• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    斯里蘭卡木薯花葉病毒TVM3 分離物侵染性克隆構(gòu)建及鑒定

    2023-10-29 12:54:18余乃通冼淑麗尹慧祥趙羽涵鄭小寶劉志昕
    廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:木薯擬南芥侵染

    余乃通,冼淑麗,尹慧祥,趙羽涵,鄭小寶,劉志昕

    (1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,海南 海口 571101;2.海南省熱帶微生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 海口 571101;3.清華大學(xué)附屬中學(xué)文昌學(xué)校,海南 文昌 571300)

    【 研究意義】木薯(Manihot esculentaCrantz)是世界熱區(qū)的重要口糧,也是重要的熱帶能源作物之一。木薯具有較強(qiáng)的耐旱、耐貧瘠能力,適應(yīng)性強(qiáng),目前已在世界熱區(qū)廣泛種植[1-2]。然而,由木薯雙生病毒(Cassava mosaic geminivirus,CMVs)感染引起的木薯花葉?。–assava mosaic disease,CMD)是世界木薯產(chǎn)業(yè)的主要限制因素,在非洲和東南亞廣泛流行。引起CMD 的CMVs 病原及其變種有11 種,包括非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus,ACMV)、斯里蘭卡木薯花葉病毒(SLCMV)、南非木薯花葉病毒(South African cassava mosaic virus,SACMV)等[3]。20 世紀(jì)初,SLCMV首先在斯里蘭卡被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道,目前已在亞洲的柬埔寨、泰國(guó)、越南、老撾、印度和中國(guó)等國(guó)家發(fā)現(xiàn)[4]。2018 年,在我國(guó)的福建和海南木薯上首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了木薯花葉病的病原,即SLCMV[5-6],序列分析顯示,SLCMV 中國(guó)分離株和斯里蘭卡分離株以及印度分離株序列高度相似,同源性在98.5%以上。中國(guó)學(xué)者對(duì)SLCMV 及其他木薯雙生病毒研究尚屬起步階段,且國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源對(duì)SLCMV的抗性背景也不清楚。此外,從亞洲各地區(qū)分離的不同SLCMV 株系,其致病性差異還未有研究。因此,開(kāi)展SLCMV 病毒侵染性克隆及鑒定是解決上述問(wèn)題的重要前期基礎(chǔ)?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】SLCMV 是雙生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色黃花葉病毒屬(Begomovirus)成員,其基因組由2 條大小約2 800 nt 的單鏈環(huán)狀DNA 組分組成,即DNA-A 組分和DNA-B組分[7-8]。本研究中SLCMV TVM3株系的DNA-A組分(GenBank序列號(hào):KP455486.1)全長(zhǎng)為2 747 nt,其正義鏈上含有2 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF):AV1 和AV2,分別編碼外殼蛋白(Coat protein,CP)和AV2 蛋白;反義鏈含有4個(gè)ORF:AC1、AC2、AC3 和AC4,分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Replication-associated protein,Rep)、轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Transcriptional activator protein,TrAP)、復(fù)制增強(qiáng)子(Replication enhancer,REn)和RNA 沉默抑制子AC4 蛋白。DNA-B 組分(GenBank 序列號(hào):KP455487.1)全長(zhǎng)為2 741 nt,其正義鏈和反義鏈各含有1 個(gè)ORF,即BV1 和BC1,分別編碼核穿梭蛋白(Nuclear shuttle protein,NSP)和運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein,MP)[9]。根據(jù)DNA-A組分全長(zhǎng)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),Legg 等[10]把11種CMVs 及其變種分成3 組,分別為南亞組、西非組和東南非組。在亞洲地區(qū),木薯花葉病由印度木薯花葉病毒(Indian cassava mosaic virus,ICMV)和SLCMV 的2 個(gè)株系感染引起,均屬南亞組[11]。早在1993 年,就有學(xué)者成功構(gòu)建了木薯花葉病毒侵染性克?。?2]。2002年,Saunders等[13]也成功構(gòu)建了SLCMV 的侵染性克隆,初步闡明SLCMV 最早可能是單組分病毒,進(jìn)化過(guò)程中獲取了DNA-B 組分從而成為雙組分病毒。

