混菌發(fā)酵對(duì)西拉葡萄酒香氣品質(zhì)的影響

邢家愛，于慶泉，李福東，鎖然，黨超，王頡*，劉亞瓊*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.中糧長城桑干酒莊（懷來）有限公司，河北 張家口 075400）

西拉（Syrah）葡萄原產(chǎn)于法國羅訥河谷，是世界第四大紅色釀酒品種，我國第五大紅色釀酒品種。近幾年西拉葡萄在我國的種植面積穩(wěn)步增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016 年我國西拉葡萄種植面積約1 000 hm2，占世界該品種栽培面積的0.6%。西拉所釀葡萄酒因具有濃郁的漿果香、烤肉味以及黑胡椒香氣特征而深受消費(fèi)者喜愛[1]。但國內(nèi)關(guān)于西拉葡萄酒的風(fēng)味研究相對(duì)較少，主要涉及栽培技術(shù)對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響以及陳釀條件對(duì)西拉葡萄酒品質(zhì)的影響[1-3]，酵母菌種對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)的影響尚不明確。

葡萄酒的酒精發(fā)酵是涉及多種微生物復(fù)雜生化反應(yīng)的過程，作為主導(dǎo)微生物的酵母菌的種類以及菌種間的相互作用均會(huì)影響代謝物的種類和含量[4-5]。目前，葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)廣泛使用商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行酒精發(fā)酵以便最大程度地保證發(fā)酵的順利完成，并獲得穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量，但這在一定程度上削弱了葡萄酒的產(chǎn)區(qū)獨(dú)特性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，本土微生物菌群更適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂?、土壤和微生態(tài)條件，應(yīng)用本土酵母菌進(jìn)行發(fā)酵有利于增強(qiáng)葡萄酒風(fēng)味多樣性和產(chǎn)區(qū)典型性[8-9]。葡萄生長環(huán)境中存在著多種非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），其分泌的糖苷酶可促進(jìn)葡萄汁中的糖苷前體物質(zhì)水解生成揮發(fā)性香氣化合物，但難以單獨(dú)完成酒精發(fā)酵，通常與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵以改善葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)[10-12]。研究表明，戴爾有孢圓酵母參與發(fā)酵能提高苯乙醇、辛酸乙酯和癸酸乙酯等的含量，增強(qiáng)馬瑟蘭葡萄酒的花果香味[13]。美極梅奇酵母與S.cerevisiae 混合發(fā)酵提高了澳大利亞西拉葡萄酒中乙酸苯乙酯、庚酸乙酯和芳樟醇等的含量，賦予葡萄酒愉悅的風(fēng)味[14]。Mestre等[15]報(bào)道稱，順序接種有孢漢遜酵母和S.cerevisiae 的馬爾貝克葡萄酒中乙酸異戊酯、己酸乙酯和γ-丁內(nèi)酯的含量高于釀酒酵母單菌發(fā)酵的葡萄酒，對(duì)葡萄酒的感官特性有積極影響。然而，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)國產(chǎn)西拉葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)的影響研究鮮有報(bào)道。

本研究以懷來產(chǎn)區(qū)西拉葡萄為原料，選用本土美極梅奇酵母和本土葡萄汁有孢漢遜酵母及商業(yè)戴爾有孢圓酵母，分別與釀酒酵母F15 按照不同接種方案進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，探究混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)、揮發(fā)性香氣成分以及感官品質(zhì)的影響，旨在為非釀酒酵母對(duì)西拉葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)的改善研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西拉葡萄：2021 年10 月采自河北懷來桑干酒莊葡萄園，還原糖含量242.6 g/L，可滴定酸含量（以酒石酸計(jì)）5.67 g/L。

釀酒酵母（S.cerevisiae）F15：法國LAFFORT 公司；商業(yè)戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）：安琪酵母股份有限公司； 本土美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、本土葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）：均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬加工貯藏實(shí)驗(yàn)室前期在懷來產(chǎn)區(qū)篩得，保藏于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院。

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基時(shí)加入），高壓滅菌20 min。

葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁高壓滅菌20 min。

果膠酶（食品級(jí)，8 600 PGNU/g）：法國LAFFORT公司；偏重亞硫酸鉀、氯化鈉（食品級(jí)）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；磷酸氫二鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B -5977A 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP -INNOWAX 色譜柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent公司；57328-U 固相微萃取儀：美國Supelco 公司；Wine Scan FT 120 葡萄酒成分分析儀：丹麥FOSS 公司；SPX 生化培養(yǎng)箱：寧波東南儀器有限公司；HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TU-1810 紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母培養(yǎng)

