食管鱗狀細胞癌組織中SNAI2和FSCN1蛋白表達情況對其預(yù)后生存的影響

胡秋平，劉紅艷，劉春艷，譚明

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤診療中心，湖北恩施 445000

食管癌（EC）是最具侵襲性的消化道惡性腫瘤之一，食管鱗狀細胞癌（ESCC）及食管腺癌（EAC）是EC主要的組織學(xué)形式，這兩種組織學(xué)亞型在病因和地理發(fā)病率上有所不同，其中EAC 在西方人群中較為常見，ESCC 在東亞群體中更為常見［1-2］。ESCC 發(fā)展迅速且對化療不敏感，導(dǎo)致ESCC 在臨床中預(yù)后較差，晚期ESCC 患者5 年生存率較低［3-4］。因此，尋找與ESCC 及其預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物對提高ESCC 患者生存率具有重要意義。SNAIL 超家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子2（SNAI2）是一種C2H2 鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬于SNAIL蛋白家族成員，與腫瘤起始細胞、細胞周期以及細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。研究發(fā)現(xiàn)，SNAI2 在多種惡性腫瘤中表達升高，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險及患者生存期相關(guān)［6］。肌動蛋白結(jié)合蛋白1（FSCN1）屬于肌動蛋白細胞骨架蛋白家族，在細胞遷移、黏附和細胞間相互作用中起著關(guān)鍵作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1 高表達與舌鱗細胞癌患者不良預(yù)后有關(guān)，F(xiàn)SCN1 可能是舌鱗細胞癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點［8］。但是，SNAI2、FSCN1在ESCC組織中的表達情況以及二者與ESCC 預(yù)后之間的關(guān)系目前尚未有報道。因此，本研究通過觀察SNAI2、FSCN1 蛋白在ESCC 組織中的表達情況，分析SNAI2、FSCN1與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系，以期為ESCC預(yù)后評估提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（20110309），選取2012 年1 月—2017 年1 月本院診治的ESCC 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合ESCC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②初診且無治療史；③生存時間超過3個月；④歐洲肌力功能評定量表評級為0～2 級；⑤臨床資料完整；⑥簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝腎功能障礙；②有其他器官腫瘤病史；③有嚴(yán)重心臟疾病及認知功能損傷；④伴有感染性疾??；⑤無法配合隨訪。共收集符合以上標(biāo)準(zhǔn)的ESCC 患者120 例，其中男89 例、女31 例，年齡（61.02 ± 8.29）歲，腫瘤直徑＜5 cm 53 例、≥5 cm 67例，分化程度高分化72例、中低分化48 例，腫瘤位置頸段29 例、胸上段48 例、胸中下段43 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78 例、未轉(zhuǎn)移42 例，TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期50例、Ⅲ～Ⅳ期70例。

1.2 ESCC 及癌旁組織SNAI2、FSCN1 檢測方法采用免疫組織化學(xué)法。取ESCC 患者腫瘤組織及癌旁組織制作4 μm石蠟標(biāo)本切片，脫蠟后在乙二胺四乙酸中煮沸20 min 進行抗原修復(fù)，避光條件下3%過氧化物酶封閉10 min。將切片與10%山羊血清孵育30 min 以阻斷非特異性染色，然后與一抗SNAI2、FSCN1抗體（美國Sigma公司）在室溫下孵育60 min。室溫下與相應(yīng)二抗一起孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色并用蘇木精復(fù)染，封片后置于顯微鏡下進行觀察。由兩位獨立的病理實驗工作者參照相關(guān)文獻［10］對結(jié)果進行評估。基于陽性細胞比例和細胞染色強度的總和評價SNAI2、FSCN1 表達情況：×400 鏡下選取5 個視野，每個視野數(shù)200 個細胞，以棕黃色或棕色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)。陽性細胞比例評分為0（無陽性細胞）、1（陽性細胞比例≤5%）、2（陽性細胞比例5%～≤25%）、3（陽性細胞比例25%～≤50%）分、4（陽性細胞比例＞50%），細胞染色強度評分為1（淡黃色）、2（黃棕色）、3（棕褐色）分。將陽性細胞比例評分+染色強度評分＞3分判定為SNAI2、FSCN1表達陽性、≤3分判定為SNAI2、FSCN1表達陰性。

1.3 ESCC 患者治療及預(yù)后隨訪方法 根據(jù)患者ESCC 分期不同，對患者進行相應(yīng)治療，其中Ⅰ期以外科手術(shù)治療為主；Ⅱ、Ⅲ期患者先行放射治療和化療，后再行外科手術(shù)治療；Ⅳ期患者以放射治療和化療為主。通過電話訪問、門診復(fù)查等方式對所有出院患者進行5年隨訪，統(tǒng)計患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的資料以-x±s表示，組間比較行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗；采用Kaplan-Meier生存曲線分析SNAI2、FSCN1表達與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系，COX回歸分析ESCC患者預(yù)后的影響因素，取單因素COX回歸分析中P＜0.05的指標(biāo)納入多因素COX回歸，分析NSCLC患者預(yù)后的獨立影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 及癌旁組織SNAI2、FSCN1 表達比較ESCC 組織中SNAI2 表達陽性76 例（63.33%）、FSCN1表達陽性84例（70.00%）；癌旁組織中SNAI2表達陽性47 例（39.17%）、FSCN1 表達陽性55 例（45.83%）；ESCC 組織SNAI2、FSCN1 表達陽性率均高于癌旁組織（P均＜0.01）。

