當(dāng)歸多糖改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的體內(nèi)外觀(guān)察及其機(jī)制探討

葉建華，沈盛暉，張?zhí)锝?，馮頻頻

1 浙江省立同德醫(yī)院心血管科，杭州 310012；2 浙江省立同德醫(yī)院藥劑科

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是指心肌在缺血情況下受到損傷，再灌注后心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和電生理特征被破壞，導(dǎo)致組織損傷加重。MIRI 能夠降低細(xì)胞活力，造成不可逆損傷［1］，表現(xiàn)為肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）升高，血壓突然下降，缺血再灌注心律失常等［2］。MIRI 的發(fā)病機(jī)制主要包括內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線(xiàn)粒體損傷、氧化應(yīng)激等，并且各種機(jī)制的信號(hào)通路可能存在相互作用［3］，其中炎癥反應(yīng)是MIRI 的主要病因［4］。toll 樣受體4（TLR4）能夠通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB（NFκB）信號(hào)通路激活機(jī)體炎癥和免疫系統(tǒng)［5］，當(dāng)機(jī)體受到各種生理或病理刺激時(shí)，活化的TLR4 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，激活NF-κB 進(jìn)入與靶序列結(jié)合的細(xì)胞核，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β 的表達(dá)，加重心肌組織損傷［6］。細(xì)胞凋亡是MIRI 另一重要病因，缺血時(shí)抗凋亡基因B 淋巴細(xì)泡瘤2（Bcl-2）和促凋亡基因Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bax）的平衡穩(wěn)態(tài)被破壞，共同參與凋亡基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡蛋白酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡［7-8］。當(dāng)歸多糖（ASP）是當(dāng)歸的水溶性活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用，被發(fā)現(xiàn)能夠減輕大腦缺血再灌注損傷［9］。然而，ASP 在MIRI 中的作用仍不確定。2022 年10 月—2023 年2 月，本研究觀(guān)察了ASP 對(duì)MIRI 大鼠及體外心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（H/R）模型的影響，并探討ASP 對(duì)免疫炎癥及細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路TLR4/NF-κB 的調(diào)控作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，研究方案經(jīng)浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心機(jī)構(gòu)動(dòng)物照顧與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（ZJCLAIACUC-20030043），所有程序均遵循國(guó)際指南2.0［10］。ASP 購(gòu)自浙江省立同德醫(yī)院，CK-MB、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-αELISA 試劑盒購(gòu)自中國(guó)Boster，miRNA 熒光定量PCR 試劑盒及miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒均購(gòu)自上海生工，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白TLR4、磷酸化核蛋白（p-p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 ASP改善大鼠MIRI的體內(nèi)觀(guān)察

1.2.1 大鼠MIRI 模型建立及分組處理 將成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MIRI組、ASP低劑量組、ASP 高劑量組，每組15 只。除假手術(shù)組外，均采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎30 min，再灌注120 min的方法建立MIRI 模型。ASP 低、高劑量組在建模后分別給予50、100 mg/kg的ASP 灌胃，每天1次，假手術(shù)組及MIRI組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

1.2.2 大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA 法。取建模4 周后各組大鼠，腹主動(dòng)脈插管后取血離心得到血清，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH 及血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 大鼠心肌組織凋亡及TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。提取各組大鼠心肌組織，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，用10% SDSPAGE 凝膠分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至膜上。用5%牛血清白蛋白封閉1 h，分別加入Bax、Bcl-2、TLR4、p-p65、cleaved Caspase-3、p-IκBα、β-actin 一抗，置于4 ℃冰箱中封閉過(guò)夜。次日，用PBST 溶液洗膜，而后加入相應(yīng)二抗，室溫避光條件下孵育35 min。以PBST洗膜后，將NC膜放入掃膜儀中獲取圖像，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 ASP改善大鼠MIRI的體外觀(guān)察

