非生物脅迫誘導(dǎo)的棉花酵母雙雜交文庫構(gòu)建及GhJAZ1互作蛋白篩選

蔡 肖 李興河 王海濤 劉存敬 唐麗媛 張素君 張建宏

（河北省農(nóng)林科學院棉花研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海半干旱區(qū)生物學與遺傳育種重點實驗室/國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051）

JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白作為E3泛素連接蛋白降解復(fù)合體SCFCOI1的靶蛋白，是茉莉素（jasmonic acid，JA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子之一［1-2］。JAZ蛋白不僅廣泛參與植物生長發(fā)育、次生代謝物合成等生物學進程［3-4］，而且在抵御生物及非生物脅迫逆境中扮演著重要角色［5］。不同JAZ基因調(diào)節(jié)逆境響應(yīng)的方式不同：水稻（Oryzasativa）OsJAZ9過表達能顯著提高水稻對鹽和干旱的耐受性［6］，OsJAZ1的超量表達則使水稻的抗旱能力降低［7］；OsJAZ11能夠參與調(diào)控水稻對低磷脅迫的響應(yīng)［8］；ZmJAZ14可增強擬南芥干旱耐受性［9］；ZmJAZ15參與玉米（Zeamays）對赤霉素莖腐病的免疫調(diào)節(jié)［10］；大豆（Glycinesoja）GsTIFY10和GsJAZ2在擬南芥中過量表達可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽堿的能力［11-12］，而GsTIFY11b的過量表達會增加擬南芥對鹽堿脅迫的敏感性［13］。

棉花（Gossypium）是重要的經(jīng)濟作物之一。近年來，極端天氣等自然災(zāi)害頻發(fā)，造成棉花生長環(huán)境和條件惡化，嚴重影響著棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。棉花JAZ基因的鑒定分析和功能研究相繼被報道，為研究其在棉花生長及逆境響應(yīng)中的作用機制提供了理論依據(jù)［14-16］。Hu 等［17］發(fā)現(xiàn)GhJAZ2通過與R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子GhMYB25-like互作來負調(diào)控纖維發(fā)育。GhJAZ2還通過與GhbHLH171互作，增強植株對大麗輪枝孢菌和取食性昆蟲的敏感性［18］。Xia等［19］發(fā)現(xiàn)GhJAZ3參與了擬南芥表皮毛的分化和伸長。GhJAZ10轉(zhuǎn)基因擬南芥氣孔數(shù)量顯著減少，對干旱脅迫的耐受性提高［20］。過表達GaJAZ1基因的陸地棉植株耐鹽性顯著提高［21］。然而，有關(guān)棉花JAZ基因在非生物脅迫中的作用機制研究還少有報道。前期研究表明，陸地棉GhJAZ1基因是一個低溫相關(guān)的抑制因子［22］，受脫落酸和茉莉酸甲酯和低溫脅迫誘導(dǎo)表達，在不同低溫耐性棉花材料中表達量變化程度不同，但GhJAZ1在低溫調(diào)控中的分子作用機理尚不清楚。

酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白之間相互作用的有力工具［23］。通過構(gòu)建酵母雙雜交cDNA 文庫，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選鑒定與目的蛋白（誘餌）相互作用的蛋白質(zhì)，對于深入研究目的蛋白的作用機理、理解蛋白參與的信號傳導(dǎo)途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的理論指導(dǎo)意義。目前，利用酵母雙雜交cDNA 文庫篩選鑒定蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系已經(jīng)在小麥［24］、棉花［25］、苦瓜［26］等多種農(nóng)作物得到了廣泛應(yīng)用。

鑒于此，本研究以陸地棉標準系TM-1 為材料，構(gòu)建棉花非生物脅迫誘導(dǎo)的酵母雙雜交文庫，以期為棉花非生物脅迫響應(yīng)信號途徑和蛋白互作機制的研究奠定基礎(chǔ)，并通過對GhJAZ1 互作蛋白進行篩選，為進一步解析GhJAZ1在低溫應(yīng)答中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子作用機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理方法

