氣液相等離子體誘變選育安普霉素高產(chǎn)菌株的研究

丁 強，向繼武，周 明，程 波，譚小芳 ，閆 雪，沈 潔

1. 宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443000；

2. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；

3. 宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 宜昌 443000 ；

4. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230000

安普霉素是美國Eli Lilly 公司首次發(fā)現(xiàn)的，由黑暗鏈霉菌合成的一種氨基環(huán)醇類抗生素中尼拉霉素復(fù)合物的一個組分［1］，又名阿普拉霉素，其分子式為C21H41N5O11，由3 部分組成，分別為4-氨基-4-脫氧-α-吡喃型葡萄糖，辛二糖胺，2-脫氧鏈霉胺，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。安普霉素具有廣譜抗菌性，在獸藥范圍和畜禽類養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域被普遍使用于畜禽類的腸道感染治療，特別是對幼禽因為大腸桿菌、沙氏門菌等導(dǎo)致的腹瀉，腸道炎癥的治療和預(yù)防上，效果非常顯著［2］；在畜禽養(yǎng)殖上，適量的安普霉素用于飼料添加劑，可以使畜禽體重獲得明顯增加，達(dá)到提前出欄的效果［3］，研究還表明，安普霉素作為飼料添加劑的成分能有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚、蝦增的重率和蛋白質(zhì)效率［4］，市場前景巨大。

圖1 安普霉素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of apramycin

為了獲得適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵的安普霉素優(yōu)良生產(chǎn)菌株，目前對安普霉素生產(chǎn)菌株的研究主要集中以下3 個方面：其一是采用傳統(tǒng)誘變方法如紫外、化學(xué)法等提高其產(chǎn)品效價［5］；其次對安普霉素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以獲得更高的生產(chǎn)效率［6-10］；另外對安普霉素合成途徑進(jìn)行了解析［11］，為安普霉素產(chǎn)品的開發(fā)和菌種選育提供了參考，例如李相豐等［12］推斷出了安普霉素可能的合成途徑，即葡萄糖起始合成巴龍霉胺后經(jīng)環(huán)合生成安普霉胺，進(jìn)一步與4-氨基-4-脫氧葡萄糖連接，最終生成了安普霉素，王普宏［13］通過阻斷tacA 基因獲得安普霉素單組份突變株。目前，不論是傳統(tǒng)誘變方法還是基因工程改造技術(shù)都在提高安普霉素效價方面取得了相當(dāng)?shù)某尚РV泛用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)?？梢姡ㄟ^誘變育種將安普霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株的產(chǎn)品效價提高是行之有效的［14］。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）技術(shù)因其溫和安全、突變率高等特點，在菌種誘變上得到了廣泛的應(yīng)用［15］。而中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院通過結(jié)合近年來發(fā)展起來的大氣壓低溫等離子體誘變育種技術(shù)，集電子、離子、激發(fā)態(tài)中性分子、自由基、電場、紫外輻射等諸多生物誘變因素，提出氣液相等離子體，以空氣作為放電氣體，通過電極間形成的等離子體通道注入到水溶液中的改進(jìn)常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)［16］。由于采用空氣（主要成分為N2、O2）激發(fā)產(chǎn)生等離子，并且等離子體直接與水溶液接觸，可以產(chǎn)生豐富的高濃度活性氧（如OH、氧原子、O2-、H2O2等）和活性氮基團(tuán)（如激發(fā)態(tài)氮分子、NO 等），高含量活性氧、活性氮及磁場雙重作用下，將大大提高菌株突變率和突變庫容量，結(jié)合通量篩選技術(shù)，磁場協(xié)同氣液等離子體技術(shù)有望成為高效誘變育種的新方法［17］。改進(jìn)后的氣液相等離子體誘變技術(shù)具有操作方便，經(jīng)濟(jì)成本低；對菌株遺傳物質(zhì)損傷多樣性，可以提高獲得突變菌株的概率；誘變安全，對人體無害，對環(huán)境無污染等諸多優(yōu)點。因此本試驗將中國科學(xué)院等離子體物理研究所的氣液等離子體技術(shù)應(yīng)用于安普霉素生產(chǎn)菌株的誘變育種，建立并優(yōu)化誘變工藝，期望為獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的安普霉素工業(yè)菌株提供參考。