1.3.1 大鼠心肌細(xì)胞分組與H/R模型建立 SD大鼠稱(chēng)重，腹腔注射肝素（5 U/g），20 min 后腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。迅速開(kāi)胸取出心臟，將主動(dòng)脈根部懸掛于Langendorff 裝置，調(diào)節(jié)灌流液流速至3 mL/min，用臺(tái)式液灌流3 min，換酶液灌流消化25 min。待心臟軟化后，剪下心臟部分，于酶液中剪碎，鈍口玻璃吸管輕輕吹打，經(jīng)細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，除去較大的組織塊，離心棄上清。將細(xì)胞梯度復(fù)鈣，細(xì)胞預(yù)貼壁1 h 后，更換培養(yǎng)基于敷箱中培養(yǎng)，24 h 后更換新的培養(yǎng)基。將大鼠心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、H/R 組、H/R+ASP 低劑量組、H/R+ASP 高劑量組，對(duì)照組正常培養(yǎng)不做處理，其他3 組均建立H/R 模型。建模方法：將心肌細(xì)胞置換到細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨后置入5% CO2，95%氮?dú)馀囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h 造成心肌細(xì)胞缺氧。用含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置換原細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h造成心肌細(xì)胞復(fù)氧。

1.3.2 大鼠心肌細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT 比色法。在96 孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底，H/R+ASP低劑量組加入濃度為5 μg/mL 的ASP，H/R+ASP 高劑量組加入濃度為10 μg/mL 的ASP，H/R 組不做處理正常培養(yǎng)，繼續(xù)5% CO2、37 ℃孵育24 h，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后結(jié)晶充分形成后去掉上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用分光光度法在570 nm處測(cè)定吸光度（A）值，以此代表細(xì)胞活性。

1.3.3 大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中心肌細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α，方法同“1.2.2”。

1.3.4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及TLR4/NFκB 通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取各組培養(yǎng)上清液，Western blotting 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 及TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα，方法同“1.2.3”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料正態(tài)性分析采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASP改善大鼠MIRI的體內(nèi)觀(guān)察結(jié)果

2.1.1 各組血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較 血清心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、CK-MB水平MIRI組＞ASP低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組血清LDH、CK-MB水平比較（U/L，-x ± s）

2.1.2 各組血清炎癥因子水平比較 血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.1.3 各組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 表達(dá)比較 心肌組織Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP 高劑量組＞假手術(shù)組，心肌組織Bcl-2 蛋白表達(dá)假手術(shù)組＞ASP 高劑量組＞ASP 低劑量組＞MIRI 組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.1.4 各組心肌組織TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 心肌組織TLR4/NF-κB 通路相關(guān)蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα 表達(dá)MIRI 組＞ASP 低劑量組＞ASP高劑量組＞假手術(shù)組（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組心肌組織TLR4、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.2 ASP改善大鼠MIRI的體外觀(guān)察結(jié)果

2.2.1 各組心肌細(xì)胞活性比較 對(duì)照組、H/R 組、H/R+ASP 低劑量組、H/R+ASP 高劑量組心肌細(xì)胞活性分別為99.87% ± 1.80%、61.45% ± 1.34%、71.33% ± 1.92%、82.96% ± 2.57%，心肌細(xì)胞活性對(duì)照組＞H/R+ASP 高劑量組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R組（P均＜0.05）。

2.2.2 各組心肌細(xì)胞炎癥因子水平比較 心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平H/R組＞H/R+ASP低劑量組＞H/R+ASP高劑量組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（pg/mL，-x ± s）

2.2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)比較 心肌細(xì)胞Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)H/R 組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R+ASP 高劑量組＞對(duì)照組，心肌細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)對(duì)照組＞H/R+ASP 高劑量組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R組（P均＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 各組心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.2.4 各組心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白TLR4、p-p65、p-IκBα 表達(dá)H/R 組＞H/R+ASP 低劑量組＞H/R+ASP高劑量組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)表7。

表7 各組心肌細(xì)胞TLR4、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

3 討論

MIRI 是一種心肌組織缺血缺氧后恢復(fù)供氧供血導(dǎo)致心肌組織呈進(jìn)行性加重的病理進(jìn)程，其發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體形態(tài)功能障礙等有關(guān)，但是其具體機(jī)制尚不明了。中醫(yī)藥在治療MIRI方面具有藥理作用廣，毒性低等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。多糖尤其是中藥多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，而且?guī)缀鯖](méi)有毒性，因此近年來(lái)在MIRI 相關(guān)研究中備受關(guān)注。當(dāng)歸是一種重要的中藥材，其主要功能為補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)止痛；兼有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本及活血化瘀之功效，為中醫(yī)內(nèi)、外、婦、兒各科常用的主藥。對(duì)當(dāng)歸多糖的生物活性研究表明，當(dāng)歸多糖具有抗補(bǔ)體、增強(qiáng)造血功能、免疫調(diào)節(jié)、抑制肝損傷及促進(jìn)潰瘍愈合的作用。基于此，本研究使用傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸中提取的水溶性多糖ASP 干預(yù)MIRI 模型大鼠及體外心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（H/R）模型，觀(guān)察其對(duì)體內(nèi)外模型的影響并探討ASP 對(duì)免疫炎癥、細(xì)胞凋亡及TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的干預(yù)作用，以期為MIRI 的防治提供新的方向。