    【本研究切入點(diǎn)】雖然木薯花葉病已在中國(guó)福建和海南等地方出現(xiàn),但目前尚未在我國(guó)發(fā)生流行和大面積危害;國(guó)內(nèi)木薯品種抗性不明及抗病種質(zhì)資源缺乏的現(xiàn)狀仍然存在,木薯花葉病一旦流行,將對(duì)我國(guó)木薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害和經(jīng)濟(jì)損失。因此,開(kāi)展病毒侵染性克隆構(gòu)建是探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的有效手段。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的病毒侵染性克隆,可通過(guò)農(nóng)桿菌將含有目的病毒片段的質(zhì)粒介導(dǎo)到植物體內(nèi),從而激活病毒蛋白表達(dá)和產(chǎn)生病毒全長(zhǎng)基因組,最后包裝成有侵染活性的病毒粒子,用于SLCMV 與宿主相互作用研究。本研究以SLCMV TVM3 株系為研究對(duì)象,旨在構(gòu)建不含有編碼區(qū)重復(fù)序列的病毒侵染性克隆,且能成功感染本生煙和擬南芥等模式植物,為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病遺傳背景的精準(zhǔn)鑒定、病毒基因功能鑒定以及病毒致病機(jī)理研究等提供重要前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301 由本實(shí)驗(yàn)保存;EasyTaq DNA Polymerase、GV3101(pSoupp19)農(nóng)桿菌感受態(tài)、大腸桿菌DH5a 感受態(tài)、質(zhì)??焖傩√嵩噭┖?、2k DNA Marker、12k DNA Marker 均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;快速植物DNA 提取試劑盒(RaPure Plant DNA Mini Kit)購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司;T4 DNA 連接酶、SacI、SalI 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;本生煙(Nicotiana benthamiana)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆載體構(gòu)建

    以全長(zhǎng)為2 747 nt 的SLCMV DNA-A 為模板,構(gòu)建DNA-A 侵染性克隆載體。如圖1A 所示,該侵染性克隆序列除了含有完整的DNA-A 全長(zhǎng)序列外,其5′端還額外含有145 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-A+2603~+2747),3′端也額外含有137 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-A+1~+137),兩端分別含有SacI 和SalI 酶切位點(diǎn)。將此DNA-A侵染性克隆序列送往通用生物(安徽)股份有限公司合成,通過(guò)T4 DNA 連接酶(16 ℃)構(gòu)建到pCAMBIA1301 載體中,即pCAMBIA1301-DNA-A(pDNA-A)。通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pDNA-A 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑取1 個(gè)重組子進(jìn)行Sanger 測(cè)序,所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-A-seq1~DNA-A-seq4(表1);同時(shí)提取質(zhì)粒,用SacI 和SalI 雙酶切驗(yàn)證。

    表1 所使用的引物列表Table 1 Primers used in this study

    圖1 pDNA-A(A)和pDNA-B(B)侵染性克隆構(gòu)建示意圖Fig. 1 Schematic diagram for the construction of pDNA-A(A) and pDNA-B (B) infectious clone

    以全長(zhǎng)為2 741 nt 的SLCMV DNA-B 為模板,構(gòu)建DNA-B 侵染性克隆載體。如圖1B 所示,該侵染性克隆序列除了含有DNA-B 完整的全長(zhǎng)序列外,其5′端還額外含有106 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-B+2636~+2741),同樣,其3′端也額外含有119 bp 的非編碼區(qū)重復(fù)片段(DNA-B+1~+119)。其他步驟同DNA-A,所用引物依次為1301-F、1301-R、DNA-B-seq1~DNA-B-seq4(表1)。

