基于海藻酸的包衣劑對甜玉米種子活力、抗氧化酶系統(tǒng)和產(chǎn)量的影響

吉狀狀 譚 韻 黃眾基 丁云倩 朱慶祥 金 鵬 王曉敏 趙光武

（浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311300）

甜玉米（ZeamaysL.）因種皮較薄、內(nèi)溶物質(zhì)均一、含糖量高等突出的食味品質(zhì)而廣受全球多個地區(qū)人們的喜愛。甜玉米的獨特風(fēng)味是由于胚乳基因發(fā)生了隱性突變，使淀粉積累少于普通玉米，同時導(dǎo)致種子活力較普通玉米更容易降低。較低的種子活力表現(xiàn)為發(fā)芽率低、苗期生長弱、抗逆能力差等［1］，對甜玉米的品質(zhì)和產(chǎn)量造成更為嚴(yán)重的影響?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是種子活力降低的主要因素之一。ROS 在種子中的積累會氧化損傷脂質(zhì)、DNA 和蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響種子活力［2］。為應(yīng)對ROS 積累對細(xì)胞的損傷，植物體會啟動抗氧化酶清除系統(tǒng)以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定微環(huán)境，該系統(tǒng)主要包括過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等［3］。目前，甜玉米種子活力低是制約甜玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題。

研究表明，種子包衣技術(shù)是一種提高種子活力的常用技術(shù)手段［4］。種子包衣中的功能成分包括多種物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑、殺蟲劑、化肥和微生物。包衣劑可使有效成分精準(zhǔn)作用于種子周圍，提高功能物質(zhì)利用率，降低田間農(nóng)藥的噴施和大量肥料的施用，減少環(huán)境污染。種子包衣技術(shù)的合理利用對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)等具有重要意義。種子包衣處理有效減少了病蟲害的發(fā)生，提高了作物產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。

隨著現(xiàn)代種業(yè)技術(shù)的發(fā)展，包衣劑的種類和包衣方法呈多樣化趨勢，尤其是機械包衣技術(shù)的不斷改進(jìn)，使得種子包衣質(zhì)量及工作效率得到進(jìn)一步提高。但使用化學(xué)物質(zhì)作為種子包衣添加劑時極易對土壤、水資源和生物造成不利影響［6］，因此，開發(fā)一種對環(huán)境友好的包衣劑配方以替代化學(xué)物質(zhì)是未來研究的重要方向。海藻酸是一種從褐藻等藻類中提取的天然多糖。該材料無毒、可生物降解，易于制備［7］。海藻酸及其衍生鹽在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛，主要是作為肥料被廣泛用于小麥［8］、水稻［9］、玉米［10］等作物上，能夠顯著促進(jìn)作物生長發(fā)育、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)，最終提高經(jīng)濟(jì)效益。有研究表明海藻酸可促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成［11］。鑒于此，本研究以海藻酸為主要成分設(shè)計甜玉米包衣劑，通過標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗、抗氧化酶測定和田間驗證等試驗確定最佳方案，以期為甜玉米高質(zhì)量生產(chǎn)提供有效的播前處理技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用甜玉米品種為浙江省推廣品種浙甜2088（ZT2088）和浙甜11（ZT11），均購于杭州市臨安區(qū)綠娃娃種子有限公司。

以海藻酸（上海源葉生物科技有限公司）為主要成分設(shè)計三種包衣劑，包衣劑是以功能成分與成膜劑（北京禾泰華生物技術(shù)有限公司）按照1∶2.5 的比例組配；以未處理種子為對照。具體成分見表1。吡蟲啉、噻蟲嗪購于先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司，MnSO4和6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）購于南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能光照培養(yǎng)箱，寧波賽福實驗儀器廠有限公司；恒溫烘箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰公司；熒光定量PCR儀，美國伯樂公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗 室內(nèi)發(fā)芽試驗在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，嚴(yán)格控制溫度和濕度。氣候條件設(shè)為：晝夜平均溫度均為25 ℃，12 h光照（光照強度150 μmol·m-2·s-1）/12 h黑暗交替培養(yǎng)，相對濕度在50%～60%左右。玉米種子平鋪在潤濕的發(fā)芽紙上，卷起后放入自封袋中進(jìn)行發(fā)芽試驗。該試驗設(shè)置3 次重復(fù)。每個重復(fù)100 顆玉米種子。每天統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)（以根達(dá)到種子長、芽達(dá)到種子長的一半為標(biāo)準(zhǔn)），到第7 天時統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)后剪下幼苗烘干稱重，按照公式計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）和活力指數(shù)（vital index，VI）：