1 實驗部分

1.1 菌 種

誘變出發(fā)菌株：黑暗鏈霉菌（Streptomyces tenebrarius）A-0，為本公司保藏菌種。

生物效價檢測用菌種：枯草芽孢桿菌（bacillus subtitles）。

1.2 培養(yǎng)基

平板選擇培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖1.0 ，蛋白胨0.5 ，牛肉膏0.1，酵母膏0.1 ，NaCl 0.2 ，MgSO4.7H2O 0.025，瓊脂粉1.5，溶于pH 7.2的蒸餾水。

斜面培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：可溶性淀粉2.0，NaCl 0.05，KNO30.1 ，K2HPO4.3H2O 0.05，MgSO4.7H2O 0.05 ，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.001，瓊脂2.0，溶于pH 7.4~7.6 的自來水。

種子瓶培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖3.0，玉米淀粉2.0 ，黃豆粉2.5 ，酵母粉0.1，碳酸鈣0.2，，硫酸鎂0.1，玉米漿1.5，硫酸銨0.1。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）：葡萄糖4.0，玉米淀粉2.0，黃豆餅粉4.0，酵母粉0.5，蛋白胨1.0，玉米漿0.5，硫酸銨0.5，硫酸鎂0.4，磷酸二氫鉀0.1，淀粉酶0.2，碳酸鈣0.5，豆油0.5。

1.3 試 劑

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司：NaCl，MgSO4·7H2O，KNO3，K2PO4·3H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，硫酸銨，碳酸鈣，磷酸二氫鉀，氯化銨，瓊脂粉。

北京奧博星生物技術(shù)有限公司：葡萄糖，牛肉膏，可溶性淀粉，玉米粉，玉米漿，蛋白胨，黃豆餅粉，豆油，淀粉酶。

安琪酵母有限公司：酵母粉，酵母膏。

阿拉丁化學(xué)試劑網(wǎng)：安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品（K0231610 1mg 含517 單位安普霉素）。

北京中海生物科技有限公司：抗生素檢定培養(yǎng)基1 號。

美國Fisher公司：甲醇（色譜純）。

1.4 儀器及設(shè)備

本實驗使用的儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器及設(shè)備型號Tab.1 Models of instruments and equipment

1.5 實驗方法

以Streptomyces tenebrarius菌株A-0 為出發(fā)菌株，采用改進(jìn)后的氣液相等離子體誘變技術(shù)進(jìn)行誘變育種，實驗路線見圖2。

圖2 安普霉素菌種氣液相等離子體誘變實驗路線Fig.2 Experimental route of gas-liqiud phase plasma mutagenesis of apramycin strains

1.5.1 安普霉素斜面培養(yǎng) 制備安普霉素茄子瓶斜面，30 ℃空培5~7 d，目測無雜菌后接種0.1 mL孢子液，37 ℃培養(yǎng)7 d，待斜面孢子轉(zhuǎn)白后收入冰箱保藏備用。

1.5.2 菌懸液制備 取滅菌后的純化水20 mL 將斜面孢子洗下打散并用紗布過濾，調(diào)整孢子量為1.0~1.2×108CFU/mL，備用。

1.5.3 氣液相等離子體誘變處理菌懸液 以孢子數(shù)為1.0~1.2×108CFU/mL 的菌懸液，進(jìn)行氣液相等離子體誘變，基本參數(shù)如下：無菌空氣流量2.5 L/h，放電功率10 W，溫度25~30 ℃，壓力為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，調(diào)節(jié)離子噴射探頭至液面下，距杯底1.0~1.5 cm處，分別處理30、45、60、75、90、105、120 s。處理過程中，在到達(dá)預(yù)設(shè)處理時間時，通過特定取樣管道進(jìn)行取樣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水稀釋不同梯度涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，進(jìn)行平板活菌計數(shù)（colony-forming units，CFU），計數(shù)誘變致死率，制作致死率曲線。

