丁酸對TNFα 所致腸上皮屏障損傷的保護(hù)作用

劉路瓊 ，陳 通 ，張永進(jìn) ，謝振榮 ，何成祿 ，黃永坤

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科;2）科研實(shí)驗(yàn)中心;3）樣本庫;4）檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

潰瘍性結(jié)腸炎是當(dāng)前的公共衛(wèi)生問題之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，影響患者的生活質(zhì)量，增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。該病以結(jié)腸粘膜和黏膜下層炎癥為特征，而腸粘膜上皮屏障作為機(jī)體和外界之間的第一道屏障，其功能紊亂與該病的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系[1]，因此，尋找可以改善腸屏障功能狀態(tài)的藥物對潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制及臨床研究均具有重要意義。

TNFα 被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的前炎癥因子之一，血清及結(jié)腸局部表達(dá)均升高[2]，參與該病的發(fā)生及發(fā)展，與腸上皮屏障功能密切相關(guān)[3]。研究證實(shí)，使用抗TNFα 的藥物可以明顯改善腸粘膜功能，提高患者的生活質(zhì)量[4]，進(jìn)一步證實(shí)TNFα 在潰瘍性結(jié)腸炎中的損傷作用。而丁酸不僅為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量，而且低濃度時(shí)促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增值，減輕炎癥反應(yīng)，改善上皮細(xì)胞間緊密連接，有助于維持腸上皮屏障的完整性和通透性[5]。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)證明，Caco2 細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下，可自發(fā)形成具有上下極性的單細(xì)胞層，其特征與腸粘膜上皮腸腔一側(cè)的分化特征類似，因而被廣泛用于體外評估腸上皮屏障功能[6]。但丁酸是否可以通過改善TNFα 誘導(dǎo)的腸上皮損傷減輕潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜損傷目前還不明確，為此，本實(shí)驗(yàn)通過探索TNFα 刺激Caco2 細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間，并以此為基礎(chǔ)探索丁酸對Caco2 細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用，之后探索TNFα 和丁酸共同作用于Caco2細(xì)胞時(shí)的最佳時(shí)間和濃度，并研究腸上皮屏障功能的通透性和緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)分布的變化情況，以期為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中腸上皮屏障損傷的基礎(chǔ)研究和探尋新治療方案作用機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

兔抗Occludin 多克隆抗體（[EPR20992]，1∶200，ab216327，Abcam），兔抗ZO-1 多克隆抗體（1∶500，ab96587，Abcam），山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1∶10 000，ab6721，Abcam），Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1 000，ab150081，Abcam），丁酸（107-92-6，Sigma），TNFα（HZ-1014，Proteintech），CCK-8 試劑盒（GK10001，GLPbio），Transwell 小室（3413，康寧），Trizol reagent（15596026，Invitrogen），RevertAid First Strand cDNA（91258333，Thermo Scientific），細(xì)胞爬片（YA0350，Solarbio），熒光酶標(biāo)儀（Victor Nivo，PerkinElmer），超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer，ThermoScientific），基因擴(kuò)增儀（Thermal Cycler T960，Heal Force），實(shí)時(shí)定量PCR 儀（QuantStudioTM5，Life Technologies Holding Pte Ltd），免疫熒光顯微鏡（N-SIM/C2si，Nikon）。

1.2 Caco2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

人結(jié)腸癌Caco2 細(xì)胞株來自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（PHCbi，MCO-18AC，USP No.6244103，普和希株式會(huì)社），Caco2 細(xì)胞使用含10%胎牛血清（F8318-500 mL，Sigma）的DMEM/F12 培養(yǎng)基（C11330500BT，Gibco）培養(yǎng)，之后置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后棄原有培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次后用0.25%EDTA 胰酶（25200114，Gibco）消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后按實(shí)驗(yàn)方案接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定貼壁備用。

（1）TNFα 實(shí)驗(yàn)分組：加入不同濃度的TNFα 工作液，使其在反應(yīng)體系的終濃度為0，20，50，100，200，500 和1 000 ng/mL，分別作用0，12，24，36，48，60，72 h。

（2）丁酸實(shí)驗(yàn)分組：丁酸在反應(yīng)體系的終濃度為0，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20 mM/L，分別作用36，48 和60 h。