將陸地棉標準系TM-1種子浸泡24 h，待種子露白后播種于濕潤的沙子中，子葉展開后轉(zhuǎn)移到Hoagland營養(yǎng)液中進行水培。培養(yǎng)條件為白天28 ℃ 16 h/夜晚26 ℃ 8 h，濕度70%。待植株第3 片真葉完全展開時，進行脅迫處理［27］。低溫處理：將生長一致的棉苗移到4 ℃的培養(yǎng)室中處理6 h；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）模擬干旱處理：17% PEG6000 處理棉苗6 h；NaCl處理：200 mmol·L-1NaCl處理棉苗6 h。脅迫處理后迅速剪取棉苗的幼嫩葉片和根，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2 非生物脅迫誘導(dǎo)的棉花酵母雙雜交cDNA 文庫構(gòu)建

將低溫、PEG、NaCl脅迫處理6 h的根和葉片進行取樣，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法進行植物總RNA 的提取，瓊脂糖凝膠電泳對總RNA的質(zhì)量進行檢測。將提取的各處理樣品的總RNA等量混合，得到非生物脅迫處理的總RNA。參考Oligotex mRNA Midi Kit（70042，QIAGEN，德國）說明書進行mRNA分離純化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離結(jié)果。

cDNA 文庫的構(gòu)建采用Gateway 位點特異性重組技術(shù)完成，具體方法參照CloneMiner? II cDNA 文庫制備試劑盒（A11180，Invitrogen，上海）說明書，初級文庫載體為pDONR222 vector，次級文庫載體為pGADT7-DEST。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，取轉(zhuǎn)化后細菌原液10 μL 稀釋1 000 倍后，從中取出50 μL 涂布含相應(yīng)抗性（初級文庫菌液為卡那霉素抗性，次級文庫菌液為氨芐青霉素抗性）的LB平板。第二天計數(shù)進行庫容量鑒定，計算方法如下：

每毫升大腸桿菌文庫菌液庫容量（CFU·mL-1）=50 μL菌液涂布的平板上的克隆數(shù)/50 μL×100倍×1 000 μL

文庫總克隆數(shù)（CFU）=每毫升大腸桿菌文庫菌液庫容量（CFU·mL-1）×文庫菌液總體積（mL）。

隨機挑取克隆，分別以M13-F/R和pGADT7-DESTF/R 為引物對初級文庫和次級文庫進行菌落PCR 檢測，鑒定重組率和插入片段長度。

構(gòu)建好的次級文庫菌液加入含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜擴增培養(yǎng)，利用PureLink? HQ 小提質(zhì)粒DNA純化試劑盒（K210001，Invitrogen，上海）進行文庫質(zhì)粒抽提，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187（CC306，Coolaber，北京），在SD/-Leu 平板上檢測轉(zhuǎn)化效率并篩選收集轉(zhuǎn)化子，獲得酵母AD文庫菌液，計算酵母文庫滴度：

文庫滴度（cells·mL-1）=平板生長的克隆數(shù)/涂板體積×稀釋倍數(shù)。

1.3 pGBKT7-GhJAZ1 誘餌載體構(gòu)建、自激活檢測及毒性檢測

根據(jù)GhJAZ1基因編碼序列（coding sequence，CDS）和pGBKT7 載體設(shè)計引物pGBKT7-GhJAZ1-F 和pGBKT7-GhJAZ1-R，以pEASY-T3-GhJAZ1質(zhì)粒為模板擴增并回收目的片段，利用EcoRⅠ（FD0275，Thermo，上海）和BamHⅠ（FD0054，Thermo，上海）雙酶切載體pGBKT7 并回收線性化載體，采用T4 DNA 連接酶（EL0011，Thermo，上海）將上述目的片段和線性化載體連接，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌化學感受態(tài)細胞（C502，Vazyme，南京），提取大腸桿菌中pGBKT7-GhJAZ1bait 質(zhì)粒，酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)測序驗證后利用質(zhì)粒抽提試劑盒（DP116，天根，北京）進行bait質(zhì)粒抽提。

將誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7-GhJAZ1和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化Y2H Gold 酵母菌株感受態(tài)，涂布在SD/-Leu/-Trp/X-α-gal（DDO/X）、SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal（TDO/X）和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（DDO/X/A）培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)，觀察生長情況，以確定誘餌蛋白的自激活活性及對酵母細胞的毒性。以pGBKT7-Lam + pGADT7-T為陰性對照，pGBKT7-53 + pGADT7-T為陽性對照。

1.4 酵母雙雜交文庫篩選及回轉(zhuǎn)驗證

將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GhJAZ1 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold，取4～5 mL含誘餌質(zhì)粒pGBKT7-GhJAZ1的新鮮酵母菌液，與1 mL酵母AD次級文庫菌液混合加入到滅菌錐形瓶中，加入45 mL 含50 μg·mL-1kanamycin 的2×酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium with agar，YPDA）（PM2011，Coolaber，北京）液體培養(yǎng)基中，30 ℃、50 r·min-1條件下低速培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察酵母雜交液中出現(xiàn)三葉草狀結(jié)合子，停止培養(yǎng)。1 000 ×g離心10 min 收集菌體重懸于含50 μg·mL-1kanamycin 的0.9% NaCl 液體培養(yǎng)基中，將菌液涂布SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA（TDO/X/A）初篩平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，將初篩平板上的藍色克隆轉(zhuǎn)移到高強度篩選QDO/X/A 培養(yǎng)基上，進一步觀察酵母克隆生長情況。

參照酵母質(zhì)粒提取試劑盒（DP112，天根，北京）對QDO/X/A 上生長的藍色陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取含氨芐青霉素的溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）平板上生長的單菌落進行質(zhì)粒擴增，抽提的質(zhì)粒用于測序和一對一回轉(zhuǎn)驗證。測序得到確定陽性克隆的序列信息，即為GhJAZ1 的候選互作蛋白。將構(gòu)建好的pGBKT7-GhJAZ1bait 質(zhì)粒分別與抽提的陽性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母菌株，在QDO/X/A 平板上培養(yǎng)篩選再次生長藍色克隆的質(zhì)粒。

1.5 酵母雙雜交一對一互作驗證

克隆候選互作蛋白對應(yīng)基因的CDS，參考1.3中的載體構(gòu)建方法，構(gòu)建pGADT7-GhJAZ12_A、pGADT7-GhJAZ12_D、pGADT7-GhPP2-A13和pGADT7-GhKINB1重組質(zhì)粒。分別將重組質(zhì)粒與pGBKT7-GhJAZ1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母菌株Y2HGold，涂布DDO固體培養(yǎng)基，待菌斑生長至2～3 mm，挑取菌斑于100 μL 0.9% NaCl溶液中震散混勻并按梯度稀釋后，點板到QDO/X/A 固體培養(yǎng)基。30 ℃條件下倒置培養(yǎng)3～5 d，直至菌落長出。以質(zhì)粒pGBKT7-53×pGADT7-T 和pGBKT7-Lam×pGADT7-T作為陽性對照和陰性對照。引物列表見表1。

表1 本研究所用引物列表Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 非生物誘導(dǎo)的棉花酵母雙雜交文庫的構(gòu)建

將提取的低溫、PEG、NaCl 脅迫處理6 h 的棉花根和葉片總RNA 等量混合，瓊脂糖電泳檢測結(jié)果顯示總RNA 質(zhì)量良好（圖1-A），可用于酵母雙雜交文庫的構(gòu)建。對總RNA 進一步分離純化mRNA，結(jié)果顯示mRNA帶型分布正確（圖1-B）。反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA（double strand cDNA，ds cDNA），電泳結(jié)果表明，mRNA有效反轉(zhuǎn)錄且得到的cDNA分布正常（圖1-C），可以用于后續(xù)試驗。將dscDNA 與三框attB1 重組接頭連接，BP重組反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)鑒定，初級文庫總克隆數(shù)為1.2×107CFU，重組率100%，平均插入片段長度＞1 000 bp（圖1-D、F）。將初級文庫質(zhì)粒與線性化質(zhì)粒pGADT7-DEST進行LR重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，獲得的次級文庫總克隆數(shù)為1.6×107CFU，重組率100%，平均插入片段長度＞1 000 bp（圖1-E、G）。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的初級文庫和次級文庫庫容量均大于107CFU。轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187 后，獲得的酵母文庫滴度為5.0×107cells·mL-1，酵母克隆PCR鑒定結(jié)果顯示平均插入片段長度＞1 000 bp（圖1-H）。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的酵母文庫符合雙雜交篩選的要求，可以用于后續(xù)試驗篩選。