    1.3 侵染性克隆接種本生煙和擬南芥植株

    采用液氮凍融法,將pDNA-A、pDNA-B 分別轉(zhuǎn)入GV3101(pSoup-p19)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性單菌落至500 μL 含有抗生素(50 μg/mL Kan,50 μg/mL Rif,50 μg/mL Strep)的LB 液體培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng),28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h;按照1:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng),同時(shí)加入終濃度為20 mol/L 的AS 和10 mmol/L 的Mes,28 ℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng);4 ℃、5 000 r/min 離心10 min,去上清,菌體沉淀用500 μL 溶液(150 μmol/L AS,10 mmol/L Mes,10 μmol/L MgCl2)重懸,測(cè)定菌液OD600值,使兩者的菌液OD600值一致(濃度范圍0.4~0.6);然后1:1 混合兩者的菌液,室溫靜置3~5 h;用0.2 mL 的無(wú)針頭注射器將50 μL 處理好的農(nóng)桿菌注入本生煙(5~6 葉期)葉片下表皮的葉脈之間,每個(gè)葉片注射1 個(gè)點(diǎn),每株注射3 個(gè)葉片,共接種10 棵本生煙植株,同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的本生煙為對(duì)照,置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

    另將混勻的農(nóng)桿菌侵染液倒入淺口容器中,將擬南芥植株(5~6 葉期)的花絮和莖浸入侵染液,靜置1 min,共接種10 棵擬南芥植株,同時(shí)設(shè)置接種空質(zhì)粒的擬南芥為對(duì)照,置于25 ℃精細(xì)培養(yǎng)房培養(yǎng)。

    1.4 癥狀觀察及PCR 檢測(cè)

    SLCMV 侵染性克隆通過(guò)GV3101 農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥植株后,每隔2~3 d 觀察并記錄植株癥狀。接種14 d(擬南芥接種18 d)后,采集本生煙和擬南芥植株的第3 片或第4 片新生葉片,用試劑盒(RaPure Plant DNA Mini Kit)提取其總DNA,利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R(擴(kuò)增目的片段約400 bp)、以及DNA-B 370F 和DNA-B 800R(擴(kuò)增目的片段約430 bp)兩對(duì)引物分別對(duì)病毒兩個(gè)組分進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR 程序:95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取5 μL 于1%瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

    1.5 SLCMV 侵染性克隆感染率檢測(cè)

    本生煙和擬南芥植株接種SLCMV 侵染性克隆后,每隔2~3 d 觀察并記錄植株癥狀,在第30 d 采集本生煙(10 株)和擬南芥(10 株)植株的新生葉片,利用引物DNA-A 2000F 和DNA-A 2400R 對(duì)病毒進(jìn)行PCR 檢測(cè),PCR 程序同上。取5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳,置于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后,分別計(jì)算SLCMV 在本生煙和擬南芥植株中的感染率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建

    將獲得的pDNA-A 和pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果顯示均得到了3.1 kb左右的目的片段和12 kb 左右的載體片段(圖2),Sanger 測(cè)序表明其序列與目標(biāo)序列一致,說(shuō)明pDNA-A、pDNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功;即成功獲得了SLCMV 侵染性克隆質(zhì)粒pCAMBIA1301-SLCMV,可用于下一步的病毒接種實(shí)驗(yàn)。

    圖2 SLCMV DNA-A 和DNA-B 侵染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建Fig. 2 Construction of SLCMV DNA-A and DNA-B infectious clone plasmids

    2.2 SLCMV 侵染本生煙和擬南芥植株癥狀觀察及分子檢測(cè)

    本生煙接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后,大部分本生煙植株新生葉片無(wú)明顯癥狀;而在接種第10 d,本生煙植株的新生葉片開(kāi)始出現(xiàn)扭曲、斑點(diǎn)褪綠等癥狀;接種第14 d,本生煙植株新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀;對(duì)照組新生葉片無(wú)癥狀(圖3A)。PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,在接種SLCMV 的第14 d,染病本生煙植株新生葉片DNA中可檢測(cè)出DNA-A和DNA-B的特異性條帶,而對(duì)照植株無(wú)任何條帶(圖3B),表明SLCMV 病毒已在本生煙植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