心肌細(xì)胞受損后再灌注時(shí)，處于缺氧復(fù)氧狀態(tài)，線(xiàn)粒體、細(xì)胞膜遭到損傷，細(xì)胞膜通透性異常增加，引起細(xì)胞膜破壞以及心肌標(biāo)志物外漏［11］。CK-MB為心肌壞死的重要標(biāo)志物，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，血清CK-MB水平升高，CK-MB水平可作為診斷心肌壞死的金標(biāo)準(zhǔn)［12］。LDH 廣泛存在于心肌組織中，是評(píng)價(jià)心肌疾病發(fā)生發(fā)展的常用指標(biāo)。本研究的體內(nèi)觀(guān)察結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MIRI 組CK-MB、LDH水平升高，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β亦升高，提示MIRI 引起嚴(yán)重心肌損害并伴有大量炎癥因子產(chǎn)生。而經(jīng)ASP 處理后MIRI 大鼠CK-MB、LDH 降低，同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 下降，且高劑量ASP 組下降更明顯，提示ASP 能夠通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)并改善心肌缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴(lài)性。

NF-κB 通路是調(diào)節(jié)MIRI 炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄和生物合成的重要信號(hào)通路，在MIRI的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生理過(guò)程［13］。TLR4 是toll 樣受體家族的一員，可觸發(fā)NF-κB 的活性，從而啟動(dòng)炎癥因子的合成。作為NF-κB 不可缺少的上游調(diào)控分子，IκB 與NF-κB p65結(jié)合，使該通路失活。IκB 激酶復(fù)合物激活I(lǐng)κB，誘導(dǎo)p65 中IκB 的降解和解離；而IκBα 是IκB 的關(guān)鍵調(diào)控分子［14］。有研究顯示，NF-κB作為下游轉(zhuǎn)錄因子可在脂多糖刺激下被激活，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生［15］。韓運(yùn)祺等［16］研究發(fā)現(xiàn)，治療MIRI的核心靶點(diǎn)主要通過(guò)TLR、AGE-RAGE、MAPK 等相關(guān)通路發(fā)揮作用。劉啟祥等［17］研究表明，丁香酚可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。本研究通過(guò)體外大鼠心肌細(xì)胞H/R模型亦發(fā)現(xiàn)，ASP處理后的大鼠心肌細(xì)胞活性增加，炎癥因子分泌減少，且TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，提示ASP 可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減少細(xì)胞炎癥因子分泌來(lái)發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

TLR4 可在體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中通過(guò)多種信號(hào)途徑與配體結(jié)合激活NF-κB，從而增加心肌細(xì)胞凋亡。心肌缺血時(shí)，大量受損心肌細(xì)胞逐漸出現(xiàn)凋亡。Caspase-3 作為核心執(zhí)行蛋白參與線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)的凋亡過(guò)程，而cleaved Caspase-3 可反映其活性。凋亡執(zhí)行蛋白中，Bax 有明確的促凋亡作用，而B(niǎo)cl-2有明確的抑制凋亡作用［18］，兩者比值可有效反映細(xì)胞凋亡的程度。唐詠文等［19］研究觀(guān)察到SD 大鼠心肌缺血再灌注時(shí)有大量的心肌細(xì)胞凋亡，伴有凋亡蛋白表達(dá)異常。KHAZAEI 等［20］使用丹參多酚處理MIRI模型大鼠，發(fā)現(xiàn)丹參多酚可減少大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax 和活化的Caspase-3。本研究結(jié)果顯示，在A(yíng)SP處理后抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl-2表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子Bax 表達(dá)下降，提示ASP 可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，ASP在體內(nèi)、體外缺血再灌注模型中均可改善大鼠MIRI，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NFκB 通路激活、減輕炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究旨在為目前關(guān)于MIRI 的藥理學(xué)預(yù)防和ASP在心肌損傷中的治療潛力提供新的方向，而ASP 在MIRI 中的特異性作用靶點(diǎn)尚不明確，有待進(jìn)一步研究。