1.5.4 誘變菌懸液涂布分離 將誘變后的菌懸液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%生理鹽水按10 的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5共3 個梯度進(jìn)行平板涂布，取樣量為100 μL/皿，每批涂布3 個平板，設(shè)置空白對照，37 ℃培養(yǎng)5~7 d。

1.5.5 安普霉素菌落初篩 不同單孢子接種的培養(yǎng)平板長滿后，分別用滅菌打孔器將（約2~3 cm2）菌片接種到24 孔板中，每孔裝5 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)120 h。3 000 r/min，5 min 離心發(fā)酵液，取上清液用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行含量測定，選擇安普霉素含量高的菌株。

1.5.6 安普霉素?fù)u瓶復(fù)篩 選擇安普霉素初篩后效價較出發(fā)菌株有明顯提高的突變菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。500 mL 搖瓶中裝50 mL 培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)120 h，每個菌號做3 組平行實驗，采用HPLC 測定安普霉素含量，同時通過枯草芽孢桿菌使用牛津杯法測定安普霉素突變菌株的生物效價。

1.5.7 突變菌株遺傳穩(wěn)定性考察 復(fù)篩得到的突變菌株連續(xù)傳代至第五代，37 ℃，220 r/min，120 h搖瓶考察突變菌株傳代的效價，選擇第一代和第五代之間效價差距低于5%的菌種，為選育成功，遺傳穩(wěn)定性較好，可以用于生產(chǎn)的菌株。

1.5.8 安普霉素檢測及計算方法［14］

（1）致死率計算

誘變后的菌懸液和未經(jīng)誘變的對照菌懸液分別進(jìn)行10 的倍數(shù)梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6分別涂布3 個平板，37 ℃，7 d 后進(jìn)行活菌計算，根據(jù)平板上的菌落數(shù)量計算致死率。

其中：Q為誘變前對照品菌懸液的菌落數(shù)/（CFU/mL）；H為ARTP 誘變處理后菌懸液的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

（2）突變率計算

以安普霉素出發(fā)菌A0的效價作為對照組，將效價提高20%及以上和效價降低20%及以下的菌株歸為突變菌株，其中效價提高20%及以上的稱為正突變菌株，根據(jù)下面公式計算突變率和正突變率。

（3）菌濃測定

體積法：用移液管取混合均勻的發(fā)酵液10 mL至離心管中，3 000 r/min 離心10 min，然后將上清液倒入計量管中，讀取上清液體積，計算菌渣體積，即菌濃。

（4）安普霉素生物效價測定

生物效價測定方法：培養(yǎng)基為抗生素檢定培養(yǎng)基1 號；檢測菌：枯草芽孢桿菌；樣品濃度：高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度樣品、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品、低濃度樣品；培養(yǎng)溫度：35~37 ℃；培養(yǎng)時間：16~18 h；R值選取范圍：0.9~1.1（若低于或高與則需要重新估供試品效價）。

（5）安普霉素高效液相色譜法測定含量

HPLC檢測：色譜柱為Apollo C18 5 μm×250 mm×4.6 mm；柱溫：30 ℃；流動相：用20 mL/L 三氟乙酸和1 mL/L七氟丁酸混合后加超純水定容至1 000 mL；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；蒸發(fā)光溫度：110 ℃；氣體流量：3.0 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌種A-0 的安普霉素生物含量