    圖3 SLCMV 侵染本生煙癥狀(A)及分子檢測(cè)(B)Fig. 3 Symptoms (A) and molecular detection (B) of tobacco plants infected by SLCMV

    接種SLCMV 侵染性克隆7 d 后,大部分?jǐn)M南芥植株新生葉片無(wú)明顯癥狀;而在接種第11 d,擬南芥植株的新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲癥狀;第18 d,新生葉片出現(xiàn)輕微扭曲、老葉黃化等癥狀;對(duì)照組新生葉片無(wú)癥狀(圖4A)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,接種SLCMV 18 d 后,染病擬南芥植株新生葉片可見(jiàn)DNA-A 和DNA-B 的特異性條帶,而對(duì)照組無(wú)任何條帶(圖4B),表明SLCMV 病毒已在擬南芥植株成功復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。

    圖4 SLCMV 侵染擬南芥癥狀(A)及分子檢測(cè)(B)Fig. 4 Symptoms (A) and molecular detection (B) of Arabidopsis plants infected by SLCMV

    2.3 SLCMV 在本生煙和擬南芥中的病毒感染率

    接種SLCMV 侵染性克隆后,本生煙植株前14 d 的病程與2.2 相似,而在15~30 d,表現(xiàn)出嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀,且癥狀進(jìn)一步加重。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A組分進(jìn)行PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示,染病本生煙植株新生葉片均可檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶,pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶,而對(duì)照組無(wú)任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,SLCMV 侵染性克隆在本生煙中的病毒感染率為96.67%(圖5)。

    圖5 本生煙和擬南芥接種SLCMV 侵染性克隆后的病毒感染率Fig. 5 Viral infection rate of tobacco and Arabidopsis plants inoculated with SLCMV infectious clone

    接種SLCMV 侵染性克隆后,擬南芥植株前18 d 的病程與2.2 相似;在第19~30 d,其癥狀未有明顯變化,部分新生葉片仍出現(xiàn)輕微扭曲、老葉出現(xiàn)黃化等癥狀。于第30 d 采集新生葉片對(duì)病毒DNA-A 組分進(jìn)行PCR 檢測(cè),結(jié)果顯示,僅從部分?jǐn)M南芥植株新生葉片中檢測(cè)到DNA-A 特異性條帶,而其他擬南芥植株新生葉片未檢測(cè)到特異條帶;pDNA-A 質(zhì)粒和pDNA-A/GV3101 菌液也檢測(cè)出目的條帶,對(duì)照組無(wú)任何條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,SLCMV 侵染性克隆在擬南芥中的病毒感染率為40 %(圖5)。因此,SLCMV 侵染性克隆通過(guò)農(nóng)桿菌接種本生煙的病毒感染率達(dá)到96.67%,遠(yuǎn)高于在擬南芥植株中的病毒感染率,差異顯著(P< 0.05)。

    3 討論

    病毒侵染性克隆是病毒反向遺傳學(xué)操作的重要研究手段,也是病毒基因功能研究的基礎(chǔ)工具。通過(guò)植物雙向表達(dá)載體可將有侵染活性的病毒全長(zhǎng)cDNA 在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá),或體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 產(chǎn)物從而成功侵染宿主植物,兩者都能產(chǎn)生病毒粒子。以此獲得的病毒侵染性克隆,可用于病毒基因組的突變、缺失、插入、置換等研究,從而在寄主植物水平開(kāi)展和鑒定病毒功能基因。植物DNA 病毒的侵染性克隆是1983 年在番茄金色花葉病毒(Tomato golden mosaic virus,TGMV)上首先構(gòu)建成功的[14],隨后其發(fā)展極為迅速,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和農(nóng)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。大量研究表明,植物環(huán)狀DNA 病毒的侵染性克隆構(gòu)建需要大于一個(gè)病毒基因組的全長(zhǎng)序列,一般為1.3~1.9 倍(mer)于病毒基因組[15-16]。本研究構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆,其pDNA-A和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 的1.1 倍(mer)和1.08 倍(mer),其重復(fù)序列主要來(lái)自非編碼區(qū),不含有編碼區(qū)序列。因此,該SLCMV 病毒侵染性克隆在研究病毒功能基因的突變、缺失、插入、置換等DNA 重組技術(shù)帶來(lái)更簡(jiǎn)便、更高效的研究方法。

