基因測(cè)序技術(shù)在單基因狼瘡精準(zhǔn)診斷和機(jī)制研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

楊智博 劉 力

1.天津市兒童醫(yī)院 天津大學(xué)兒童醫(yī)院綜合內(nèi)科（免疫）（天津 300074）；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（天津 300070）

單基因狼瘡是單基因變異引起的一類表現(xiàn)為狼瘡樣癥狀的自身免疫性疾病總稱，多呈早發(fā)趨勢(shì)，通常由兒童免疫科醫(yī)師確診。盡管該病因只占系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）發(fā)病的很小一部分，但了解其機(jī)制有助于臨床醫(yī)師深刻理解并精準(zhǔn)診療SLE。單基因狼瘡患者的臨床癥狀與其他SLE 患者不同，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和皮膚癥狀為主，尤其是單基因狼瘡患者會(huì)出現(xiàn)皮膚凍瘡樣皮損[1]。當(dāng)患者臨床癥狀不典型時(shí)，精確診斷仍需基因測(cè)序。相關(guān)研究指出，已有30多個(gè)單基因的100 多個(gè)位點(diǎn)變異可致SLE 表型[1]。這些發(fā)現(xiàn)加深了臨床醫(yī)師對(duì)于SLE 的理解，但其他未知的變異也是未來需研究的方向。有研究認(rèn)為，SLE患者早發(fā)型或反復(fù)感染都應(yīng)進(jìn)行免疫檢查和基因檢測(cè)[2]。本文將從單基因狼瘡概念，基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用，以及單基因狼瘡致病機(jī)制等方面進(jìn)行分析，以期為其精準(zhǔn)診斷和治療提供方向。

1 單基因狼瘡概念與診斷

單基因狼瘡是SLE 中較為少見的分支，通常在兒童期發(fā)病，與家族遺傳高度相關(guān)。研究表明，89.8%的患者符合歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟/美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（EULAR/ACR）-2019 診斷標(biāo)準(zhǔn)，而93.9%患者符合系統(tǒng)性紅斑狼瘡國(guó)際臨床協(xié)助組（SLICC）-2012診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，提示僅依據(jù)現(xiàn)有診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷SLE 患者是否為單基因變異所致很困難。但有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SLE 患者滿足以下條件時(shí)，應(yīng)高度懷疑單基因狼瘡：①早發(fā)型狼瘡，首發(fā)年齡＜10歲；②高度懷疑或者已經(jīng)確診為免疫缺陷，或有反復(fù)感染史；③臨床癥狀不典型；④病情嚴(yán)重，危及生命；⑤病程進(jìn)展快，迅速惡化或器官損傷積累；⑥對(duì)治療不敏感；⑦有家族史；⑧近親結(jié)婚等[4]。還有一項(xiàng)基因異質(zhì)性研究認(rèn)為，當(dāng)兒童早發(fā)型SLE 合并腎臟和血液系統(tǒng)疾病時(shí)，更可能為遺傳病因所致[5]。同時(shí)，要精準(zhǔn)診斷單基因狼瘡，需要進(jìn)行基因檢測(cè)，而若要判斷變異來源，對(duì)患者及直系親屬全部進(jìn)行基因檢測(cè)是精準(zhǔn)診斷的前提。

2 基因測(cè)序技術(shù)概述及應(yīng)用

基因測(cè)序技術(shù)可分為全基因組測(cè)序技術(shù)（whole genome sequencing，WGS）、全外顯子測(cè)序技術(shù)（whole exome sequencing，WES）和靶向基因面板測(cè)序（a targeted next-generation sequencing panel，NGS）等。WGS和WES是廣撒網(wǎng)式測(cè)序，而NGS通常只對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序。有研究提到，運(yùn)用父母-子代一家系的樣本進(jìn)行WGS，可找到幾乎所有的單核苷酸變異和絕大多數(shù)更小的插入-刪除變異，同時(shí)確定許多變異的親本來源[6]。通常對(duì)患者血液淋巴細(xì)胞中分離的DNA進(jìn)行基因測(cè)序，利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和測(cè)序平臺(tái)分析找出變異位點(diǎn)，可診斷單基因狼瘡[4-6]。而精準(zhǔn)診療有賴于大量病例報(bào)道中基因測(cè)序確定的致病位點(diǎn)。

