiáng)致病分離物SLCMV-Col 侵染性克隆接種普通煙,在第27 d 可引起普通煙葉片向下卷曲,葉背出現(xiàn)耳突,扭曲變形和植株矮化。而弱致病分離物SLCMV-DG1922 侵染性克隆接種普通煙,在第27 d 普通煙癥狀不典型,植株新抽葉片無(wú)明顯癥狀,植株生長(zhǎng)正常。早在2008 年,SLCMVKer20 侵染性克隆被構(gòu)建成功,其感染的普通煙癥狀也不典型,植株新抽葉片無(wú)明顯癥狀,表明SLCMV-Ker20 也可能是弱毒株系[17]。而本研究所使用的SLCMV-TVM3 分離物感染本生煙后,在第14 d 新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀,表明該分離物為強(qiáng)致病株系。

    綜上所述,本文構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆為下一步探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景,病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能,以及寄主與病毒之間的相互作用提供重要前期基礎(chǔ),還可以利用該病毒侵染性克隆進(jìn)行外源蛋白表達(dá)、基因沉默誘導(dǎo)等研究。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建了斯里蘭卡木薯花葉病毒TVM3 株系(SLCMV-TVM3)侵染性克隆并能侵染本生煙和擬南芥等模式植物。該侵染性克隆pDNA-A 和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 大小的1.10 倍(mer)和1.08 倍(mer)且不含有重復(fù)的編碼區(qū)序列,可為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景探究和病毒致病機(jī)理研究提供重要前期基礎(chǔ)。癥狀跟蹤觀察和分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLCMV 可在本生煙新生葉片上大量增殖,且引起典型的扭曲、卷葉和明顯的褪綠等雙生病毒典型癥狀,而在擬南芥新生葉片僅表型出輕微癥狀。此外,SLCMV 在本生煙中的病毒感染率達(dá)96.67%,而在擬南芥植株中僅為40%,兩者差異顯著,因此,本生煙更適用于雙生病毒的致病機(jī)理研究。

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