    本研究的SLCMV 病毒侵染性克隆(TVM3株系)通過(guò)農(nóng)桿菌接種本生煙和擬南芥,其病毒接種率存在一定的差異。如通過(guò)葉下表皮注射本生煙葉片,其96.67%的本生煙植株均能感染SLCMV 病毒,而擬南芥植株的感染率僅為40%,兩者差異顯著(P<0.05)。其可能原因一是接種方法不同,擬南芥由于葉片偏小,主要采用的浸泡植物組織的方法,在效率上比直接注射體內(nèi)會(huì)低一些。另一個(gè)原因是宿主植物差異,已有研究表明,菜豆金色黃花葉病毒屬病毒更容易感染本生煙且表現(xiàn)出明顯的癥狀,而在擬南芥中對(duì)SLCMV 敏感性低,在植物中表現(xiàn)的癥狀也較輕[17-18],因此在進(jìn)化上,病毒在侵染宿主方面會(huì)更好的選擇本生煙植株。

    王國(guó)芬等[19]構(gòu)建了SLCMV 兩個(gè)中國(guó)分離物的侵染性克隆,SLCMV-Col 和SLCMV-DG1922。強(qiáng)致病分離物SLCMV-Col 侵染性克隆接種普通煙,在第27 d 可引起普通煙葉片向下卷曲,葉背出現(xiàn)耳突,扭曲變形和植株矮化。而弱致病分離物SLCMV-DG1922 侵染性克隆接種普通煙,在第27 d 普通煙癥狀不典型,植株新抽葉片無(wú)明顯癥狀,植株生長(zhǎng)正常。早在2008 年,SLCMVKer20 侵染性克隆被構(gòu)建成功,其感染的普通煙癥狀也不典型,植株新抽葉片無(wú)明顯癥狀,表明SLCMV-Ker20 也可能是弱毒株系[17]。而本研究所使用的SLCMV-TVM3 分離物感染本生煙后,在第14 d 新生葉片出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲、卷葉和明顯的褪綠等癥狀,表明該分離物為強(qiáng)致病株系。

    綜上所述,本文構(gòu)建的SLCMV 病毒侵染性克隆為下一步探究國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景,病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能,以及寄主與病毒之間的相互作用提供重要前期基礎(chǔ),還可以利用該病毒侵染性克隆進(jìn)行外源蛋白表達(dá)、基因沉默誘導(dǎo)等研究。

    4 結(jié)論

    本研究成功構(gòu)建了斯里蘭卡木薯花葉病毒TVM3 株系(SLCMV-TVM3)侵染性克隆并能侵染本生煙和擬南芥等模式植物。該侵染性克隆pDNA-A 和pDNA-B 上的病毒序列分別為病毒原基因組DNA-A 和DNA-B 大小的1.10 倍(mer)和1.08 倍(mer)且不含有重復(fù)的編碼區(qū)序列,可為下一步國(guó)內(nèi)木薯種質(zhì)資源抗花葉病的遺傳背景探究和病毒致病機(jī)理研究提供重要前期基礎(chǔ)。癥狀跟蹤觀察和分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLCMV 可在本生煙新生葉片上大量增殖,且引起典型的扭曲、卷葉和明顯的褪綠等雙生病毒典型癥狀,而在擬南芥新生葉片僅表型出輕微癥狀。此外,SLCMV 在本生煙中的病毒感染率達(dá)96.67%,而在擬南芥植株中僅為40%,兩者差異顯著,因此,本生煙更適用于雙生病毒的致病機(jī)理研究。