2.2 pGBKT7-GhJAZ1自激活活性檢測與毒性檢測

根據(jù)GhJAZ1基因CDS序列設(shè)計引物，通過酶切連接將目標序列連接到載體pGBKT7，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-GhJAZ1。將誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7-GhJAZ1和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株，從圖2可以看出，陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T在SD/-Leu/-Trp/X-α-gal（DDO/X）上生長且變藍，陰性對照pGBKT7-Lam+pGADT7-T在DDO/X上正常生長但不變藍，pGBKT7-GhJAZ1+pGADT7在DDO/X上正常生長且變藍，表明3組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化正常，且pGBKT7-GhJAZ1對酵母生長無毒性。pGBKT7-GhJAZ1能夠在DDO/X上生長且變藍，但在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal（TDO/X）和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/X/A）上均不能生長，表明GhJAZ1 在Y2H Gold 酵母菌株中無自激活活性，可以用于進行后續(xù)酵母文庫篩選試驗。

圖2 GhJAZ1誘餌蛋白毒性和自激活活性檢測Fig.2 Assessment of toxicity and self-activation activity of GhJAZ1 bait plasmid

2.3 酵母雙雜交文庫篩選GhJAZ1互作蛋白

以pGBKT7-GhJAZ1為誘餌，采用Mating法篩選構(gòu)建的非生物脅迫誘導(dǎo)的棉花酵母雙雜交cDNA 文庫。在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/X/A）平板上篩選培養(yǎng)，有72個克隆生長變藍（圖3）。對QDO/X/A 上生長的藍色陽性克隆抽提酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行陽性克隆prey 質(zhì)粒擴增，測序確定陽性克隆的序列信息。除去比對到未知蛋白以及重復(fù)比對到同一個蛋白的陽性克隆后，將構(gòu)建好的pGBKT7-GhJAZ1質(zhì)粒分別與陽性克隆prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株，在QDO/X/A平板上篩選再次生長為藍色克隆的文庫質(zhì)粒，共獲得11個回轉(zhuǎn)陽性的互作蛋白（表2）。對篩選到的靶蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，互作蛋白功能涉及碳水化合物代謝、脂肪酸生物合成、氧化還原反應(yīng)、防御反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊以及蛋白質(zhì)泛素化修飾等多種生物學過程。

圖3 高嚴謹度平板篩選的陽性克?。≦DO/X/A）Fig.3 Clones on highly stringent screening plate（QDO/X/A）

表2 酵母陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果Table 2 Plasmids sequencing results of positive clones in yeast

2.4 Y2H一對一驗證蛋白的相互作用關(guān)系

為了驗證陽性克隆的準確性，降低酵母雙雜交篩選的假陽性率，根據(jù)篩選陽性克隆的注釋結(jié)果、公共數(shù)據(jù)庫中基因非生物脅迫的表達模式，并結(jié)合已有文獻報道等信息，選取4 個候選互作蛋白克隆其對應(yīng)基因的全長CDS，構(gòu)建到pGADT7 載體，分別與pGBKT7-GhJAZ1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母菌株Y2HGold，確認4 個候選互作蛋白與GhJAZ1 的互作關(guān)系。4 個蛋白中，包括2 個TIFY/JAZ 家族成員GhJAZ12_A（XP_040973065.1）和GhJAZ12_D（XP_016716950.1）、1 個F-box 蛋白GhPP2-A13（XP_016709333.1）以及1 個蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基GhKINB1（XP_016688633.1）。點板驗證結(jié)果顯示，pGBKT7-GhJAZ1×pGADT7-GhJAZ12_A、pGBKT7-GhJAZ1×pGADT7-GhJAZ12_D、pGBKT7-GhJAZ1×pGADT7-GhPP2-A13、pGBKT7-GhJAZ1×pGADT7-GhKINB1以及陽性對照pGBKT7-53×pGADT7-T 和陰性對照pGBKT7-Lam×pGADT7-T 在二缺板（DDO）上均可以長出菌斑并正常生長（圖4），說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。除陰性對照外，所有共轉(zhuǎn)質(zhì)粒均能在QDO/X/A 上生長且變藍（圖4），表明在酵母細胞內(nèi)GhJAZ1 與4 個候選蛋白GhJAZ12_A、GhJAZ12_D、GhPP2-A13和GhKINB1均存在相互作用。