1.3 CCK-8 檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞接種于96 孔板中培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同干預(yù)。每孔加含有10%的CCK-8 的無血清培養(yǎng)基100 μL，37℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測TNFα 和丁酸作用后450 nm 處的OD 值。結(jié)果通過細(xì)胞增殖活力計(jì)算得到：細(xì)胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）]x100。其中A（加藥）代表有培養(yǎng)基，細(xì)胞，藥物和CCK-8的孔的OD 值，A（0 加藥）代表有培養(yǎng)基，細(xì)胞和CCK-8 的孔的OD 值，A（空白）代表有培養(yǎng)基和CCK-8 的孔的OD 值。1 次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行孔，各組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 單層上皮屏障FITC-dextran 滲透性檢測

Caco2 細(xì)胞（1×104/200 μL）接種于Transwell 24 孔板中的上室內(nèi)，下室內(nèi)加入1.5 mL 新鮮培養(yǎng)基，Caco2 細(xì)胞接種穩(wěn)定貼壁后，隔日更換培養(yǎng)基，待培養(yǎng)21 d 后，按照實(shí)驗(yàn)分組，予TNFα（終濃度為100 ng/mL）和丁酸（終濃度為0.2 mM/L）干預(yù)48 h。將細(xì)胞原培養(yǎng)基吸出，上室換成含有終濃度為1 mg/mL 的FITC-dextran 的無血清培養(yǎng)基100 μL，下室換為無血清培養(yǎng)基1 mL，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃孵育2 h 后從下室吸取100 μL 培養(yǎng)基到熒光酶標(biāo)儀上檢測。根據(jù)已知濃度梯度的稀釋液的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FITC-dextran 的透過率。

1.5 RT-qPCR 檢測不同干預(yù)細(xì)胞ZO-1 和Occludin 的mRNA 表達(dá)量

取出細(xì)胞后棄舊培養(yǎng)基，PBS 清洗1 次，按照TRIzol 試劑說明書提取不同因素干預(yù)的Caco2細(xì)胞的總RNA，超微量分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度。用RevertAid First Strand cDNA 試劑盒以2 μg 總RNA 為模板在基因擴(kuò)增儀制備cDNA。之后以cDNA 為模板，采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀，SYBR Green 熒光染料進(jìn)行相對定量。在20 μL 反應(yīng)體系中，加入cDNA 模板2 μL，無酶水6.0 μL，SYBR Premix 熒光定量反應(yīng)試劑10 μL，上游、下游引物各1.0 μL。該實(shí)驗(yàn)設(shè)定的反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2 min；PCR 反應(yīng)階段：95℃變性15 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，重復(fù)變性，退火及延伸，共循環(huán)40 次；溶解曲線為95℃15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如下：ZO-1：上游（5′-3′）：ACCAGTAAGTCGTCC TGATCC，下游（5′-3′）：TCGGCCAAATCTTCTCAC TCC；Occludin：上游（5′-3′）：ACAAGCGGTTTTA TCCAGAGTC，下游（5′-3′）：GTCATCCACAGGCGA AGTTAAT；GAPDH（5′-3′）：上游：CATGAGAAGT ATGACAACAGCCT，下游（5′-3′）：AGTCCTTCCAC GATACCAAAGT，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算得出結(jié)果。

1.6 免疫熒光檢測ZO-1，Occludin 在Caco2細(xì)胞中的表達(dá)與分布

各組細(xì)胞經(jīng)過PBS 清洗1 次后，用預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞爬片5 min，PBS 清洗1 次，之后用0.3% Triton-X100 室溫孵育10 min，而后PBS 再次清洗1 次。10%山羊血清封閉1 h，PBS 清洗1 次，而后孵育一抗（ZO-1，1∶500；Occludin，1∶200），于4℃冰箱過夜，次日37℃孵育箱或室溫復(fù)溫后，PBS 清洗3 次，二抗孵育1 h，PBS清洗3 次，最后用含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察，拍照并用Image J 進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，統(tǒng)計(jì)和分析及繪圖。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示正態(tài)分布的計(jì)量資料，多組間比較采用AVONA 方差分析，組間2 組比較采用Dunnett’s法，而析因設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)采用析因方差分析，組間2 組比較采用Tukey 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸保護(hù)TNFα 所致Caco2 細(xì)胞單層屏障損傷