    猜你喜歡
    木薯擬南芥侵染
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    刮木薯
    揭示水霉菌繁殖和侵染過(guò)程
    尿黑酸對(duì)擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    柬埔寨拜靈木薯喜獲大豐收,市場(chǎng)價(jià)格保持穩(wěn)定
    挖木薯
    兩種LED光源作為擬南芥生長(zhǎng)光源的應(yīng)用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制探究
    蕓薹根腫菌侵染過(guò)程及影響因子研究
    甘藍(lán)根腫病菌休眠孢子的生物學(xué)特性及侵染寄主的顯微觀察
    另类亚洲欧美激情| 91久久精品国产一区二区成人| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| av福利片在线观看| 少妇的逼水好多| 伊人久久国产一区二区| 亚洲国产色片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黑人高潮一二区| 国产黄频视频在线观看| 在线看a的网站| 日韩成人伦理影院| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 在线播放无遮挡| 秋霞伦理黄片| 少妇精品久久久久久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 我的女老师完整版在线观看| 午夜福利高清视频| 免费观看av网站的网址| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲无线观看免费| 久久久精品免费免费高清| 99热这里只有是精品50| 久久久久久久国产电影| 国产乱来视频区| 成年人午夜在线观看视频| 丰满少妇做爰视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 久久久久久久精品精品| 夫妻午夜视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| av国产免费在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产高潮美女av| 在线看a的网站| 高清午夜精品一区二区三区| 九草在线视频观看| 熟女av电影| 蜜桃在线观看..| av专区在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美人与善性xxx| 少妇熟女欧美另类| 成人特级av手机在线观看| 免费观看av网站的网址| 97在线人人人人妻| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 高清不卡的av网站| 国产精品偷伦视频观看了| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲国产色片| 色哟哟·www| 两个人的视频大全免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产在视频线精品| 午夜福利视频精品| 欧美精品国产亚洲| xxx大片免费视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲怡红院男人天堂| 婷婷色综合大香蕉| 久久99蜜桃精品久久| 国产永久视频网站| 国产黄色免费在线视频| 熟女电影av网| 男女免费视频国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产av精品麻豆| 黄色日韩在线| 国产精品久久久久久久电影| 男女免费视频国产| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产永久视频网站| 久久久久久九九精品二区国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲真实伦在线观看| 男女边摸边吃奶| 国产精品国产三级专区第一集| 久久精品人妻少妇| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| av播播在线观看一区| 只有这里有精品99| 日本av免费视频播放| 男女无遮挡免费网站观看| 国产淫片久久久久久久久| 成年女人在线观看亚洲视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产黄片美女视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品一区二区免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品日本国产第一区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲久久久国产精品| 国产深夜福利视频在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产男人的电影天堂91| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 又大又黄又爽视频免费| xxx大片免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久 成人 亚洲| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩 亚洲 欧美在线| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美 日韩 精品 国产| 新久久久久国产一级毛片| 国产深夜福利视频在线观看| 日本欧美视频一区| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲国产精品999| 在线精品无人区一区二区三 | 99九九线精品视频在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97超视频在线观看视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲av福利一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 91精品国产国语对白视频| 最近手机中文字幕大全| 国产精品熟女久久久久浪| 免费黄色在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 内地一区二区视频在线| 国产一区有黄有色的免费视频| av在线app专区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲在久久综合| 女人久久www免费人成看片| 九九在线视频观看精品| 午夜福利高清视频| 亚洲精品,欧美精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 男女下面进入的视频免费午夜| 97超视频在线观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 97在线视频观看| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品国产av成人精品| 国产人妻一区二区三区在| 久久亚洲国产成人精品v| 女人久久www免费人成看片| 久久久精品免费免费高清| 女人久久www免费人成看片| 最近中文字幕2019免费版| 国产有黄有色有爽视频| 国产永久视频网站| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女国产视频在线观看| 简卡轻食公司| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男人和女人高潮做爰伦理| 三级国产精品片| 99热这里只有精品一区| a级一级毛片免费在线观看| 三级经典国产精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费看光身美女| 欧美最新免费一区二区三区| 男女免费视频国产| 1000部很黄的大片| 黄片无遮挡物在线观看| 精品国产三级普通话版| 日韩中文字幕视频在线看片 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本黄色片子视频| 直男gayav资源| 午夜免费观看性视频| 久久av网站| 最近中文字幕2019免费版| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久久久伊人网av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲av免费高清在线观看| 成年免费大片在线观看| 99久久人妻综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲中文av在线| 交换朋友夫妻互换小说| 又大又黄又爽视频免费| 九色成人免费人妻av| 久久青草综合色| 在现免费观看毛片| 欧美日韩亚洲高清精品| h视频一区二区三区| 国产黄片美女视频| 国产爱豆传媒在线观看| 99热国产这里只有精品6| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久久精品精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 丝瓜视频免费看黄片| 蜜桃在线观看..