3 基因變異與單基因狼瘡致病機(jī)制

由單基因變異引起的機(jī)體功能異常而致病的機(jī)制大致可分為以下幾類：①細(xì)胞清除異常；②Ⅰ型干擾素（IFN-1）的過度產(chǎn)生；③自身免疫耐受受損；④其他單基因變異異常等。

3.1 細(xì)胞清除異常

細(xì)胞清除異常是指細(xì)胞程序性凋亡的產(chǎn)物不能被及時(shí)清除，從而引起自身免疫性疾病。其中吞噬細(xì)胞清除程序性死亡細(xì)胞的胞葬作用最重要。細(xì)胞清除異常時(shí)，任何殘余產(chǎn)物均可作為損傷相關(guān)的分子標(biāo)志物（damage-associated molecular patterns，DAMP），刺激免疫細(xì)胞活化和分化，觸發(fā)免疫反應(yīng)，引起自身免疫病。

3.1.1 補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷 補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷是單基因狼瘡最早被發(fā)現(xiàn)且最常見的病因。補(bǔ)體系統(tǒng)參與凋亡細(xì)胞的識(shí)別、調(diào)理吞噬和清除作用。具體機(jī)制如下：當(dāng)單基因變異導(dǎo)致補(bǔ)體缺陷時(shí)，凋亡細(xì)胞碎片和免疫復(fù)合物不能被清除，暴露成為自身抗原，刺激自身抗體產(chǎn)生，放大自身免疫效應(yīng)，且持續(xù)損傷機(jī)體，從而表現(xiàn)出狼瘡樣癥狀。研究表明，早期補(bǔ)體蛋白（C1q、C1r/C1s、C2和C4）缺陷被認(rèn)為是由于調(diào)理作用受損而觸發(fā)自身免疫導(dǎo)致，這對(duì)清除免疫復(fù)合物和吞噬細(xì)胞凋亡小體至關(guān)重要[1]。還有研究指出，雜合的C2缺陷變異與低復(fù)制量的C4A同時(shí)存在時(shí)，是SLE 等疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[7]。有病例報(bào)道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G成員1（serpin family G member 1，SERPING-1）基因發(fā)生移碼變異時(shí)，血漿中C1 抑制劑（C1-INH）的水平變低，遺傳的C1-INH 缺陷會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的早期補(bǔ)體經(jīng)典途徑活化，消耗患者血漿中C4，導(dǎo)致單基因狼瘡[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)，p.His198Gln變異的C1q和腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白4（C1q and tumor necrosis factor related protein 4，C1QTNF4）蛋白在TNF-α 刺激下抑制NF-κB 的激活，該變異位于C1q 第二結(jié)構(gòu)閾，在C1QTNF4基因中功能改變也可導(dǎo)致早發(fā)型SLE[9]。

需注意的是，補(bǔ)體缺陷與早發(fā)型狼瘡相關(guān)，但其性別比差異不大，關(guān)節(jié)炎多見C2缺乏，狼瘡腎多見C4A/ C4b 缺陷，抗核抗體（ANA）常見，但只有20%的患者顯示抗ds-DNA，相反，抗Ro/SSA抗體在80%的C1q和C4缺陷患者中呈陽性，補(bǔ)體遺傳缺陷中也可見血清總補(bǔ)體CH50水平低下和正常的血清C4、C3水平[10]。具有狼瘡樣表現(xiàn)和高ANA滴度（＞1:1000）的兒童，尤其是發(fā)病初癥狀非典型的，如復(fù)發(fā)性肺炎和支氣管擴(kuò)張，也應(yīng)該考慮C4缺乏型單基因狼瘡[11]?？傊?，單基因變異引起的補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷很可能導(dǎo)致患者表現(xiàn)為狼瘡，通常早發(fā)、嚴(yán)重且可追溯家族史，變異引起細(xì)胞清除異常是導(dǎo)致單基因狼瘡的主要致病機(jī)制之一。

