牛角花齒薊馬對4種牧草花及其揮發(fā)物的行為選擇反應

崔曉寧，趙曉東，席駁鑫，胡桂馨，尚素琴，彭 斌，史薛強

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/國家林業(yè)草原高寒草地鼠害防控工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，平?jīng)?744000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，蘭州 730070）

牛角花齒薊馬Odontothripsloti屬于纓翅目Thysanoptera，薊馬科Thripidae，齒薊馬屬Odontothrips，主要營孤雌生殖，是我國北方苜蓿上重要害蟲之一[1,2]。在苜蓿營養(yǎng)生長階段，牛角花齒薊馬為害苜蓿頂端嫩葉，使植株葉片皺縮、卷曲，降低光合效率；待苜蓿開花后，薊馬則轉(zhuǎn)移到花器中活動，造成花莢脫落[3-5]。在我國西北苜蓿產(chǎn)區(qū)，牛角花齒薊馬在田間的蟲害率可達70%～100%，降低苜蓿粗蛋白含量8.86%～11.56%，氨基酸總量下降35.0%以上，嚴重影響苜蓿鮮草、種子的品質(zhì)和產(chǎn)量[6,7]。目前的防控主要以化學防治為主，長期使用不僅影響環(huán)境安全，還易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，這嚴重制約草牧業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，亟需探索新的防控技術(shù)。

植物花釋放的揮發(fā)物是影響薊馬長距離寄主選擇的重要因素之一。西花薊馬Frankliniellaoccidentalis寄主廣泛，如萬壽菊Tageteserecta[8]、非洲菊Gerberajamesonii[9]、黃花美人蕉Cannaceaeindicavar.flava[10]、康乃馨Dianthuscaryophyllus[9]、玫瑰Rosarugosa[11]、月季R.chinensis[12]等多種花卉能吸引西花薊馬趨向活動，寄主釋放的茶螺烷、壬醛和2-乙酸-苯乙酯等對西花薊馬有很強的引誘作用[11]。迷迭香Rosmarinus officinialis花對西花薊馬、煙薊馬Thripstabaci、棕櫚薊馬Thripspalmi均有明顯的忌避效果，桉油精是導致薊馬產(chǎn)生忌避反應的主要組分[13,14]。因此，生產(chǎn)上常栽植一些能夠引誘或驅(qū)避薊馬的植物進行生態(tài)防控[15,16]。利用植物源引誘劑對薊馬進行種群監(jiān)測和誘殺的技術(shù)具有廣闊的應用前景[17]。研究表明，將寄主化合物茴香醛與誘蟲板結(jié)合可增加西花薊馬誘捕數(shù)量的1.8～6 倍[18,19]；異煙酸甲酯被證明對西花薊馬、花薊馬F.intonsa、煙薊馬和棕櫚薊馬等12 種薊馬具有很強的引誘效果，與誘蟲板結(jié)合使用可提高對西花薊馬誘捕量的2.4～4 倍；異煙酸甲酯對薊馬具有廣譜和高效的引誘活性，在歐洲廣泛應用于多種薊馬的生態(tài)防治[20-22]。異煙酸甲酯對天敵小花蝽也具有較強的吸引作用，將該物質(zhì)與天敵昆蟲結(jié)合使用可顯著增強薊馬的生物防效[21]。

牛角花齒薊馬的寄主植物主要有苜蓿屬Medicagospp.、草木樨屬Melilotusspp.和車軸草屬Trifoliumspp.等豆科牧草[2]。紫花苜蓿M.sativa、黃花草木樨Melilotusofficinalis、紅豆草Onobrychisviciaefolia和紅三葉Trifoliumpratense是我國重要的豆科飼草植物。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牛角花齒薊馬對這4 種牧草花表現(xiàn)不同的為害程度，其中對紫花苜蓿的為害最嚴重。為探討植物揮發(fā)物對牛角花齒薊馬寄主選擇的影響，本研究選取紫花苜蓿、黃花草木樨、紅豆草和紅三葉4 種豆科牧草的花為研究對象，測試牛角花齒薊馬對寄主花的氣味偏好性，分析相關(guān)揮發(fā)物組分構(gòu)成及含量差異，以期明確牛角花齒薊馬的寄主選擇機制，為開發(fā)植物源引誘劑的害蟲綠色監(jiān)控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試昆蟲 牛角花齒薊馬雌成蟲采自甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草試驗田，寄主為“清水”紫花苜蓿。室內(nèi)盆栽“清水”紫花苜蓿罩籠飼養(yǎng)2 代后，再挑選若干雌成蟲到塑料養(yǎng)蟲罐（直徑6 cm，高5 cm）中飼養(yǎng)。罐底鋪一層濾紙，加入少量健康的苜蓿嫩葉，用濕脫脂棉包裹葉柄保持葉片新鮮。選取同日齡的薊馬雌成蟲用于嗅覺選擇行為測試。

1.1.2 供試植物 4 種豆科牧草，“甘農(nóng)3 號”紫花苜蓿、黃花草木樨、“甘肅”紅豆草和“甘紅一號”紅三葉。4 種牧草盆栽埋地種植于甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草試驗地塑料溫室，用細紗封住網(wǎng)室入口防止害蟲侵入，待盛花期采集健康植株的花朵用于嗅覺行為測試和揮發(fā)物收集。