配制0.2 mg/mL 的安普霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液為100%，稀釋成5 個不同濃度的水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣檢測，以測得的響應(yīng)信號對應(yīng)被測物濃度作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程lgA=1.213 2lgC+2.451（R2=0.999 9），其中l(wèi)gA為峰面積，lgC為樣品濃度，R值在0.99 范圍內(nèi)，可見安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性良好。將安普霉素?fù)u瓶發(fā)酵液離心后，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測，獲得安普霉素的HPLC 圖譜，如圖3 所示，安普霉素的出峰時間在13.5 min 左右，將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)過計算得出安普霉素初始菌株A-0 的安普霉素120 h 發(fā)酵的生物含量為0.282 mg/mL。

圖3 產(chǎn)安普霉素原始菌株A-0 發(fā)酵120 h 的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC diagram of apramycin fermentation broth produced by original strain A-0 after 120 h fermentation

2.2 致死率曲線

通過平板涂布計算氣液相等離子誘變每間隔20 s 誘變下菌株的存活個數(shù)，確定誘變的致死率，得到最佳的誘變時間。以0 min 誘變時間菌落的死亡率為0 制作致死率曲線，如圖4 所示。

圖4 氣液相等離子誘變黑暗鏈霉菌致死率曲線Fig.4 Streptomyces tenebrarius lethality rate curve of gas-liquid phase plasma mutagenesis

由圖4 可知，隨著氣液相等離子體誘變時間的延長，安普霉素菌種的存活率在不斷降低，在處理90 s后黑暗鏈霉菌的的致死率接近90%，處理120 s后基本不再變化，維持在100%的死亡率，。根據(jù)現(xiàn)代科學(xué)的誘變統(tǒng)計，致死率在75%左右是最佳的誘變點，因此，選擇誘變時間75 s 作為后續(xù)誘變菌株的最佳節(jié)點，在該時間內(nèi)，黑暗鏈霉菌的致死率為78.6%，突變率經(jīng)過計算為43.5%，其中正突變率為22.6%。

2.3 突變菌株篩選結(jié)果

2.3.1 氣液相等離子體誘變誘變菌株初篩 選擇75 s 處理時間用氣液相等離子體誘變處理黑暗鏈霉菌，梯度稀釋誘變后的菌懸液，涂布平板選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)7~12 d 后進(jìn)行挑單菌落。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小、生長情況，選擇較飽滿、生長旺盛、單個或形態(tài)與原種相比發(fā)生很大變化的菌落進(jìn)行挑選傳代，然后將余下的菌苔整個挑下放入24 孔板發(fā)酵5 d 考察效價。通過HPLC 法檢測安普霉素發(fā)酵含量，與原種A-0 含量相比較，50 個篩選菌種里面，共獲得5 個較出發(fā)菌株安普霉素產(chǎn)量增幅大于5%~30%的突變菌種，如圖5 所示，挑選菌號分別為8，12，25，35，47，對突變菌種重新編號，分別對應(yīng)A-01，A-02，A-03，A-04，A-05。

圖5 氣液相等離子體誘變誘變后突變菌株安普霉素產(chǎn)量的初篩結(jié)果Fig.5 Preliminary screening results of apramycin yields after gas-liquid phase plasma mutagenesis

2.3.2 突變菌株復(fù)篩 通過初篩得到5 株突變的高效價菌株，將得到的菌株進(jìn)行3 輪搖瓶復(fù)篩，管碟法測定生物效價，與對照A-0 相比較，篩選出來的5 個突變菌株中A-4 的效價最為穩(wěn)定，基本3 輪復(fù)篩都維持在（3 300±100）U/mL 的范圍內(nèi)，其他4個突變菌株在復(fù)篩中效價相對穩(wěn)定，但效價水平均低于A-4 突變菌株，如下圖6 所示，故選擇A-4進(jìn)行連續(xù)傳代考察穩(wěn)定性。

圖6 安普霉素突變菌株三輪復(fù)篩數(shù)據(jù)Fig.6 Data of rescreening of apramycin mutant strains for three times