圖4 GhJAZ1與部分候選互作蛋白的酵母雙雜交驗證Fig.4 Verification of interaction relationships between GhJAZ1 and candidate proteins by yeast two-hybrid

3 討論

JAZ 蛋白在植物抵御非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。前人發(fā)現(xiàn)，GhJAZ1基因表達受低溫脅迫誘導(dǎo)且在不同低溫耐性棉花材料中存在表達量的差異，表明GhJAZ1 參與了棉花低溫響應(yīng)［22］，但GhJAZ1 參與低溫應(yīng)答的分子機制及其可能發(fā)揮的其他生物學功能還不明確。酵母雙雜交是一種高效篩選互作蛋白、研究蛋白相互作用的分子生物學方法，是解析蛋白質(zhì)的分子作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)常用的一項技術(shù)手段。本研究利用Gateway 方法構(gòu)建了棉花非生物脅迫誘導(dǎo)的酵母雙雜交cDNA文庫，為互作蛋白的篩選奠定了基礎(chǔ)。

提高文庫質(zhì)量有利于減少酵母雙雜交結(jié)果的假陰性［23］。高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA 文庫構(gòu)建依賴于高質(zhì)量cDNA 文庫的制備。本研究對獲得的cDNA 初級和次級文庫的滴度、重組率及插入片段大小的檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的cDNA 文庫具有較好的完整性，較廣泛的覆蓋度以及良好的cDNA 片段多態(tài)性等特點，滿足酵母文庫構(gòu)建的要求。

本研究構(gòu)建的pGBKT7-GhJAZ1誘餌載體在酵母系統(tǒng)中無毒性和自激活活性。通過篩選酵母雙雜交文庫獲得了11 個可能與GhJAZ1 相互作用的蛋白。由于酵母雙雜交文庫篩選結(jié)果存在假陽性的問題，有必要利用Y2H 技術(shù)對候選互作蛋白的互作關(guān)系進行一對一驗證［23］。本研究利用Y2H 技術(shù)證明了GhJAZ1 蛋白與GhJAZ12、GhPP2-A13 和GhKINB1 之間存在相互作用，后續(xù)仍需利用其他蛋白互作技術(shù)，如雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）、免疫共沉淀（co-Immunoprecipitation，Co-IP）、Pull down等技術(shù)對互作關(guān)系深入確認。