式中，Dt 為發(fā)芽日數(shù)；Gt 為與Dt 相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)。

式中，S 為一定時期內(nèi)（7 d）幼苗干重（g）；GI 為發(fā)芽指數(shù)。

1.3.2 抗氧化酶活性及MDA 含量測定 在種子萌發(fā)第7 天，取新鮮幼苗液氮冷凍備用，測定SOD、CAT、APX、POD 活性和丙二醛（malonaldehydic acid，MDA）含量，在1 g 冷凍組織中加入提取緩沖液（0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值7.8）、0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）充分研磨。然后將勻漿轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，在4 ℃、10 000 r·min-1下離心15 min，吸取上清液到一個干凈的試管中，冰浴備用。SOD 活性通過氯化硝基四氮唑藍(lán)法測定［12］；CAT 活性根據(jù)Piechowiak 等［13］的方法進(jìn)行測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定［14］；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定［15］；APX活性采用抗壞血酸法測定［16］。

1.3.3 基因表達(dá)量測定 樣品處理同上，測定SC3中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量，以未處理的種子為對照。RNA 的提取使用RNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)公司）。使用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix去除殘留基因組并合成cDNA（上海翌圣生物科技有限公司），實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）采用SYBR qPCR 預(yù)混液（南京諾唯贊生物科技有限公司），每個樣本分3個生物學(xué)重復(fù)，使用玉米管家基因ZmGAPDH作為內(nèi)參基因，檢測種子抗氧化酶相關(guān)基因ZmCAT1、ZmMSD3.4、ZmPOD5、ZmAPX1的相對表達(dá)量，具體引物信息見表2。相對表達(dá)量采用2-△△CT法計算。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3.4 田間發(fā)芽率、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成測定 田間試驗設(shè)置在浙江農(nóng)林大學(xué)天目山玉米育種基地。試驗基地土壤以黃壤和紅壤為主，該地交通便利，地理坐標(biāo)為北緯30°19′～30°93′，東經(jīng)119°45′～120°92′。年平均氣溫18.9 ℃，年均降雨量1 613.9 mm，無霜期為324 d 左右。播種前包衣處理采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理3個重復(fù)，小區(qū)面積為20 m2。種子于2022年4月7日直播，7月8日收獲玉米穗。播種間距為33.3 cm × 60.0 cm，單粒播種，每個小區(qū)96 穴。以未處理（CK1）和商品包衣劑噻蟲嗪（CK2）為對照。水肥管理遵循當(dāng)?shù)氐牧?xí)慣和作物需求。播種14 d 后統(tǒng)計田間出苗率。在收獲階段，對玉米產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

百分率數(shù)值在進(jìn)行方差分析前需進(jìn)行反正弦平方根的轉(zhuǎn)換。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理間差異的方差分析，采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗。應(yīng)用Origin 2021 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 包衣處理對甜玉米種子活力的影響

由表3 可知，種子包衣處理可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。在所用處理中SC3對種子活力的提高效果最明顯（圖1），SC3 處理較CK1顯著提高了ZT2088 和ZT11 種子的各項指標(biāo)，其中，ZT2088 的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較CK1 分別提高11.4 和15.7 個百分點，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高19.1%和53.9%，三個包衣劑處理的發(fā)芽勢之間無顯著差異，SC3 處理的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于SC1 和SC2，但SC1 和SC2 之間無顯著差異。SC1 處理可以顯著提高ZT2088種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)雖未達(dá)到顯著水平但高于CK1。ZT11 中各指標(biāo)的變化趨勢與ZT2088基本一致。

圖1 ZT2088萌發(fā)表型Fig.1 Germination phenotype of ZT2088

表3 包衣處理對甜玉米種子活力的影響Table 3 Effect of coating treatment on seed vigor of sweet corn

2.2 包衣處理對甜玉米種子抗氧化酶系統(tǒng)的影響

由表4 可知，種子包衣處理可以提高種子的POD、CAT、SOD 和APX 活性，其中SC3 處理的提高效果整體最明顯，SC3處理較CK1整體提高了ZT2088和ZT11種子的抗氧化酶活性。對于ZT2088，經(jīng)SC3 處理后，POD、CAT、SOD和APX活性較CK1分別提高了74.5%、137.3%、29.5%和42.0%；SC1包衣處理可以顯著提高種子的POD、CAT 和APX 活性，相對于CK1 分別提高29.2%、84.7%和23.7%，SOD雖未達(dá)到顯著水平但高于CK1；SC2處理POD 活性最高，為452.6 U·g-1FW，顯著高于其他處理，相對于CK1提高74.5%；包衣處理可有效降低甜玉米種子MDA 含量，SC1、SC2 和SC3 相對于CK1 分別降低23.1%、35.9%和43.6%，SC3 中MDA 含量最低，為2.2 μmol·kg-1FW。ZT11 中各指標(biāo)的變化趨勢與ZT2088基本一致。