商業(yè)釀酒酵母菌株的活化：稱取S.cerevisiae F15活性干粉（100 mg/L），將其溶于10 倍體積的37 ℃的無菌水中活化20 min。稱取T.delbrueckii 活性干粉（200 mg/L），將其溶于10 倍體積的25 ℃的無菌水中活化20 min。

本土非釀酒酵母菌株的活化：從YPD 固體培養(yǎng)基上挑取M.pulcherrima 和H.uvarum 的單菌落分別接入YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以2%的接種量接種到葡萄汁培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h 后以2%的接種量進(jìn)行酒精發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵試驗(yàn)

西拉葡萄除梗破碎后加入20 mg/L 果膠酶，50 mg/L偏重亞硫酸鉀，分裝于5 L 玻璃發(fā)酵罐中，每罐約3.5 L西拉葡萄醪，低溫浸漬48 h，按照表1 的接種方案接入酵母種子液，15～25 ℃發(fā)酵，每個(gè)處理3 組平行。每天監(jiān)測(cè)發(fā)酵液比重，當(dāng)比重降至0.996 時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)呛?，?dāng)殘?zhí)呛啃∮? g/L 時(shí)，分離皮渣，從每個(gè)發(fā)酵罐中取200 mL 酒樣，于-20 ℃保存待測(cè)。

表1 發(fā)酵試驗(yàn)接種方案Table 1 Inoculation programme of fermentation test

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 基本理化指標(biāo)

酒精度、還原糖含量、總酸含量、pH 值和甘油含量等基本理化指標(biāo)利用葡萄酒成分分析儀測(cè)定，透射掃描波數(shù)5 012～926 cm-1。

色度及色調(diào)：參考李運(yùn)奎等[16]的方法測(cè)定。酒樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，配制與酒樣相同pH 值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將酒樣稀釋10 倍，將待測(cè)樣品放入1 cm 比色皿中，分別測(cè)定其在波長420、520、620 nm下的吸光值A(chǔ)420、A520、A620，色度為三者之和，色調(diào)為A420與A520的比值。

1.4.2 揮發(fā)性香氣化合物

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)，參照夏亞男等[17]的方法并稍作改動(dòng)。吸取8 mL待測(cè)酒樣于20 mL 樣品瓶中，同時(shí)加入10 μL 的3-辛醇（300 mg/L）和2 g NaCl，立即蓋緊瓶蓋密封。40 ℃水浴平衡15 min 后，將萃取頭插入樣品瓶頂空部分吸附40 min，于氣相色譜儀進(jìn)樣口解吸6 min。

色譜條件：升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速率升溫至80 ℃，再以5 ℃/min 速率升溫至230 ℃，持續(xù)6 min。進(jìn)樣口溫度為240 ℃，不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)譜掃描范圍m/z 35～550。

定性與定量分析：利用質(zhì)譜掃描圖譜與NIST14.L譜庫進(jìn)行比對(duì)定性，對(duì)匹配度為80%以上的組分進(jìn)行分析。各成分的含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，選用3-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

1.4.3 感官評(píng)價(jià)

品評(píng)小組由7 名經(jīng)驗(yàn)豐富的品酒師和5 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的品評(píng)人員組成，采用盲品的方式。在光線充足、通風(fēng)良好、無異味的房間內(nèi)進(jìn)行3 輪。分別從外觀（澄清度、色澤）、香氣（花香、果香、酒精味）、口感（酸度、甜度、收斂性）和整體評(píng)分4 個(gè)方面對(duì)酒樣進(jìn)行評(píng)價(jià)，按照10 分制強(qiáng)度等級(jí)進(jìn)行打分，評(píng)分范圍從0（弱）到10（強(qiáng)），感官評(píng)價(jià)結(jié)果為所有評(píng)估小組成員得分的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS26 軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較，顯著性水平P＜0.05；使用Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵過程中比重的變化

不同處理酒樣的比重變化如圖1 所示。

圖1 酒精發(fā)酵過程比重的變化Fig.1 Change of specific gravity during alcohol fermentation

由圖1 可知，各處理酒樣的比重隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈持續(xù)下降趨勢(shì)，不同處理酒樣的比重下降速率存在差異。發(fā)酵前3 d，各處理酒樣比重下降均較緩慢，變化不明顯。隨后比重快速下降，從發(fā)酵第10 天開始各處理酒樣比重下降速率趨緩，發(fā)酵12 d 時(shí)F15 處理酒精發(fā)酵結(jié)束，15 d 時(shí)其余處理均完成酒精發(fā)酵，且所有處理最終達(dá)到相似比重?；旌习l(fā)酵延長了酒精發(fā)酵時(shí)間，這與Hranilovic 等[14]的研究結(jié)果一致。