3.1.2 核酸降解相關(guān)酶缺陷 基因組廣泛關(guān)聯(lián)研究（genome wide association studies，GWAS）已發(fā)現(xiàn)30 多個(gè)單基因的100 多個(gè)位點(diǎn)變異導(dǎo)致SLE 表型，如TREX1、SAMHD1、DNASE1、DNASE1L3、TMEM173等，與單基因SLE 的脫氧核糖核苷酸1（deoxyribonuclease 1，DNASE1）密切相關(guān)，脫氧核糖核苷酸1樣3（deoxyribonuclease 1 like 3，DNASE1L3）基因編碼的主要酶可以分裂單鏈和雙鏈DNA，并從病原體和凋亡細(xì)胞中去除外源DNA和自體DNA[12]。DNASE1/DNASE1L3基因缺陷導(dǎo)致細(xì)胞外核酸的積累，血漿中低于120bp的短DNA分子數(shù)量增加與抗dsDNA抗體的存在有關(guān)[13]，而攜帶長(zhǎng)DNA分子的微粒具有免疫原性，與其相關(guān)的抗原可能會(huì)造成狼瘡腎損害[14]。這些胞外累積的核酸也可被toll樣受體（TLR7和TLR9）等DNA/RNA傳感器識(shí)別，導(dǎo)致IFN-1的過度生成，從而導(dǎo)致單基因狼瘡。有學(xué)者認(rèn)為，癥狀早發(fā)、肺出血、腎小球腎炎、復(fù)發(fā)性蕁麻疹和抗中性粒細(xì)胞抗體（ANCA）陽性等表現(xiàn)提示臨床上要警惕單基因狼瘡，特別是青少年SLE中DNASE1L3缺陷的單基因狼瘡[15]。基因測(cè)序應(yīng)用有助于發(fā)現(xiàn)這些基因變異位點(diǎn)。

3.2 干擾素過度產(chǎn)生

IFN 是可以限制病毒復(fù)制組裝的抗病毒細(xì)胞因子。盡管IFN-1 可以保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害，但I(xiàn)FN-1 的過度產(chǎn)生同樣會(huì)使患者出現(xiàn)單基因狼瘡。IFN-1 的過度表達(dá)可以通過以下機(jī)制發(fā)生：核酶活性的缺陷（TREX1、SAMHD1、ADAR1、RNASEs、DNASEs），IFN 信號(hào)抑制調(diào)控因子的缺陷（ISG15、USP18）和先天免疫傳感器的組合活化（MDA5、RIG-I、STING）等[1]。IFN-1 與異二聚體受體（IFNAR1和IFNAR2）結(jié)合，激活Janus 激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路，誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的轉(zhuǎn)錄[1]。這些途徑的任何編碼基因發(fā)生變異時(shí)都會(huì)導(dǎo)致IFN-1 的過度表達(dá)，從而導(dǎo)致Ⅰ型干擾素疾病，如單基因狼瘡。

例如，Aicardi-Goutières 綜合征（AGS）就是一種典型的Ⅰ型干擾素疾病，它是由單基因變異引起，表現(xiàn)為狼瘡樣癥狀的綜合征。對(duì)于早發(fā)的凍瘡樣皮損、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（顱內(nèi)鈣化、白質(zhì)病變、肌張力異常）、發(fā)育遲緩、自身免疫抗體陽性、SLE 臨床表現(xiàn)不典型或常規(guī)治療無效的SLE 患者，應(yīng)考慮AGS[16]。宿主DNA可以通過干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）變異觸發(fā)胞漿內(nèi)的固有傳感器，并激活干擾素產(chǎn)生和ISG 的表達(dá)上調(diào)[17]。所有攜帶DNA 代謝酶的功能缺失性變異（如TREX1或SAMHD1）或DNA傳感器/適配器功能獲得性變異（TMEM173/STING1）的患者在AGS或嬰兒發(fā)病的STING 相關(guān)血管炎（SAVI）這兩種疾病中都分別表現(xiàn)出高且持續(xù)的ISG 表達(dá)[17]。說明了ISG 的表達(dá)增加在相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