表4 包衣處理對甜玉米種子抗氧化酶活性及MDA含量的影響Table 4 Effects of coating treatment on antioxidant enzyme activity and MDA content of sweet corn seeds

由圖2可知，ZmAPX1在兩個品種的種子中的表達(dá)量高于其他基因。ZmMSD3.4在種子中的表達(dá)量最低。在ZT2088中，SC3處理種子中ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表達(dá)量較CK1分別升高55.6%、35.8%、74.7%和31.3%；SC3 處理種子中ZmCAT1的表達(dá)量提高幅度最大，ZmPOD5的表達(dá)量提高幅度最小。在ZT11 中，SC3 處理種子ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表達(dá)量較CK1分別升高74.2%、42.5%、57.9%和21.8%，其中ZmAPX1的表達(dá)量增加量最高，ZmPOD5的表達(dá)量增加量最低。

圖2 SC3處理對甜玉米ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of SC3 treatment on the expression levels of ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1 and ZmPOD5 genes in sweet corn

2.3 種子包衣對甜玉米田間出苗、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成的影響

由圖3可知，甜玉米種子包衣處理可提高種子的田間發(fā)芽率。SC3處理ZT11和ZT2088的田間出苗率最高，分別為84.4%、86.5%，相對于CK1和CK2分別提高9.3～11.7和2.8～5.1個百分點。由表5可知，對于ZT2088，SC3 處理的產(chǎn)量最高，為709.0 kg·667 m-2，相對于CK1 和CK2 分別提高7.3%和2.5%；包衣處理與CK2之間無顯著差異；SC3 處理穗數(shù)最高，為3 133.9，相對于CK1和CK2分別提高7.0%和1.9%，顯著高于SC1和SC2。品種中各處理之間單穗重均無顯著差異；SC3處理的產(chǎn)量和穗數(shù)均最高，且顯著高于CK1。

圖3 包衣處理對甜玉米種子田間出苗率的的影響Fig.3 Effect of coating treatment on field emergence rate of sweet corn seeds

表5 包衣處理對甜玉米產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成的影響Table 5 Effects of coating treatment on yield and yield components of sweet corn

3 討論

3.1 種子包衣對甜玉米種子活力的影響

種子包衣處理可刺激種子的萌發(fā)和生長，增強作物對逆境的抗性［17］。使用功能物質(zhì)包衣可以保護(hù)種子免受病原體的影響，同時保障營養(yǎng)供應(yīng)以促進(jìn)植物發(fā)育［18］。本研究以海藻酸為主要包衣成分對甜玉米種子進(jìn)行包衣處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)海藻酸包處理后可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)，其中ZT2088 活力指數(shù)較CK1提高了28.9%，發(fā)芽指數(shù)與CK1之間差異不顯著。與Afzal等［19］的研究結(jié)果類似，即包衣可以改善種子的出苗率。目前已有許多研究表明海藻提取物可以促進(jìn)種子萌發(fā)［20］。如Fu等［21］研究表明，海藻酸鹽包衣減少了苜蓿種子和幼苗的細(xì)菌攜帶量；Sarrocco等［22］研究發(fā)現(xiàn)，使用海藻酸鈉進(jìn)行種子包衣能提高種子耐貯性和田間出苗率。結(jié)合本研究結(jié)果，推測海藻提取物對種子萌發(fā)的促進(jìn)作用可能與其含有海藻酸有關(guān)。

加入微量元素、植物激素和吡蟲啉后種子各項活力指標(biāo)均有提高，以SC3 效果最好，且顯著高于SC1 處理?？赡苁怯捎诳共∠x害藥劑和微量元素的加入提高了種子的田間抗逆能力，種子包衣劑中的抗病蟲藥劑和營養(yǎng)物質(zhì)會直接釋放到種子周邊土壤中，可有效防止種傳病害和土傳病害的傳播，同時提供營養(yǎng)物質(zhì)，保障植株的生長和發(fā)育［23］。相關(guān)研究表明，簡單的營養(yǎng)物質(zhì)包衣對種子的活力改善不明顯，但與殺菌劑聯(lián)合使用后可達(dá)到顯著效果［24］?？梢?，多種功能成分的共同作用對種子活力的提高要顯著高于單一成分的使用，后續(xù)研究中可增加其他功能物質(zhì)以驗證各種成分之間的協(xié)同作用對種衣劑作用效果的影響，最終形成更為高效、環(huán)保的種子包衣劑。