2.2 不同處理對(duì)西拉葡萄酒基本理化指標(biāo)的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒樣的基本理化指標(biāo)如表2 所示。

表2 酒精發(fā)酵后酒樣的基本理化指標(biāo)Table 2 Basic physical and chemical indexes of wine samples after alcohol fermentation

由表2 可知，5 個(gè)處理的還原糖含量均小于4 g/L，混合發(fā)酵處理的酒精度（12.54% vol～12.74% vol）均顯著低于F15 處理（13.06% vol）（P＜0.05），這與宋茹茹等[18]的研究結(jié)果一致。非釀酒酵母通過氧化消耗葡萄糖生成除乙醇外的其他代謝產(chǎn)物，從而降低酒樣的乙醇含量[19]。此外，混合發(fā)酵的葡萄酒中甘油含量提高了12.3%～15.3%，甘油可以增加葡萄酒的黏度，賦予葡萄酒圓潤的口感和豐滿的酒體。相關(guān)研究顯示，非釀酒酵母具有較強(qiáng)的產(chǎn)甘油能力，如H.uvarum 與S.cerevisiae混合發(fā)酵的甘油含量高于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵[20]?；旌习l(fā)酵顯著提高了葡萄酒色度（P＜0.05），這可能與混合發(fā)酵處理丙酮酸含量增加有關(guān)，丙酮酸與花色苷形成色素vitisin A，有助于增加色素穩(wěn)定性[21]。與單菌發(fā)酵相比，混合發(fā)酵葡萄酒的色調(diào)顯著降低（P＜0.05），顏色更偏向紅色，這與梁麗紅等[22]的研究結(jié)果一致。

2.3 香氣成分分析

不同處理對(duì)西拉葡萄酒揮發(fā)性香氣化合物的影響如表3 所示。

表3 不同試驗(yàn)處理葡萄酒的香氣成分及其含量Table 3 Aroma components and their contents in wine samples with different test treatments

由表3 可知，供試酒樣共檢測(cè)出37 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括17 種酯類（其中乙酸酯類5 種、乙醇酯類10 種以及其他酯類2 種）、10 種高級(jí)醇類、4 種脂肪酸類和6 種其他類化合物。不同處理對(duì)西拉葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的影響差異較大，其中FM 香氣物質(zhì)含量最高，為27 787.61 μg/L，對(duì)照F15 香氣物質(zhì)含量最低，為23 254.24 μg/L。

酯類物質(zhì)是葡萄酒中重要的風(fēng)味組成成分，主要包括乙酸酯和乙醇酯，它們能夠?yàn)槠咸丫茙碛鋹偟幕ㄏ愫凸阄禰23]。本試驗(yàn)各處理酒樣中酯類總含量從高到低依次是FM＞FH＞FN＞FMH＞F15，混合發(fā)酵有利于提升酯類產(chǎn)量，這與李毅麗等[24]的研究結(jié)果一致。與對(duì)照F15 相比，混合發(fā)酵處理乙酸異戊酯含量提高了54.2%～204.2%，且含量均超過其閾值，增強(qiáng)了葡萄酒的果香特征。乙酸苯乙酯可以賦予葡萄酒梔子花香和玫瑰花香，本試驗(yàn)FM 酒樣中乙酸苯乙酯含量明顯高于其他處理。此前有研究發(fā)現(xiàn)M.pulcherrima 與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵提高了葡萄酒中乙酸苯乙酯的含量[25]。供試酒樣中共檢測(cè)出10 種乙醇酯類化合物，其中辛酸乙酯（梨香、菠蘿）、癸酸乙酯（椰子味、果香）和己酸乙酯（青蘋果、草莓、香蕉）含量較高，對(duì)葡萄酒的果香有重要貢獻(xiàn)，混合發(fā)酵均提高了己酸乙酯的含量。

高級(jí)醇是酵母代謝的副產(chǎn)物之一，在氨基酸或糖的作用下，通過Ehrlich 途徑和葡萄糖合成代謝途徑生成[26]，對(duì)葡萄酒香氣有重要影響。當(dāng)含量低于300 mg/L時(shí)會(huì)增加葡萄酒的香氣復(fù)雜性，當(dāng)含量過高時(shí)則會(huì)給葡萄酒帶來負(fù)面影響[27]。由表3 可知，混合發(fā)酵顯著提高了苯乙醇含量（P＜0.05），其中FN 酒樣中苯乙醇含量最高，是F15 處理的2.29 倍，賦予葡萄酒玫瑰、蜂蜜、丁香花的香氣。混合發(fā)酵酒樣的異丁醇含量為對(duì)照的1.71 倍～3.86 倍，李毅麗等[24]和夏鴻川等[28]的研究也得到相似結(jié)果。此外，僅在FM 和FH 酒樣中檢測(cè)到辛醇，給葡萄酒帶來了茉莉花香和檸檬香味。