2.1.1 TNFα 對Caco2 細(xì)胞存活率的影響CCK-8 檢測細(xì)胞存活率結(jié)果表明，不同終濃度TNFα（0，20，50，100，200，500，1 000）ng/mL作用于Caco2 細(xì)胞（0，12，24，36，48，60，72）h后，與0 ng/mL TNFα 組相比，（20，50，100）ng/mL TNFα 組的細(xì)胞存活率隨著TNFα 濃度的增加而降低，而（200，500，1 000）ng/mL TNFα 干預(yù)后細(xì)胞存活率下降不明顯；與0 h 相比，隨著作用時(shí)間延長，Caco2 細(xì)胞存活率逐漸下降，之后細(xì)胞存活率下降速度明顯減慢。20 ng/mL TNFα 組作用24，36，48，60 h 后細(xì)胞的存活率分別為：（91.807±0.018）%，（82.979±0.041）%，（72.675±0.015）%，（67.987±0.012）%；50 ng/mLTNFα 組作用24，36，48，60 h 后細(xì)胞的存活率分別為：（77.205±0.026）%，（69.885±0.027）%，（53.903±0.112）%，（46.266±0.032）%；100 ng/mL TNFα組作用24，36，48，60 h 后細(xì)胞的存活率分別為：（62.927±0.019）%，（55.524±0.032）%，（34.429±0.008）%，（29.674±0.012）%；200 ng/mL TNFα組作用24，36，48，60 h 后細(xì)胞的存活率分別為：（60.098±0.018）%，（51.074±0.028）%，（27.407±0.099）%，（23.748±0.077）%。隨著TNFα 濃度越高作用時(shí)間越長，細(xì)胞的存活率越低，100 ng/mL作用48 h 與36 h 和60 h 分別相比，P<0.000 1；200 ng/mL TNFα 作用48 h 與36 h 和60 h 相比，分別為P<0.000 1 和P<0.01。相比TNFα 作用36 h 和60 h，TNFα 作用48 h 誘發(fā)更加明顯的細(xì)胞存活率下降幅度；與200 ng/mLTNFα 作用48 h相比，100 ng/mL TNFα 誘發(fā)Caco2 細(xì)胞存活率下降的幅度更大。故選擇100 ng/mL TNFα 作用48 h 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)條件，見圖1A。

圖1 丁酸和TNFα 對Caco2 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The effect of butyric acid and TNFα on the survival rate

2.1.2 不同濃度丁酸作用不同時(shí)間對Caco2 細(xì)胞存活率的影響由于100 ng/mL TNFα 作用時(shí)間48 h 后可以明顯降低Caco2 細(xì)胞存活率，因而，進(jìn)一步研究不同終濃度丁酸作用36，48 和60 h后對Caco2 細(xì)胞存活率的影響。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)丁酸的終濃度為0～0.2 mM/L 時(shí)，隨著濃度的增加，丁酸促進(jìn)細(xì)胞增值的能力越強(qiáng)，但其終濃度大于0.5 mM/L 時(shí)，降低細(xì)胞存活率；在丁酸的終濃度波動(dòng)在0～0.5 mM/L 范圍內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長，不同濃度丁酸提高Caco2 細(xì)胞存活率的作用越來越弱。在丁酸終濃度為0.2 mM/L 時(shí)，作用36，48 和60 h 均可以明顯促進(jìn)Caco2 細(xì)胞的增值，細(xì)胞存活率分別為（120.953±0.118）%，（113.793±0.054）%，（109.098±0.035）%，3 組間相互比較，P<0.000 1，見圖1B。

2.1.3 丁酸和TNFα 共同作用時(shí)對Caco2 細(xì)胞存活率的影響由于終濃度為100 ng/mL 的TNFα 作用48 h 后能明顯降低細(xì)胞存活率，且不同濃度丁酸刺激Caco2 48 h 后已經(jīng)可以明顯提高細(xì)胞存活率，為此，在形成單層屏障的Caco2 細(xì)胞中同時(shí)加入終濃度為100 ng/mL 的TNFα 和不同濃度丁酸（0.05，0.1，0.2，0.5 mM/L）作用48 h。CCK-8 細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)丁酸與TNFα 共同作用48 h 后，TNFα 降低細(xì)胞存活率的作用被抑制，提示丁酸可以抑制TNFα 對細(xì)胞的損傷。丁酸終濃度為0.05～0.2 mM/L 之間時(shí)，丁酸的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)。與0 mM/L 組（100.007±0.219）%相比，0.05，0.1，0.2 mM/L 丁酸組的細(xì)胞存活率分別為（109.388±0.127）%（P<0.000 1），（122.416±0.131）%（P<0.000 1），（146.288±1.188）%（P<0.000 1）。丁酸終濃度大于0.2 mM/L時(shí)，對TNFα 所致的損傷仍有保護(hù)作用（P<0.000 1），但保護(hù)作用呈下降趨勢，見圖1C。為此，確定終濃度為100 ng/mL 的TNF 和0.2 mM/L的丁酸作用48 h 作為后續(xù)研究Caco2 的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 TNFα 和丁酸對Caco2 生長情況的影響

