抗恩拉霉素多克隆抗體的制備

葉健強，康潤敏，余 華

（1.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；3.四川出入境檢驗檢疫局，成都 610041）

恩拉霉素（Enramycin，Er）又名恩霉素、安來霉素和持久霉素［1，2］，其主要成分是恩拉霉素A（C107H138N26O31C12R=CH3）和恩拉霉素B（C108H140N26O31C12R=C2H5OH），其結(jié)構(gòu)式見圖1。該藥因具有很強的抗格蘭氏陽性菌的作用，用作飼料添加劑能促進(jìn)畜禽生長和提高飼料效率，與其他抗生素亦無交叉耐藥，化學(xué)性能穩(wěn)定，無致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，殘留極少，適口性好。中國于1988年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)口獸用恩拉霉素抗生素，但隨著國內(nèi)外養(yǎng)殖量的日益增加，飼養(yǎng)者為了追求產(chǎn)量，往往超量應(yīng)用獸藥、抗生素添加劑，造成動物性產(chǎn)品中有害化學(xué)殘留物質(zhì)日趨嚴(yán)重，這不僅加大了動物產(chǎn)品威脅人類健康的風(fēng)險，也直接重創(chuàng)了中國動物產(chǎn)品出口貿(mào)易。因此，進(jìn)出口動物性食品中該藥物的殘留問題備受關(guān)注，這就使建立恩拉霉素殘留的快速測定方法并應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品的安全控制具有重要性和必要性。

圖1 恩拉霉素（含A 和B）結(jié)構(gòu)式

酶免疫測（EIA）中酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）因較傳統(tǒng)的微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于獸藥殘留的檢測中，但國內(nèi)外鮮有有關(guān)恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)報道［3-6］，檢索到日本厚生省對畜、水產(chǎn)食品中有該項殘留的常規(guī)檢測技術(shù)報道［7］。為此，本試驗旨在制備一種特異性的恩拉霉素多克隆抗體，為間接競爭性ELISA 快速檢測恩拉霉素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試驗動物

1.1.1 試驗材料 恩拉霉素［純度≥98% ，由國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2008IK013）課題組提純］。戊二醛（成都金山化學(xué)試劑公司）、1，4-二氧六環(huán)（成都科龍化工試劑廠）、Na2HPO4·2H2O（天津博迪化工公司）、乙二胺四乙酸二鈉（天津華興精細(xì)化工公司）、NaH2PO4和碳酸鈉（成都長聊化工試劑有限公司）、牛血清白蛋白（BSA，MW67000，上海博奧生物科技公司）、卵清蛋白（OVA，MW45000，上?；巧锟萍脊荆⒏ナ贤耆魟‵CA）和弗氏不完全佐劑（FICA）（美國Sigma 公司）、透析袋（截留分子量14 000，美國Sigma公司），以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 試劑的配制與用品準(zhǔn)備 取0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液72.0 mL、0.2 mol/L 磷酸二氫鈉28.0 mL 于250 mL 三角瓶中，配成pH 7.2 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。用移液管吸取0.25 mL 戊二醛，將其配成100 mL 溶液，得0.25%的戊二醛溶液。

透析袋處理液，配制含碳酸鈉10 g/L 及乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）1 mol/L 的堿性EDTA 溶液；1%瓊脂糖配制，取15 g 瓊脂糖加100 mL pH 7.1 磷酸鹽緩沖液內(nèi)，置水浴充分溶解，加入1 mL 1% 硫柳汞，待冷至45～50 ℃時，滴加到潔凈載玻片上，待凝固放入帶蓋的瓷盤中備用。用孔徑3.0 mm 打孔器在瓊脂載玻片上下平行打孔，孔距2.5 mm。

1.1.3 主要儀器 UV2501-PC 型紫外掃描儀（日本島津Shimadzu 公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek ELX800 型）、各種規(guī)格移液槍（Eppendorf）、BS100S 型分析天平（北京賽多利斯公司）、DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器公司）、高速冷凍離心機(jī)（HITACHI SCR20BC）、Freeze 6 型冷凍干燥機(jī)（Labconco 公司）、漩渦振蕩儀、恒溫水浴鍋、ULT1386-3-V38 型低溫冰箱（美國REVCO 公司）、DCD-172K 型常規(guī)冰箱（美國伊萊克斯公司）等。