研究表明，JAZ 蛋白在棉花纖維發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)等生物學進程中發(fā)揮著重要作用，但在不同生理過程中與JAZ互作的蛋白質(zhì)及其調(diào)控機制不盡相同。Li 等［16］分析GhJAZ 蛋白的互作模式發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)GhJAZ 蛋白不僅可以與GhCOI1、GhMYC2/3 和GhNINJA 等蛋白相互作用參與JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可以有選擇性地通過與其他JAZ蛋白形成同源或異源二聚體的形式來發(fā)揮功能。GhJAZ2通過與R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子GhMYB25-like互作從而負調(diào)控棉花纖維發(fā)育［17］，還可以通過與GhbHLH171互作增強植株對大麗輪枝孢菌和取食性昆蟲的敏感性［18］。GhJAZ11_D 可以與棉花GhHOX3、GhEIN3蛋白發(fā)生相互作用，進一步轉(zhuǎn)基因試驗結(jié)果表明GhJAZ11_D 可能是通過與EIN3 之間互作使JA 和乙烯（ethylene，ET）信號途徑協(xié)同，從而正向調(diào)控棉花纖維的伸長發(fā)育［28］。在花粉發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)錄抑制因子GhWRKY22可以與多個GhJAZs基因的啟動子直接結(jié)合從而調(diào)控JAZs基因的表達，進一步酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，GhJAZ8-A、GhJAZ13-A通過與GhMYB24相互作用調(diào)控JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響棉花花藥/花粉的發(fā)育［29］。本研究篩選的GhJAZ1 互作蛋白中也包括了2個JAZ 家族蛋白，分別是與擬南芥JAZ12同源的陸地棉A亞組蛋白GhJAZ12_A（XP_040973065.1）和D亞組蛋白GhJAZ12_D（XP_016716950.1），說明GhJAZ1 可以與GhJAZ12互作形成異源二聚體來發(fā)揮功能。本研究未篩選鑒定到與GhJAZ1相互作用的COI1、MYC2等JA 信號通路關(guān)鍵因子，GhJAZ1 是否可以通過與這些關(guān)鍵因子互作來參與JA 信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)仍需要后續(xù)的深入驗證。

F-box家族蛋白韌皮部蛋白2（phloem protein 2，PP2）被認為在植物多種逆境脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。AtPP2-B11負調(diào)控擬南芥干旱脅迫響應(yīng)，而在鹽脅迫響應(yīng)中則發(fā)揮正調(diào)控作用［30-31］。AtPP2-B11 能與SCF復(fù)合體蛋白SKP1 互作，暗示了其具有F-box 蛋白的功能，可以作為SKP1/Cullin/F-box E3 連接酶復(fù)合體SCFAtPP2-B11的底物受體［32］。小麥PP2-A13基因響應(yīng)逆境脅迫，并與SCF復(fù)合體接頭蛋白SKP1相互作用［24］。擬南芥PP2-A13基因受光周期誘導(dǎo)表達，僅在短的光周期下表達，對于植物對短光條件的適應(yīng)至關(guān)重要［33］。本研究鑒定到一個與擬南芥PP2-A13同源的GhJAZ1互作蛋白GhPP2-A13（XP_016709333.1），推測其可能參與了棉花對非生物脅迫的響應(yīng)，二者互作調(diào)控脅迫響應(yīng)的分子機制有待深入研究。

GhKINB1編碼一個SnRK1（蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶1，SNF1-related protein kinase 1）的β1 調(diào)節(jié)亞基。已有研究表明，JA 可能與SnRK 信號協(xié)同作用以響應(yīng)應(yīng)激條件。例如，JA 響應(yīng)元件是大麥SnRK1基因啟動子區(qū)最常見的元件之一［34］；超表達OsSnRK1a啟動了JA 介導(dǎo)的防御反應(yīng)［35］。然而目前為止鮮有關(guān)于JAZ 蛋白與SnRK 及其復(fù)合體直接相互作用參與防御反應(yīng)的報道，GhJAZ1 是否通過與GhKINB1 互作調(diào)控棉花逆境響應(yīng)及其可能的互作調(diào)控方式仍需后續(xù)試驗進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究開展了陸地棉低溫、PEG、NaCl處理的非生物脅迫酵母雙雜交cDNA 文庫構(gòu)建，經(jīng)鑒定，構(gòu)建的文庫滴度為5.0×107cells·mL-1，平均插入片段長度＞1 000 bp，可以用于蛋白互作篩選。以pGBKT7-GhJAZ1為誘餌，篩選上述酵母文庫，共獲得11個與GhJAZ1相互作用的候選蛋白，功能涉及碳水化合物代謝、脂肪酸生物合成、氧化還原反應(yīng)、防御反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊以及泛素化修飾等多種生物學進程。利用酵母雙雜交點對點技術(shù)進一步確認了GhJAZ1 與GhJAZ12_A、GhJAZ12_D、GhPP2-A13 和GhKINB1的相互作用關(guān)系。進一步闡明了GhJAZ1與候選蛋白的互作機制將是今后的重點研究方向。