2.3.3 安普霉素A-4 傳代遺傳穩(wěn)定性考察 安普霉素突變菌株A-4 在初篩和復(fù)篩中菌表現(xiàn)優(yōu)良，對A-4 突變菌進(jìn)行連續(xù)五次傳代，以A-4 一代菌為對照組，搖瓶考察傳代后的穩(wěn)定性，如圖7 所示，A-4在連續(xù)傳代的過程中，一代效價3 330 U/mL，到第五代是效價3 274 U/mL，降低幅度在5%以內(nèi)，符合生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，高效液相色譜測定含量一代最高達(dá)到0.375 mg/mL，傳代到第5 代，含量維持在0.358 mg/mL，可以進(jìn)行菌種保藏和生產(chǎn)應(yīng)用。

圖7 突變菌株A-4 連續(xù)傳代遺傳穩(wěn)定性考察Fig.7 Genetic stability test of mutant strain A-4 through continuous subculturing

2.3.4 安普霉素突變菌株A-4 搖瓶發(fā)酵過程監(jiān)控 以安普霉素出發(fā)菌株A-0 作為對照組，氣液相等離子體誘變突變菌株A-4 為試驗組，進(jìn)行安普霉素突變菌的搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵過程中菌絲體積變化（菌濃）和安普霉素產(chǎn)物積累如圖8 所示。

圖8 A-0 對照菌與突變菌A-4 發(fā)酵過程菌濃變化和發(fā)酵過程產(chǎn)物積累情況：（a）菌濃變化情況，（b）發(fā)酵過程產(chǎn)物積累情況Fig.8 （a）Variation trends of strain concentration during fermentation process，（b）comparison of product accumulation during fermentation process of comparison strain A-0 and mutant strain A-4

從圖8 可以看出突變菌株的菌絲生長更快，在48 h 達(dá)到生長的最高峰，未誘變的出發(fā)菌株A-0 的菌絲開始溶解，菌濃在72 h 后不斷下降，而突變菌A-4 則在84 h 菌濃才開始下降，突變菌菌絲溶解速度較原始菌緩慢，可見突變菌的穩(wěn)定期要比原始菌株長，推測突變菌株A-4 生長和合成安普霉素的時間較長，從而在相同發(fā)酵時間內(nèi)積累更多產(chǎn)物，從而發(fā)酵水平有所提高。如圖8 所示，84 h 以后原始菌株A-0 安普霉素的積累變得緩慢，到發(fā)酵結(jié)束36 h 內(nèi)增長的效價不多，在500 U/mL 左右，但突變菌株A-4 在84 h 后產(chǎn)物仍維持較快的增長速度，到120 h 時，突變菌株的生物效價為3 420 U/mL，較84 h 效價增長了900 U/mL 左右，突變菌株較原始菌株A-0 發(fā)酵終點的生物效價2 580 U/mL，提高了32.6%。

3 結(jié) 論

本研究通過氣液相等離子體技術(shù)誘變安普霉素產(chǎn)生菌黑暗鏈霉菌A0，獲得了一株效價提高并具有穩(wěn)定遺傳性的安普霉素高產(chǎn)突變菌株A-4。結(jié)果表明氣液相等離子體誘變技術(shù)對黑暗鏈霉菌在一定的致死率下有較強的誘變效果，處理75 s后致死率達(dá)到78.6%，正突變率達(dá)到最佳效果28.9%，篩選得到的突變菌株A-4 生物效價達(dá)到3 420 U/mL，搖瓶發(fā)酵安普霉素含量0.375 mg/mL，較出發(fā)原始菌株A-0 效價提高了32.6%。氣液相等離子體誘變得到的突變菌株在經(jīng)過連續(xù)傳代后，仍維持在5%范圍內(nèi)的效價波動，穩(wěn)定性高?？梢娬T變用的活性離子導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損傷和破壞，在其自我修復(fù)的過程中形成了不完全修復(fù)的突變，獲得穩(wěn)定遺傳的突變菌株。