1.1.4 試驗動物 健康雄性2 月齡試驗用清潔級新西蘭大白兔50 只，體重為2.0～2.5 kg/只，3 種偶聯(lián)率的人工抗原Er-BSA（7#、4#、6#），每種抗原分別采用3 種免疫程序進(jìn)行免疫，將50 只試驗兔隨機(jī)分為9 組，每組5 只試驗兔，陰性對照5 只。飼養(yǎng)管理，所用兔子分籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫抗原的制備 采用戊二醛法，將Er 與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)為復(fù)合物，再加入弗氏完全佐劑制成抗原乳劑。分別稱取20 mg Er 盛于100 mL錐形瓶中和20 mg BSA 置于5 號試管中，并向試管中加入配好的PBS 溶液約3 mL，待BSA 完全溶解后轉(zhuǎn)移到有Er 的錐形瓶中，再用PBS 洗滌試管且將BSA完全移入錐形瓶。待Er 溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10 mL，混勻。將磁力攪拌子放入反應(yīng)器后把錐形瓶放在一個含少量水的大燒杯中，再將燒杯置于25 ℃水浴，開啟攪拌器，約5 min 后，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，向反應(yīng)器內(nèi)逐滴加0.25%戊二醛溶液5 mL，滴加完畢后仍保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，反應(yīng)4 h 以上；然后將反應(yīng)液裝入透析袋中用堿性透析液（碳酸鈉10 g/L，EDTA 1 mol/L）透析72 h，每4 h 換液一次，透析后離心，上清液冷凍干燥，4 ℃保存?？乖透ナ贤耆魟┗虿煌耆魟┮?∶1 的比例乳化。

1.2.2 包被抗原的合成 反應(yīng)過程同“1.2.1”方法，只需將BSA 換成OVA 即可。

1.2.3 免疫方案確定 本試驗設(shè)計了3 種免疫程序的試驗組進(jìn)行免疫試驗，具體免疫技術(shù)方案如表1所示。

表1 試驗動物免疫技術(shù)方案

首先取1 mg/mL（以載體蛋白含量計算）人工抗原解凍，在無菌狀態(tài)下以適量生理鹽水稀釋后，滴加到等體積的佐劑（FCA 或FICA）中，混合乳化后成油包水（W/O）狀態(tài)用滅菌水使免疫的最終濃度為1 mg/mL，據(jù)表1 技術(shù)方案各組分別進(jìn)行相關(guān)程序執(zhí)行。免疫前和3 免疫后開始每次免疫后一周采耳緣靜脈血1 mL，4 ℃放置4 h 后3 000 r/min 離心10 min取血清，將血清與甘油（1∶1）等體積混和，保存于-20 ℃冰箱，用于試血。各組于尾免后7 d 采用心臟直接采血法采血，20～30 mL/只；按“1.2.1”方法分離血清，分裝和保存。

1.2.4 抗體效價的初步測定 血清效價的初步檢測采用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測定，具體設(shè)計方法為，上排孔加入抗原Er-BSA 或Er-OVA，下方孔依次是2、4、8、16、32 倍稀釋的抗Er-BSA 血清和陰性血清。判定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)37 ℃保溫24 h 后觀察抗體與抗原孔之間有無沉淀線產(chǎn)生，若有，則可判為陽性，同時借以判定是否有特異性的抗體產(chǎn)生以及抗血清的效價，當(dāng)效價在1∶16 以上即可決定放血。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的紫外光譜鑒定

采用UV2501-PC 型紫外掃描儀對Er、BSA、OVA 和2 種制備抗原進(jìn)行紫外全波段掃描，波長范圍在200～400 nm［8-11］。結(jié)果表明，Er 標(biāo)準(zhǔn)品紫外最大吸收波長為279 nm，BSA 紫外最大吸收波長為278 nm。當(dāng)Er 與BSA 偶聯(lián)形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至Er 和BSA 特征峰之間，提示本次合成得到Er與BSA偶聯(lián)的免疫抗原Er-BSA（圖2）。而Er 和OVA 偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外全波段掃描曲線比反應(yīng)物OVA 峰形緩，278 nm 的最大吸收峰稍向左移，形狀更接近于Er，初步說明偶聯(lián)成功（圖3）。此外，此次所得Er-OVA 產(chǎn)物曲線比之前的Er-BSA 曲線稍有波動，可能與反應(yīng)物純度有關(guān)。BSA 的純度達(dá)98%，而OVA 純度不到90%。其抗原偶聯(lián)比、免疫抗原Er-BSA 和包被抗原的偶聯(lián)比均為26∶1。