倒置顯微鏡下觀察：丁酸和TNFα 干預(yù) 48 h后，對照組和丁酸干預(yù)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞間連接緊密，邊界清晰，丁酸組更明顯；丁酸和TNFα 共同干預(yù)組和TNFα 干預(yù)組細(xì)胞生長狀態(tài)欠佳，密度減低，出現(xiàn)皺縮，邊界不清晰，與周圍細(xì)胞脫離，TNFα 干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量改變更加明顯，見圖2。

圖2 TNFα 和丁酸干預(yù)Caco2 細(xì)胞48 h 后對細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)的影響（標(biāo)尺=200 μm）Fig.2 The morphology and growth of Caco2 cells after 48 h of intervention of TNF α and butyric acid（scale bar=200 μm）

2.3 TNFα 和丁酸對Caco2 細(xì)胞所形成的的單層上皮屏障滲透性的影響

與對照組Transwell 下室內(nèi)的FITC-dextran 的濃度（3.337±0.125 3 ）μg/mL 相比，丁酸干預(yù)組中的FITC-dextran 濃度（3.013±0.012 62 ）μg/mL 下降（P<0.05），而TNFα 和丁酸共同干預(yù)組和TNFα 干預(yù)組中的FITC-dextran 濃度（6.301±0.040 62 ）μg/mL 升高（P<0.000 1），TNFα 干預(yù)組更甚（P<0.000 1）；與TNFα 和丁酸共同干預(yù)組，TNFα 干預(yù)組的濃度（8.291±0.060 87 ）μg/mL 升高更加明顯（P<0.000 1）。證明丁酸可以減輕TNFα 所致的Caco2 細(xì)胞單層屏障FITC-dextran的升高，見圖3。

圖3 TNFα（100 ng/mL）和丁酸（0.2 mM/L）共同作用48 h對Caco2 單層上皮屏障滲透性的影響Fig.3 The combined effect of TNFα（100 ng/mL）and butyric acid（0.2 mM/L）on the permeability of the Caco2 monolayer epithelial barrier after 48 hours

2.4 TNFα 和丁酸對 Caco2 細(xì)胞 ZO-1 和Occludin mRNA 表達(dá)的影響

RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)：TNFα 和丁酸作用48 h 后，與對照組相比，丁酸干預(yù)組ZO-1 的mRNA 表達(dá)變化不大（P >0.05），TNFα 和丁酸共同干預(yù)組中ZO-1 表達(dá)量較對照組無差異，而TNFα 單獨(dú)干預(yù)組ZO-1 的mRNA 表達(dá)降低（P<0.05）；與TNFα 干預(yù)組相比，TNFα 和丁酸共同干預(yù)組中ZO-1 表達(dá)量升高（P<0.01），見圖4A；與對照組相比，丁酸干預(yù)組基因的表達(dá)升高（P<0.05），丁酸和TNFα 組共同干預(yù)和TNFα 干預(yù)組的表達(dá)下降（分別為P<0.05 和P<0.01），而丁酸和TNFα 共同干預(yù)組Occludin 的mRNA 表達(dá)高于TNFα 干預(yù)組（P<0.01）。證明丁酸可以減輕TNFα 所致的Caco2 緊密連接蛋白表達(dá)量減少，見圖4B。

圖4 TNFα 和丁酸單獨(dú)或共同作用48 h 對Caco2 細(xì)胞緊密連接蛋白的mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 The mRNA expression of tight junction proteins in Caco2 cells after exposure to TNF α or butyric acid for 48 h

