一株川金絲猴皮膚感染真菌的分離及鑒定

●李俊嫻 鄧長(zhǎng)林 程家球 李梅榮

（南京市紅山森林動(dòng)物園 江蘇 南京 210028）

紅酵母（Rhodotorula）是擔(dān)子菌亞門(mén)銹菌綱擔(dān)孢目隱球菌科紅酵母亞科紅酵母屬真菌，是一類(lèi)產(chǎn)色素酵母菌[1]。研究認(rèn)為，紅酵母在空氣、土壤和江河湖泊等水體中普遍存在，也可以存在于動(dòng)物、植物以及人體上[2]。過(guò)去曾普遍認(rèn)為紅酵母屬于無(wú)致病性的腐生菌和污染菌[3]，罕見(jiàn)導(dǎo)致人類(lèi)感染。近年來(lái)，隨著免疫低下人數(shù)逐漸增多，不斷增加的侵襲性真菌感染案例引起研究人員的關(guān)注。繼毛孢子菌屬（Trichosporonspp·）、念珠菌屬（Candidaspp·）、隱球菌屬（Cryptococcusspp·）之后，紅酵母菌屬（Rhodotorulaspp·）成為引發(fā)侵襲性酵母菌感染的第四大類(lèi)病原體，總體分離率4·2%（n=8821）[4]。經(jīng)人醫(yī)臨床統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，血流感染、眼感染、心內(nèi)膜炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腹膜透析相關(guān)性腹膜炎、關(guān)節(jié)假體感染、皮膚感染等均為紅酵母菌的感染類(lèi)型，其中最常見(jiàn)的類(lèi)型是導(dǎo)管相關(guān)性真菌血癥[5-7]。紅酵母屬共包含8個(gè)種，膠紅酵母是人醫(yī)臨床中最常見(jiàn)的致病種[1，7]。江蘇某動(dòng)物園一只川金絲猴皮膚見(jiàn)化膿性皮損。經(jīng)分子生物學(xué)診斷為膠紅酵母感染。此為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)川金絲猴皮膚感染膠紅酵母。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 Taq Plus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 引物合成 真菌ITS擴(kuò)增通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料采集和分離培養(yǎng) 用75%乙醇對(duì)患病川金絲猴皮損處消毒后，在相對(duì)無(wú)菌環(huán)境下采集皮損處樣本，用無(wú)菌接種針蘸取皮損處病料，接種于沙堡液體培養(yǎng)基中，于30℃恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液于沙堡瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得純化菌株。

1.2.2 總DNA提取 取經(jīng)高壓滅菌的0·2% SDS溶液400 μL于滅菌離心管中，取單菌落溶于溶液中，封閉離心管后渦旋振蕩15 s，后沸水浴4 min，擦干離心管外壁后以12 000 r/min離心1 min，取上清液300 μL（病原菌總基因組DNA），凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成與PCR擴(kuò)增 采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行真菌ITS區(qū)擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：Taq Plus MasterMix 10 μL，引物各2 μL，病原菌總基因組DNA 2 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3 min；98℃變 性10 s，59℃退火1·5 min，72℃延伸1·5 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，將PCR產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆?。? μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳30 min后，通過(guò)凝膠成像儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建立將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物寄送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行克隆測(cè)序分析，獲得片段序列后，在Gen Bank（http：//www·ncbi·nlm·nih·gov/blast）中進(jìn)行分析BLAST比對(duì)，找出與其相似性最高的菌株。得到序列后用軟件MEGA7·0進(jìn)行分析，制作成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)與菌體形態(tài)

將分離株接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)溫度下生長(zhǎng)速度一般，呈圓形酵母樣菌落，菌落呈黏質(zhì)狀，菌落產(chǎn)生橘紅色色素，光鏡下見(jiàn)圓形或卵圓形酵母細(xì)胞，可見(jiàn)出芽生殖，未見(jiàn)假菌絲。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

取純培養(yǎng)菌落提取總基因組DNA為PCR模板，并利用ITS1/ITS4引物對(duì)分離株的ITS區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，見(jiàn)一條長(zhǎng)度介于500～750 bp之間的單一條帶，與真菌ITS序列堿基大小范圍相符，PCR對(duì)照組未見(jiàn)條帶。電泳圖如圖1所示。

圖1 分離株ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將分離株的ITS1-ITS4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得片段序列，如圖2所示。檢測(cè)結(jié)果顯示，分離株ITS區(qū)片段堿基大小為616 bp。將測(cè)序結(jié)果在 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其他已報(bào)道的膠紅酵母菌ITS序列相比，該分離株與MT465994·1同源性高達(dá)99%。根據(jù)同源性分析結(jié)果，選擇同源性較高的34株不同參考菌株的序列為基礎(chǔ)，建立進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果和進(jìn)化樹(shù)中親緣性分析得知，本研究中分離株為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