葡萄酒中的脂肪酸對(duì)香氣平衡起重要作用，低濃度時(shí)能賦予葡萄酒奶酪、黃油等香氣特征，高濃度則會(huì)有醋酸味和刺激味[29]。本試驗(yàn)共檢測(cè)出4 種脂肪酸，與對(duì)照F15 相比，混合發(fā)酵處理顯著降低了酒樣中揮發(fā)性脂肪酸總量，同時(shí)混合發(fā)酵處理的葡萄酒中辛酸和己酸的含量明顯減少。這與宋茹茹等[18]的研究結(jié)果一致，T.delbrueckii 與釀酒酵母混合發(fā)酵顯著降低了辛酸含量，有利于減少葡萄酒的酸敗味。萜類物質(zhì)具有較低閾值，對(duì)葡萄酒中花香和水果香有重要貢獻(xiàn)[30]。本試驗(yàn)中測(cè)得的萜烯類化合物有香茅醇和β-香茅醇，其中β-香茅醇只在對(duì)照F15 中檢測(cè)出，而香茅醇含量在各處理中差異不明顯。

不同處理香氣物質(zhì)的主成分（principal component，PC）分析如圖2 所示。

圖2 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds

由圖2 得知，PC1 的貢獻(xiàn)率為50.2%，PC2 的貢獻(xiàn)率為23.5%，總貢獻(xiàn)率為73.7%。各處理在圖中彼此分離，F(xiàn)15 處理與順序接種發(fā)酵處理分別位于PC1 的左右兩側(cè)且相距較遠(yuǎn)，說明混合發(fā)酵處理改變了葡萄酒的香氣輪廓。其中F15 位于PC1 的正方向和PC2 的負(fù)方向上，主要有Y12（棕櫚酸乙酯）、Y35（β-香茅醇）、Y30（癸酸）和Y16（己酸異戊酯)等香氣成分。而混合發(fā)酵處理組均位于PC1 的負(fù)方向上，其中FMH 位于PC2 的負(fù)方向上，與Y27（丙醇）、Y20（壬醇）、Y13（9-癸烯酸乙酯）和Y37（2，4-二叔丁基苯酚）相關(guān)性強(qiáng)；FN、FM 和FH 位于PC2 的正方向上，酒樣中Y3（乙酸苯乙酯）、Y10（己酸乙酯）、Y5（乙酸乙酯）、Y21（苯乙醇）、Y2（乙酸異戊酯）、Y6（辛酸乙酯）、Y9（丁酸乙酯）和Y23（正己醇）等香氣物質(zhì)含量豐富，這些物質(zhì)為葡萄酒貢獻(xiàn)了濃郁的花香味和果香味。

2.4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

不同處理西拉葡萄酒的感官分析結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酒精發(fā)酵結(jié)束西拉葡萄酒香氣輪廓圖Fig.3 Aroma profile of Syrah wine after alcohol fermentation

從外觀方面來看，葡萄酒的澄清度無明顯差異，混合發(fā)酵的葡萄酒色澤評(píng)分略高于對(duì)照。口感方面，混合發(fā)酵的葡萄酒酸度評(píng)分略高，各處理甜度和收斂性差別不大。在香氣方面，對(duì)照組的酒精味較明顯，與該處理酒樣的乙醇含量較高相一致。添加非釀酒酵母發(fā)酵弱化了酒精味，并且具有更加濃郁的花香和果香味，這與混合發(fā)酵處理酒樣中一些酯類物質(zhì)和高級(jí)醇類物質(zhì)含量增加有關(guān)，祝霞等[29]也發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵明顯增強(qiáng)了葡萄酒的花香和果香特征。綜合分析，F(xiàn)M 處理的酒樣香氣馥郁、口感平衡且酒體豐滿，整體感官評(píng)分最高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了不同非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)西拉葡萄酒理化指標(biāo)、揮發(fā)性香氣成分以及感官品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照F15 相比，混合發(fā)酵處理葡萄酒的乙醇含量顯著降低，甘油含量及色度均顯著增加（P＜0.05）。在香氣方面，混合發(fā)酵均提高了香氣物質(zhì)總量，其中FM 酒樣的香氣物質(zhì)總量比對(duì)照增加了19.5%，增強(qiáng)了西拉葡萄酒愉悅的果香和花香味，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明FM 葡萄酒香氣濃郁協(xié)調(diào)，且具有良好的口感，整體評(píng)分最高。綜上所述，本土M.pulcherrima 與S.cerevisiae 順序接種發(fā)酵對(duì)改善西拉葡萄酒的香氣品質(zhì)有積極作用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。