| 高清午夜精品一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 国产真实伦视频高清在线观看| av.在线天堂| 三级经典国产精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 成人二区视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品第二区| 简卡轻食公司| 日韩亚洲欧美综合| 嫩草影院入口| 免费观看性生交大片5| 天堂8中文在线网| 多毛熟女@视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 99re6热这里在线精品视频| 国产色爽女视频免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 伦理电影大哥的女人| 久久精品人妻少妇| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久性生活片| 99久久精品一区二区三区| 插逼视频在线观看| 一区二区三区精品91| 欧美精品国产亚洲| 天天躁日日操中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费人成在线观看视频色| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲av成人精品一二三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 毛片女人毛片| videos熟女内射| 国产男女超爽视频在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品一区二区三区视频在线| 欧美成人午夜免费资源| 丰满人妻一区二区三区视频av| 精品久久久噜噜| 大陆偷拍与自拍| av国产免费在线观看| 丰满乱子伦码专区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 日本一二三区视频观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产av国产精品国产| 久久影院123| 多毛熟女@视频| 一级a做视频免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品午夜福利在线看| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品国产自在天天线| 日本wwww免费看| 日日撸夜夜添| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 美女国产视频在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产一区二区三区av在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 涩涩av久久男人的天堂| av线在线观看网站| 国产精品三级大全| 国产av国产精品国产| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 免费看光身美女| 亚洲美女黄色视频免费看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 另类亚洲欧美激情| 在线观看av片永久免费下载| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品一区二区在线不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产乱人偷精品视频| kizo精华| 永久免费av网站大全| 日韩中字成人| 麻豆国产97在线/欧美| 一级毛片我不卡| 99热6这里只有精品| 久久亚洲国产成人精品v| 色网站视频免费| 国产精品成人在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 老司机影院成人| 老熟女久久久| 人体艺术视频欧美日本| 在线观看一区二区三区| 多毛熟女@视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 夫妻午夜视频| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美丝袜亚洲另类| 少妇精品久久久久久久| 色综合色国产| 国产 一区精品| 有码 亚洲区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久人妻熟女aⅴ| 免费观看在线日韩| 各种免费的搞黄视频| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品一区二区三卡| 大陆偷拍与自拍| 日本wwww免费看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 青春草国产在线视频| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av日韩在线播放| www.色视频.com| 国精品久久久久久国模美| 成年免费大片在线观看| 久久久久国产网址| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美另类一区| 午夜福利影视在线免费观看| 老女人水多毛片| 最近中文字幕2019免费版| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一本久久精品| 免费看日本二区| 人妻一区二区av| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久精品性色| 欧美97在线视频| 免费高清在线观看视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色怎么调成土黄色| 婷婷色av中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 一区二区av电影网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日日啪夜夜爽| 波野结衣二区三区在线| 久久久成人免费电影| 亚洲国产色片| 国产免费又黄又爽又色| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一区二区三区视频在线| 新久久久久国产一级毛片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av男天堂| 国产成人aa在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 六月丁香七月| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产男女内射视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 老女人水多毛片| 久久女婷五月综合色啪小说| av免费观看日本| 亚洲成人手机| 国产淫语在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜激情久久久久久久| 