脊椎軟骨發(fā)育不良伴免疫調(diào)節(jié)異常（SPENCDI）也屬Ⅰ型干擾素病，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的骨骼發(fā)育不良，以椎體和干骺端放射性病變?yōu)樘卣鱗18]，其免疫調(diào)節(jié)異?？梢员憩F(xiàn)為SLE 等自身免疫病。該病由抗酒石酸酸性磷酸酶5（acid phosphatase 5，ACP5）基因純合變異導(dǎo)致的酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）失活所引起[19]，在非核酸相關(guān)的刺激/調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素途徑中發(fā)揮作用[18-20]。當(dāng)該病患者的免疫調(diào)節(jié)異常表現(xiàn)為狼瘡時(shí)，這也是一種單基因狼瘡。

3.3 自身免疫耐受受損

SLE 患者體內(nèi)廣泛存在自身抗體，當(dāng)某些基因變異時(shí)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞無效清除，對(duì)其陰性選擇失效就會(huì)觸發(fā)自體免疫和耐受受損，從而發(fā)生自身免疫性疾病，如單基因狼瘡。

3.3.1 T 細(xì)胞免疫耐受受損 鼠類肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因變異時(shí)，增強(qiáng)了絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路（RAS-MAPPK）的傳導(dǎo)信號(hào)，刺激淋巴細(xì)胞增殖，并抑制T 淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致單基因狼瘡等癥狀出現(xiàn)，在臨床上稱為Noonan 綜合征。如NRAS、SOS1、PTPN11、RAF和SHOC2等基因變異也與Noonan綜合征相關(guān)[10]。

3.3.2 B細(xì)胞免疫耐受受損 蛋白激酶Cδ（protein kinase C delta，PRKCD）基因編碼的蛋白激酶Cδ（PKC-δ）是一種促凋亡因子，作用于B細(xì)胞的凋亡。當(dāng)PRKCD基因純合錯(cuò)義變異時(shí)，PKC-δ表達(dá)降低，B 細(xì)胞凋亡減少導(dǎo)致未成熟的B 細(xì)胞過度聚集，自身抗體增多，形成免疫復(fù)合物而出現(xiàn)一系列自身免疫性疾病癥狀[10]。

TLR7 是一種病毒RNA 的傳感器，TLR7 信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)也是自身免疫性疾病的一種發(fā)病機(jī)制。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由于TLR7 功能獲得性變異引起對(duì)鳥苷的親和力增加，TLR7激活閾值降低會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞驅(qū)動(dòng)自身免疫，造成SLE等自身免疫疾病[21]。TLR7促進(jìn)了被B 細(xì)胞受體激活的高自身反應(yīng)性未成熟B細(xì)胞的異常存活，并以細(xì)胞固有的方式累積CD11c+年齡相關(guān)B 細(xì)胞和生發(fā)中心B 細(xì)胞，濾泡和濾泡外輔助性T 細(xì)胞也隨之增加。雖然人類TLR7Y264H變異足以在小鼠中誘導(dǎo)出狼瘡，但除了增加Ⅰ型干擾素基因轉(zhuǎn)錄外，對(duì)核苷酸酶H2亞基B（ribonuclease H2subunit B，RNASEH2B）半合子沒有明顯的增加效應(yīng)，在存在環(huán)境因素刺激的情況下，該變異在人類中的作用可能會(huì)增加，包括依賴TLR7 免疫的單鏈RNA病毒，如新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）等[22]。這證明了失調(diào)的TLR7 能夠驅(qū)動(dòng)自身抗體產(chǎn)生和SLE 的發(fā)生，或許可以為治療單基因狼瘡提供新思路。

P2Y受體8（P2Y receptor family member 8，P2RY8）是一種在抑制生發(fā)中心B細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中具有既定作用的受體，P2RY8 雜合錯(cuò)義變異同樣會(huì)對(duì)B 細(xì)胞免疫耐受造成損傷并導(dǎo)致SLE 癥狀。低P2RY8水平與狼瘡性腎炎相關(guān)，與年齡相關(guān)B細(xì)胞和漿細(xì)胞的增加相關(guān)[23]。編碼區(qū)變異或某些環(huán)境因素可以損害狼瘡患者的P2 RY8 功能，導(dǎo)致P2RY8減少。