圖2 分離株ITS序列

圖3 分離株 rDNA ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

紅酵母菌屬是在自然界分布廣泛的一類(lèi)真菌，已在生物工程等領(lǐng)域有廣泛的研究和應(yīng)用，近些年被研究確認(rèn)為條件致病菌，屬罕見(jiàn)酵母菌[8]。膠紅酵母感染在國(guó)內(nèi)野生動(dòng)物臨床上尚未見(jiàn)報(bào)道。分離菌在本次川金絲猴感染上臨床表現(xiàn)為感染處大面積脫毛，脫毛處皮膚覆蓋有結(jié)痂，結(jié)痂較厚且呈微黃色，移除結(jié)痂后可見(jiàn)皮膚潮紅，患處與正常皮膚有較為明顯的分界線。未結(jié)痂患處可見(jiàn)大量點(diǎn)狀膿皰顆粒，膿皰顆粒易受外力破壞破潰。感染導(dǎo)致患處附近淋巴結(jié)腫大。病猴表現(xiàn)明顯抓撓患處的行為。臨床獸醫(yī)師選用寵物用氟康唑，按每0·1 mL/kg·bw皮下注射，每周注射1次，同時(shí)選用頭孢曲松鈉0· 5 g、阿米卡星1 mL肌肉注射，每日1次，連續(xù)治療20日后，臨床癥狀逐漸減退，患處皮膚痊愈，病猴抓撓患處行為逐漸消失。愈后3個(gè)月2次對(duì)患處皮膚進(jìn)行復(fù)查，未見(jiàn)復(fù)發(fā)。紅酵母菌細(xì)胞壁因缺乏1，3-β-D-葡聚糖合成酶，對(duì)棘白菌素類(lèi)抗真菌藥物有天然耐藥作用[9]，故建議臨床治療中應(yīng)注意甄別致病菌類(lèi)型，根據(jù)致病菌種類(lèi)選擇合理藥物治療。人醫(yī)臨床上有研究表明，唑類(lèi)藥物特別是氟康唑?qū)t酵母菌的最小抑菌濃度普遍≥64 mg/L[10]，棘白菌素類(lèi)和/或氟康唑藥物治療下曾見(jiàn)紅酵母暴發(fā)感染[11]。但在本例中使用寵物用氟康唑和其他抗生素及時(shí)治療后能快速控制感染，可能與本次膠紅酵母感染川金絲猴屬皮膚感染型，危害性不大，相對(duì)深部感染更易治愈有關(guān)。朱敏等[12]曾報(bào)道1例女性患者因右乳房腫塊穿刺活檢術(shù)后致膠紅酵母菌感染，出現(xiàn)真菌血癥，未使用抗真菌藥物也自行痊愈。在本次感染案例中，發(fā)現(xiàn)該川金絲猴患病后，飼養(yǎng)人員便快速將患病猴隔離，更換條件更好的籠舍進(jìn)行飼養(yǎng)，加強(qiáng)護(hù)理，這些操作可能讓動(dòng)物自身抗病力有所提升而出現(xiàn)自愈。

經(jīng)實(shí)地觀察發(fā)現(xiàn)，患病川金絲猴被長(zhǎng)期飼養(yǎng)在地勢(shì)較低的籠舍中，存在通風(fēng)不良的情況，室內(nèi)籠舍相對(duì)陰暗潮濕。飼養(yǎng)員人員日常飼養(yǎng)管理內(nèi)容局限于衛(wèi)生清掃和飼喂，這些因素可能是形成此病的主要誘因。川金絲猴是典型性樹(shù)棲動(dòng)物，常年棲息在海拔1400～3300 m的常綠落葉闊葉林、針落葉混交林或針葉林中[13]。在我國(guó)南方地區(qū)圈養(yǎng)條件下雖不能完全復(fù)制野外環(huán)境條件，但應(yīng)在籠舍設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮籠舍朝向和結(jié)構(gòu)等因素，設(shè)計(jì)建設(shè)通風(fēng)和采光良好的籠舍，必要時(shí)需考慮利用儀器設(shè)備控制籠舍內(nèi)濕度，以減少環(huán)境條件性致病菌。在飼養(yǎng)管理中注意環(huán)境衛(wèi)生的清理和籠舍的消毒，可有效提升飼養(yǎng)環(huán)境質(zhì)量。在日常操作中應(yīng)注意運(yùn)用綜合性行為管理技術(shù)，加強(qiáng)動(dòng)物與飼養(yǎng)員之間的信任關(guān)系，減少圈養(yǎng)條件下的應(yīng)激反應(yīng)，提高動(dòng)物自身免疫力。這些措施都有助于減少動(dòng)物被條件性致病菌感染的概率。

4 結(jié)論

膠紅酵母雖屬罕見(jiàn)酵母菌，但作為條件性致病菌的一種，可引起如川金絲猴這類(lèi)野生動(dòng)物皮膚感染，結(jié)合病原菌分離鑒定的實(shí)驗(yàn)室診斷手段可幫助確診并合理選用治療藥物。在圈養(yǎng)環(huán)境中，野生動(dòng)物可能因硬件或軟件條件不足處于長(zhǎng)期慢性應(yīng)激壓力下而出現(xiàn)條件性致病菌感染，故圈養(yǎng)野生動(dòng)物應(yīng)為動(dòng)物提供通風(fēng)、采光、溫度、濕度均能良好控制的籠舍，與其自然棲息地條件相似，以科學(xué)尊重自然史的方式確定飼養(yǎng)管理程序，最大限度提高動(dòng)物福利，減少條件性致病菌感染的發(fā)病率。