2.5 TNFα 刺激對Caco2 細(xì)胞ZO-1 和Occludin在細(xì)胞的表達(dá)和分布的影響

免疫熒光顯示：TNFα 刺激減少細(xì)胞數(shù)量，下調(diào)ZO-1 和Occludin 的表達(dá)量并擾亂ZO-1 和Occludin 在細(xì)胞內(nèi)的定位，使其更加接近細(xì)胞核，細(xì)胞膜和膜周分布減少，細(xì)胞間連接變得松散，不均勻，甚至出現(xiàn)斷裂。而丁酸能夠增加細(xì)胞數(shù)量并ZO-1 和Occludin 的表達(dá)量，使其在細(xì)胞膜和膜周分布更加緊密，細(xì)胞連接完整，減輕TNFα 所致的細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞間連接狀態(tài)，見圖5～圖6。

圖5 TNFα 和丁酸和作用48h 后Caco2 細(xì)胞ZO-1 表達(dá)和分布的變化（免疫熒光染色，放大倍數(shù)為×800，DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色，ZO-1 染為綠色）Fig.5 The expression and distribution of ZO-1 on Caco2 cells after exposure to TNF α and Butyric acid for 48 hours（immunofluorescence staining，magnification at ×800，DAPI labeled nucleus as blue，ZO-1 stained as green）

圖6 丁酸和TNFα 作用48 h 后Caco2 細(xì)胞Occludin 表達(dá)和分布的變化（免疫熒光染色，放大倍數(shù)為800 倍，DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色，Occludin 染為綠色）Fig.6 The expression and distribution of Occludin on Caco2 cells after exposure to TNF α and Butyric acid for 48 hours（immunofluorescence staining，magnification at ×800，DAPI labeled nucleus as blue，Occludin stained as green）

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸上升，死亡率也在增加，社會(huì)負(fù)擔(dān)加重。發(fā)病過程中，腸粘膜及黏膜下層受到累及，腸道菌群及菌群代謝產(chǎn)物發(fā)生明顯的改變。它們之間的相互作用影響患者對治療的反應(yīng)及預(yù)后[7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，低濃度丁酸可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長，改善其存活率及生長狀態(tài)，維持腸上皮屏障的完整性，增加緊密連接蛋白ZO-1和Occludin 的mRNA 表達(dá)，并維持其在細(xì)胞內(nèi)的正常分布，從而減輕TNFα 所致的腸上皮屏障損傷。

3.1 潰瘍性結(jié)腸炎病理特點(diǎn)

由于潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥局限于黏膜和黏膜下層，因而，結(jié)腸上皮細(xì)胞在該病的發(fā)病過程中扮演重要角色[8]。結(jié)腸上皮屏障主要由單層腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接蛋白組成[9]。其維持腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的功能與腸粘膜屏障的連續(xù)性密切相關(guān)，其功能失調(diào)是導(dǎo)致腸粘膜通透性增加的關(guān)鍵因素，也是介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[10]。緊密連接由Occludin，Claudin，和ZO 等蛋白構(gòu)成，Occludin 與ZO-1 結(jié)合組成緊密連接的基礎(chǔ)，其相互作用影響著緊密連接的完整性。Occludin 具有封閉細(xì)胞間隙、調(diào)控細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)等作用，而ZO-1 影響細(xì)胞的增值、分化和生長，調(diào)控者細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和滲透[11]。FITC-dextran 作為一種熒光物質(zhì)，可以用來反映腸上皮屏障的完整性和通透性[12]，當(dāng)腸上皮屏障損傷后，該物質(zhì)在Caco2 形成的單層上皮屏障中的透過率增加，而完整的上皮結(jié)構(gòu)可以明顯降低FITC-dextran 的透過率。

3.2 潰瘍性結(jié)腸炎與TNFα

潰瘍性結(jié)腸發(fā)病過程中，炎癥因子所發(fā)生的級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致如TNFα、IL-12 等前炎癥因子的產(chǎn)生，隨即通過胞內(nèi)蛋白（如JAK 等）進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[13]。TNFα 與潘氏細(xì)胞的壞死，血管形成，巨噬細(xì)胞的活化和T 細(xì)胞的活化有關(guān)，隨著該病所處的階段而變化，個(gè)體間也存在差異。且TNFα在維持腸道完整性及腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[14]。因而，成為眾多當(dāng)前治療的作用靶點(diǎn)之一[15-16]?？筎NFα 的治療也被證實(shí)在炎癥性腸病中有治療效果[17]，但具體的作用機(jī)制并不明確。故而本實(shí)驗(yàn)中直接選擇TNFα 作為刺激因素，借助Caco2 細(xì)胞構(gòu)建體外腸屏障損模型進(jìn)一步探討TNFα 對Caco2 的作用，為后續(xù)的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中20，50，100 ng/mL 的TNFα 可以明顯降低Caco2 細(xì)胞存活率，以100 ng/mL 濃度作用48 h 明顯。TNFα 刺激Caco2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞生長狀態(tài)欠佳，細(xì)胞間連接變得松散，F(xiàn)ITC-dextran 的滲透增加，細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達(dá)下降，在細(xì)胞內(nèi)的分布也發(fā)生改變，排列雜亂。