3.4 其他單基因變異引起的狼瘡

有病例報(bào)道，在單基因狼瘡患者中發(fā)現(xiàn)了脂多糖應(yīng)答性米色樣錨定蛋白（lipopolysaccharideresponsive beige-like anchor protein，LRBA）基因變異缺陷[24]。LRBA促進(jìn)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）表達(dá)，SLE患者的T細(xì)胞在激活時(shí)不能上調(diào)CTLA4，該通路的改變則可能是LRBA 缺陷導(dǎo)致單基因狼瘡的致病機(jī)制。

某些狼瘡繼發(fā)于單基因變異引起的原發(fā)性免疫缺陷類疾病。如RAG1、NRAS、PIK3CD、PSYPIP1、TNFAIP3等單基因雜合變異引起原發(fā)性免疫缺陷疾病，都可能繼發(fā)狼瘡[25]。此外，胞質(zhì)分裂作用因子8（dedicator of cytokinesis 8，DOCK8）缺陷導(dǎo)致的高IgE綜合征也會(huì)表現(xiàn)為SLE[26]。

4 結(jié)論與展望

近年來，隨著基因測(cè)序技術(shù)在SLE 患者診斷及研究中的廣泛應(yīng)用，很多單基因相關(guān)的變異被發(fā)現(xiàn)，其中有許多罕見變異位點(diǎn)，也有越來越多的兒童患者及其家庭愿意參與基因測(cè)序來尋找病因，為深入了解單基因狼瘡的致病機(jī)制提供了思路與方向。相關(guān)研究分析表明，罕見變異所受到連鎖不平衡的影響遠(yuǎn)小于常規(guī)變異[27]。已有學(xué)者把已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的31 個(gè)單基因狼瘡變異位點(diǎn)（C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR、DNASE1、DNASE1L3、PRKCD、ACP5、SLC7A7、IFIH1、TMEM173、ISG15、CYBB、FAS、FASLG、KRAS、NRAS、MAN2B1、PEPD、PTPN11、RAG2、SHOC2）作為靶向基因，運(yùn)用NGS診斷自身炎性疾病。所有早發(fā)型SLE患者，無論有無家族史，都應(yīng)該通過NGS檢測(cè)單基因缺陷[28]?？傊蟛糠肿儺惗际峭ㄟ^影響炎癥通路和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生自身抗體或有害炎癥因子，通過其持續(xù)作用而導(dǎo)致自身免疫性疾病如單基因狼瘡的發(fā)生。

過去，狼瘡的治療藥物選擇有限，大多采用激素和免疫抑制劑等非特異性治療，但隨著對(duì)單基因狼瘡認(rèn)識(shí)的加深，既有助于更全面了解SLE 這類疾病，也可為針對(duì)不同的致病途徑進(jìn)行精準(zhǔn)阻斷治療提供新的方向和依據(jù)。比如，貝利木單抗是一種人源性單克隆IgG抗體，可抑制B淋巴細(xì)胞刺激因子，導(dǎo)致B 細(xì)胞數(shù)量減少并調(diào)節(jié)其功能，可有效緩解成人SLE 患者的皮膚和關(guān)節(jié)癥狀，也有其治療兒童單基因狼瘡患者（C1q 缺陷）后關(guān)節(jié)炎癥狀得到完全緩解的先例，因此貝利木單抗可作為一種輔助治療應(yīng)用于難治性單基因狼瘡患者[29]。此外還有其他治療手段，如某病例報(bào)道中提到的，應(yīng)用造血干細(xì)胞移植治療表現(xiàn)為SLE 的DOCK8 缺陷患者[26]。補(bǔ)充DNASE1L3也可以作為一種療法，用來幫助該種缺陷的患者[13]。更有新鮮冰凍血漿和造血干細(xì)胞移植應(yīng)用到C1q缺乏的早發(fā)型SLE患者中，替代由單核細(xì)胞產(chǎn)生蛋白缺失的先例等[30]。

盡管已有很多前期研究，但由于該病患者基數(shù)小且大部分為兒童，診療與成人患者相比更具有局限性和不確定性，對(duì)單基因狼瘡的認(rèn)識(shí)仍不足。在未來，發(fā)現(xiàn)更多可能的變異位點(diǎn)，厘清發(fā)病機(jī)制仍是研究單基因狼瘡的努力方向，精準(zhǔn)診療等也需要更深入的討論和驗(yàn)證。