圖2 免疫抗原與BSA、Er 紫外全掃描

圖3 包被抗原與OVA、Er 紫外全掃描

2.2 瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測定抗血清效價

用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測定抗血清效價，上排孔為Er-BSA 免疫抗原時，其測定結(jié)果見表2。由表2 可知，4 免后B 組（加強免疫組）兔抗血清的效價最高，其中B 組7#抗原免疫家兔后獲得的兔抗血清最高效價達(dá)16；A 組（常規(guī)組）效價中等，最高可達(dá)8；C 組抗血清效價最低，為2，應(yīng)予以淘汰。

表2 瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測定抗血清效價結(jié)果

4 免后，上排孔為Er-OVA 和Er-BSA 兩種抗原時，兔抗血清沉淀線都可見，如圖4 所示，由此說明，本試驗中，加強組免疫程序的免疫效果較好，且能產(chǎn)生較高效價特異性強的抗體。

圖4 瓊擴(kuò)法測定抗血清效價情況

3 討論

Er 是一種僅具反應(yīng)原性而不具免疫原性（抗原刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生抗體的性質(zhì)）的小分子半抗原，其結(jié)構(gòu)中氨基和酚基均可作為偶聯(lián)基團(tuán)，但酚基偶聯(lián)的效果不佳，故選用氨基為偶聯(lián)基團(tuán)，而將其與載體蛋白相連接的方法主要是重氮化法和戊二醛法。但用重氮化法合成全抗原，一般通過紫外掃描顯示偶聯(lián)物與載體蛋白的吸收峰完全重疊，故放棄此法［12-14］。戊二醛是常用的帶有2個活性基團(tuán)的雙功能連接劑，借助其兩端的醛基將載體和半抗原的氨基通過共價鍵連接在一起。本試驗以戊二醛為偶聯(lián)劑，將載體蛋白氨基與半抗原Er分子中D-Orn4 和Cit-9 上的氨基偶聯(lián)，整個偶聯(lián)反應(yīng)在PBS 和二氧六環(huán)反應(yīng)條件下進(jìn)行，其中PBS 可穩(wěn)定反應(yīng)的pH，并為反應(yīng)提供水溶液環(huán)境，二氧六環(huán)既可調(diào)整反應(yīng)環(huán)境的極性條件，又能促進(jìn)醛基的反應(yīng)，最終獲得全抗原Er-BSA 和Er-OVA，且通過紫外光掃描表明偶聯(lián)成功［15，16］。

本試驗中采用2 月齡2.0～2.5 kg 大白兔為免疫對象，主要是適宜的年齡和體重可減少免疫耐受率，同時增強免疫應(yīng)答效果，以保證產(chǎn)生合格抗體。此外，免疫時采用皮內(nèi)免疫方式，不僅能減少免疫劑量，而且更適合于如Er 類人工合成成本高、量少等微量抗原的使用；同時，該方式可替代靜脈加強法，不僅減少工作量、降低成本，而且可減少過敏反應(yīng)的致死率。

在測定抗血清效價時，A 組和C 組分別在4 免和5 免后，經(jīng)檢測其抗血清的效價較低，而B 組4 免后獲得的抗血清已經(jīng)符合試驗要求，由于本試驗合成的抗原數(shù)量有限、成本過高等局限，因此僅選擇B 組而放棄其他免疫程序的試驗組，進(jìn)而沒有進(jìn)一步免疫其他試驗組的試驗動物。在抗血清特異性方面，因為用Er-BSA 免疫動物產(chǎn)生的抗體有抗Er 和抗BSA 抗體，結(jié)果顯示，當(dāng)Er-BSA 為上排孔抗原時出現(xiàn)陽性，但這并不能證明抗Er 抗體的產(chǎn)生，因此用Er-OVA 抗原進(jìn)行驗證，仍可見有明顯沉淀線，表明BSA與Er-BSA、Er-OVA 及OVA均不發(fā)生交叉反應(yīng)。