3.3 丁酸與腸上皮緊密連接

丁酸是一種短鏈脂肪酸，由結(jié)腸微生物發(fā)酵未被分解的碳水化合物獲得，為腸粘膜上皮細(xì)胞提供其所需的60%～70%的能量，且有助于穩(wěn)定腸道PH 值，腸道菌群及腸道電解質(zhì)等，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增值，還可以通過識(shí)別G 蛋白偶聯(lián)受體和過氧化物酶受體，影響炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，也可以抑制嚴(yán)重因子的表達(dá)，促進(jìn)抗菌肽分泌，維持腸上皮的完整性，從而緩解潰瘍性結(jié)腸炎[18]。丁酸可以介導(dǎo)AMPK 磷酸化，抑制MLC2 磷酸化，促進(jìn)ZO-1 形成緊密連接，修復(fù)屏障障礙，改善腸上皮的結(jié)構(gòu)及功能，調(diào)控腸粘膜的通透性[19-20]。因而，丁酸在促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增值，維持腸上皮細(xì)胞的完整性中發(fā)揮重要作用。在雙盲，以安慰劑為對照的小規(guī)模研究中，發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)治療基礎(chǔ)上服用丁酸鈉微型膠囊2 月的潰瘍性結(jié)腸炎患者生活質(zhì)量得到明顯改善[21]。在DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，提前給予丁酸鈉干預(yù)，可以減輕腸道炎癥并改善腸上皮屏障通透性及增加ZO-1 的表達(dá)[22]。而本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度丁酸作用下，低終濃度時(shí)（0～0.5 mM/L）提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞生長，高濃度時(shí)則表現(xiàn)出相反的作用，證實(shí)低濃度丁酸對腸粘膜屏障具有保護(hù)作用。0～0.5 mM/L 終濃度丁酸作用36，48 和60 h 后均可促進(jìn)細(xì)胞增生，0.2 mM/L 終濃度丁酸發(fā)揮最大效應(yīng)。

當(dāng)TNFα 與丁酸同時(shí)作用時(shí)，細(xì)胞的存活率可得到明顯改善，證明丁酸可以拮抗TNFα 對細(xì)胞的損傷。當(dāng)TNFα 和丁酸共同作用48h 后Caco2 細(xì)胞的存活率得到改善，細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)好轉(zhuǎn)，降低的FITC-dextran 的通透性得到提高，ZO-1 和Occludin 的mRNA 表達(dá)量增加，在細(xì)胞的分布較TNFα 單獨(dú)作用明顯改善，意味著Caco2 細(xì)胞皮屏障功能損傷減輕，進(jìn)一步證實(shí)丁酸可以減輕TNFα 所致腸上皮屏障損傷。

綜上所述，丁酸可以提高腸上皮細(xì)胞的存活率，改善其生長狀態(tài)，降低腸上皮的滲透性并維持細(xì)胞間緊密連接，有效減輕TNFα 所致的腸屏障損傷。本研究存在的不足之處在于：本研究重點(diǎn)關(guān)注在TNFα 和丁酸干預(yù)后Caco2 的形態(tài)及屏障功能狀態(tài)變化，尚未進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究，需要更深的實(shí)驗(yàn)加于明確。另外，本實(shí)驗(yàn)只針對Caco2 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而腸上皮細(xì)胞株還有很多，需要進(jìn)一步明確TNFα 和丁酸對其它腸道細(xì)胞株的影響?？傊狙芯刻接懥硕∷釋NFα 所致Caco2 單層細(xì)胞屏障功能損傷的影響，為進(jìn)一步明確丁酸在潰瘍性結(jié)腸炎治療中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。