2.2 SNAI2、FSCN1 表達陽性與陰性ESCC 患者預(yù)后比較 120 例ESCC 患者5 年隨訪中生存87 例、死亡33 例，5 年總生存率為72.50%。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，SNAI2 表達陽性、陰性ESCC 患者5 年生存率分別為63.16%、88.64%，F(xiàn)SCN1 表達陽性、陰性ESCC 患者5 年生存率分別為65.48%、88.89%；SNAI2、FSCN1 表達陽性ESCC 患者5 年生存率低于SNAI2、FSCN1 表達陰性患者（P均＜0.05）。見OSID碼圖1、2。

2.3 ESCC 患者SNAI2、FSCN1 表達與預(yù)后的關(guān)系 以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、SNAI2（陰性=0，陽性=1）、FSCN1（陰性=0，陽性=1）為自變量，以ESCC 患者預(yù)后（生存=0，死亡=1）為因變量納入COX 回歸分析。單因素COX 回歸分析顯示，分化程度、TNM 分期、SNAI2、FSCN1 是ESCC 患者預(yù)后的影響因素；多因素COX 回歸分析顯示，TNM 分期、SNAI2、FSCN1 是ESCC 患者預(yù)后的獨立影響因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 影響ESCC患者預(yù)后的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

ESCC是進展期食管癌最常見的組織學(xué)類型，發(fā)病率及病死率較高［2］。目前，根治性手術(shù)是治療早期ESCC 最有效的策略，也是ESCC 患者長期生存的最佳選擇，而晚期ESCC 患者通常需要術(shù)前和圍手術(shù)期放化療的組合治療［11］。由于ESCC 的高增殖和侵襲能力，大多數(shù)患者在首次診斷時已經(jīng)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移或進展到晚期，預(yù)后較差［12］。因此，需要尋找新的生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床對患者的預(yù)后進行早期測，以改善ESCC患者的臨床預(yù)后。

上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮腫瘤細胞失去極性和細胞間黏附，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞表型的過程，其過程與各種惡性腫瘤的細胞干細胞性有關(guān)［13］。PASTUSHENKO 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，混合EMT 狀態(tài)的人ESCC細胞表現(xiàn)出腫瘤干細胞性增加和自發(fā)轉(zhuǎn)移，可促進ESCC 的發(fā)生發(fā)展。SNAI2 是一種關(guān)鍵的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［13］。研究表明，SNAI2 在卵巢癌細胞中表達上調(diào)，且SNAI2 可通過抑制卵巢癌細胞中的miR-222-3p 轉(zhuǎn)錄和上調(diào)PDCD10 誘導(dǎo)EMT［15］。本研究結(jié)果顯示，ESCC患者腫瘤組織中SNAI2表達高于癌旁組織，提示SNAI2可能作為致癌基因參與ESCC的發(fā)生發(fā)展。WANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，SNAI2 可上調(diào)FSCN1，促進頭頸部鱗狀細胞癌的EMT 進程。CAI等［17］發(fā)現(xiàn)，ESCC 患者中FSCN1 表達上調(diào)，且FSCN1可通過其RNA 結(jié)合蛋白作用下調(diào)PTK6，從而促進食管癌的進展。本研究結(jié)果表明，ESCC患者腫瘤組織中FSCN1 的表達高于癌旁組織，提示FSCN1 可能也作為致癌基因發(fā)揮其作用。

LI 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 細胞中SNAI2 表達升高，且與ESCC 患者不良預(yù)后有關(guān)。LIANG 等［19］研究表明， FSCN1 的過表達與腎上腺皮質(zhì)癌的不良預(yù)后有關(guān)，是影響腎上腺皮質(zhì)癌患者預(yù)后的獨立危險因素。本研究中Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示，SNAI2、FSCN1表達陽性患者5年總生存率低于陰性表達患者；COX 回歸分析表明，SNAI2、FSCN1 陽性表達及高TNM 分期是影響ESCC 患者預(yù)后的獨立危險因素，提示SNAI2、FSCN1參與ESCC 的發(fā)生發(fā)展，SNAI2、FSCN1 表達陽性與ESCC 患者的不良預(yù)后有關(guān)，可能作為ESCC 患者預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)。我們推測SNAI2、FSCN1影響ESCC 患者預(yù)后的相關(guān)機制可能與EMT 有關(guān)，SNAI2、FSCN1 的陽性表達促進ESCC 細胞黏附及侵襲，從而加重患者病情，導(dǎo)致預(yù)后不良［13，16］。

綜上所述，SNAI2、FSCN1 在ESCC 組織中高表達，SNAI2、FSCN1 高表達與ESCC 患者不良預(yù)后有關(guān)，是影響ESCC患者預(yù)后的獨立危險因素，對ESCC患者的預(yù)后具有一定預(yù)測價值。然而本研究僅將ESCC組織作為研究樣本，未能選取血清等其他樣本檢測驗證，今后將進一步深入研究。