亚洲av综合色区一区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲成人中文字幕在线播放| 伦理电影免费视频| 成人二区视频| 99re6热这里在线精品视频| 天堂8中文在线网| 嫩草影院新地址| 午夜老司机福利剧场| 一级黄片播放器| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 伦理电影大哥的女人| 亚洲欧美精品专区久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线免费十八禁| 免费少妇av软件| 身体一侧抽搐| 国产男人的电影天堂91| 亚洲四区av| 成人一区二区视频在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品成人在线| 亚洲色图综合在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 黄色一级大片看看| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产精品国产精品| 在线观看免费日韩欧美大片 | 午夜福利高清视频| 欧美成人a在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 高清视频免费观看一区二区| 精品一区二区免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲成色77777| 国产精品国产三级专区第一集| 成人无遮挡网站| 精品久久久噜噜| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久av网站| 免费观看a级毛片全部| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品不卡视频一区二区| 精品一区二区免费观看| 五月天丁香电影| 免费看光身美女| 舔av片在线| 在线观看人妻少妇| 又大又黄又爽视频免费| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 九色成人免费人妻av| 免费看日本二区| 99re6热这里在线精品视频| 色哟哟·www| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 色视频在线一区二区三区| 亚洲不卡免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲精品自拍成人| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品人妻久久久久久| 最新中文字幕久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 男女免费视频国产| 国产极品天堂在线| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产极品天堂在线| 国产中年淑女户外野战色| 人体艺术视频欧美日本| 性色avwww在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久久精品94久久精品| 一个人免费看片子| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av综合色区一区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久国产精品大桥未久av | 国产精品蜜桃在线观看| 99热国产这里只有精品6| 亚洲人成网站高清观看| 午夜激情久久久久久久| 99国产精品免费福利视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜福利影视在线免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美3d第一页| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产色片| 国产黄色免费在线视频| 超碰97精品在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 丰满乱子伦码专区| 亚洲无线观看免费| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲av综合色区一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品国产av在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲自偷自拍三级| 99国产精品免费福利视频| 高清不卡的av网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品国产三级专区第一集| 水蜜桃什么品种好| 成人国产麻豆网| 少妇熟女欧美另类| 观看av在线不卡| 黄色欧美视频在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 内射极品少妇av片p| 国产高清有码在线观看视频| 久久av网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日韩综合久久久久久| 好男人视频免费观看在线| 我的老师免费观看完整版| 久热久热在线精品观看| 观看av在线不卡| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久视频综合| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲国产精品一区三区| 全区人妻精品视频| a级毛色黄片| 五月伊人婷婷丁香| 精品视频人人做人人爽| 免费观看无遮挡的男女| 人体艺术视频欧美日本| 色视频www国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一区二区三区四区激情视频| 全区人妻精品视频| 超碰97精品在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| h视频一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品456在线播放app| 少妇丰满av| 久热这里只有精品99| 大片免费播放器 马上看| 免费看光身美女| 欧美成人a在线观看| 国产成人精品久久久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品国产成人久久av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 丝袜脚勾引网站| 街头女战士在线观看网站| 亚洲第一av免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美三级亚洲精品| 欧美 日韩 精品 国产| 日本vs欧美在线观看视频 | 身体一侧抽搐| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 波野结衣二区三区在线| 韩国av在线不卡| 国产 一区精品| 久久婷婷青草| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品一区二区性色av| 99热这里只有精品一区| 久久久久视频综合| 黄色一级大片看看| 欧美成人a在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产 一区 欧美 日韩| 丰满乱子伦码专区| 全区人妻精品视频| 熟女人妻精品中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看| 永久网站在线| 日韩一区二区三区影片| 美女主播在线视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99久久精品热视频| 成人一区二区视频在线观看| 美女主播在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品一区在线观看国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲性久久影院| 一二三四中文在线观看免费高清| 制服丝袜香蕉在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本av免费视频播放| 直男gayav资源| 亚洲伊人久久精品综合| 国产伦精品一区二区三区四那|