3.2 種子包衣對甜玉米種子抗氧化酶系統(tǒng)的影響

針對種子活力的影響因素研究較多，目前認(rèn)為ROS 是影響種子活力形成和保持的重要因素［2］。本研究測定了以海藻酸為主的甜玉米包衣處理后種子中的抗氧化酶活性，研究發(fā)現(xiàn)SC1 處理有效提高了POD、CAT、APX 的活性，SC2 的POD 活性最高；SC2、SC3 的SOD、CAT 和APX 活性較高，均顯著高于對照處理。Fang 等［25］的研究同樣表明包衣劑能夠提高植物抗氧化酶的活性，增強幼苗根系的活性。李防洲等［26］研究表明，種子包衣處理增加了SOD、CAT 和POD 活性，降低了低溫脅迫下植物細(xì)胞中ROS 水平。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，會損傷生物膜結(jié)構(gòu)，抑制其正常功能［27］。種子中MDA 的含量在一定程度上反映了種子脂質(zhì)過氧化程度。本研究表明，SC3 處理后ZT2088 種子中MDA 含量相對CK1 顯著降低43.6%。說明SC3 處理后種子膜脂過氧化程度較低，有利于保持種子活力。在SC3 處理下，與抗氧化能力有關(guān)的基因ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1、ZmPOD5的表達(dá)量增加，且與酶活性數(shù)據(jù)吻合，說明該處理通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育以及防御機制。前人研究表明，與抗氧化酶相關(guān)的基因ZmAPX1［28］、ZmMSD3.4［29］、ZmCAT1［30］、ZmPOD5［31］表達(dá)量升高會進(jìn)一步提高APX、SOD、CAT、POD 活性，減少細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，增強植物抗逆能力，與本研究結(jié)果一致。綜上，增加抗氧化酶活性是SC3 處理提高甜玉米種子活力的重要因素。

3.3 包衣處理對甜玉米田間發(fā)芽率、產(chǎn)量及其構(gòu)成的影響

種子包衣是在種子中形成一層含有特定功能成分（如殺蟲劑、生物和微量營養(yǎng)素）的包膜，本研究使用組合包衣劑可有效提高種子田間發(fā)芽率，以SC3 效果最好，顯著高于CK1，高于CK2 但未達(dá)到顯著差異。SC3的產(chǎn)量顯著高于對照。種子包衣處理對單穗重影響較小，但對每畝穗數(shù)影響較大，SC3 較CK1 顯著提高了甜玉米的穗數(shù)。Dawid 等［32］研究發(fā)現(xiàn)海藻酸復(fù)合包衣可刺激玉米的早期生長，從而提高作物產(chǎn)量，與本研究結(jié)果相似。Szparaga［33］研究發(fā)現(xiàn)，包衣處理可顯著增加大豆的產(chǎn)量（提高10%以上）和產(chǎn)量構(gòu)成（單株莢數(shù)、每莢粒數(shù)）。此外，包衣處理在水稻等作物中同樣具有較好的應(yīng)用效果［34］。綜上所述，種子包衣處理在多種作物上均取得良好效果。因此，結(jié)合海藻酸理化性質(zhì)、生物活性與本研究結(jié)果，進(jìn)一步研究以海藻酸為主的配套栽培措施具有重要實踐意義。

4 結(jié)論

本研究表明，SC3（海藻酸、硫酸錳、6-BA 和吡蟲啉）包衣處理可以提高甜玉米種子活力，使得甜玉米的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有一定程度提高。同時大田試驗表明，包衣處理可有效提高甜玉米的田間出苗率，且ZT2088 的SC3 田間出苗率比商用包衣劑高出6.4%，SC3 處理甜玉米產(chǎn)量（鮮重）顯著高于CK1。包衣處理可提高甜玉米種子中抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT 和APX），同時提高種子中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)。SC3 對種子活力的提高可能與較高的抗氧化酶活性有關(guān)，同時良好的幼苗建成為產(chǎn)量提高提供了前提條件。