1.1.3 儀器和試劑 大氣采樣儀QC-1B 型，購自北京科安勞保新技術(shù)公司；Y 型玻璃嗅覺儀，直徑1.0 cm，基臂長10 cm，測試臂長15 cm；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B+7000D，美國Agilent，GC-MS）；Paropak Q 吸附劑（80～100 目）購自美國Waters 公司；正己烷（HPLC 級）購自阿拉丁公司。

1.2 牛角花齒薊馬對4 種寄主花的嗅覺行為選擇

嗅覺行為測試組裝：大氣采樣儀→活性炭（除雜）→蒸餾水（加濕）→氣體流量計→味源瓶（玻璃洗氣瓶）→Y 型嗅覺儀。Y 管兩臂用醫(yī)用硅膠軟管與味源瓶相連，味源瓶（250 mL）內(nèi)放入植物花的鮮樣20 g為測試植物。兩測試管臂中各放一根細鐵絲引導薊馬爬行，兩臂氣體流速調(diào)節(jié)為100 mL/min。嗅覺儀用紙箱遮蓋，懸掛1 根白色節(jié)能燈管作為補充光源。試驗在室溫條件下進行，每天測試時間為10：00～16：00，此時薊馬行為活躍，測試前試蟲饑餓處理1 h。每次測試放入1 頭薊馬，5 min 后檢查記錄兩測試臂和基臂中的試蟲，測定1 次交換兩測試臂的位置。每種牧草處理測試60 頭，每頭僅測試一次。每測試10 頭薊馬更換Y 型嗅覺儀，每測試30 頭更換測試植物。嗅覺儀用75%乙醇擦拭，清水沖洗后烘干再用。

單項選擇試驗以空氣為對照，兩項選擇試驗4 種豆科牧草間相互比較。薊馬對植物氣味的選擇反應率計算參考陳泓渝等[23]的方法，公式如下：

選擇反應率（R）＝味源臂試蟲數(shù)/（味源臂試蟲數(shù)＋對照臂試蟲數(shù)）×100%。

1.3 寄主植物花揮發(fā)物的采集和化合物鑒定

1.3.1 揮發(fā)物采集 采用動態(tài)頂空吸附法采集牧草花釋放的揮發(fā)物[24]。聚四氟乙烯管、洗氣瓶、玻璃吸附柱（內(nèi)徑0.5 cm，長度10 cm）等組成密閉的循環(huán)系統(tǒng)：大氣采樣儀（進氣）→活性炭（除空氣雜質(zhì)）→樣品瓶（玻璃洗氣瓶，250 mL）→吸附劑柱→大氣采樣儀（出氣）。吸附柱中裝入Paropak Q 吸附劑100 mg/管，用玻璃棉塞住兩端管口。每個樣品瓶中裝入新鮮的牧草花朵約35 g，每種牧草處理4 個重復。揮發(fā)物采集氣體流速為300 mL/min，采集時間5 h，以空氣為空白對照。采集結(jié)束將植物樣品在烘箱（70 ℃）中烘至恒重，稱取干重。

1.3.2 化合物鑒定及含量分析 揮發(fā)物采集結(jié)束后取下吸附柱，用正己烷（HPLC 級）淋洗至1.5 mL，0.22 μm濾膜過濾后，在冰浴條件下氮氣（純度99.99%）濃縮至0.5 mL，保存于-20 ℃冰箱。揮發(fā)物樣品進行氣相色譜-質(zhì)譜測試，上樣量1.0 μL。氣相色譜使用HP-5 色譜柱，升溫程序：40 ℃保持1 min，6 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min，以氦氣作為載氣（1.0 mL/min），無分流進樣，溶劑延遲3 min。氣相色譜進樣口溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃。質(zhì)譜（EI，70 eV）質(zhì)量掃描范圍40～500 μ，發(fā)射電流150 μA，離子源溫度230 ℃。比對NIST 2017 標準譜圖，根據(jù)保留時間、保留指數(shù)和匹配度鑒定化合物。每種揮發(fā)性化合物的相對含量采用內(nèi)標法（乙酸庚酯）定量，每種化合物的含量以植物干物質(zhì)中的物質(zhì)含量表示（ng/g）[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件處理。單項選擇和兩項選擇反應率差異比較采用非參數(shù)卡方檢驗（chi-square test，χ2test，α＝0.05）；每種揮發(fā)性化合物的含量在兩種植物間的差異比較采用獨立樣本t檢驗（α＝0.05），3 個及以上植物間的含量差異比較采用單因素方差分析（Duncan’s HSD，α＝0.05）。對4 種植物揮發(fā)物的含量進行因子分析，利用主成分方法提取3 個因子，采用Kaiser 標準化正交旋轉(zhuǎn)法，構(gòu)建旋轉(zhuǎn)成份矩陣，獲得每種揮發(fā)物在各個因子上的載荷值。將每種化合物在3 個因子上的成份得分系數(shù)回歸化獲得每種植物的因子得分。利用單因素方差分析（Duncan’s HSD，α＝0.05）比較每個因子中不同植物間的因子得分差異，選取因子1 和2 的得分繪制二維分布圖[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛角花齒薊馬對4 種牧草花的嗅覺行為選擇

與空氣對照比較，牛角花齒薊馬對紫花苜蓿具有顯著的正選擇趨性，選擇反應率為70.6%（χ2=8.647，P=0.003）。牛角花齒薊馬對其他3 種牧草的選擇反應率與對照相比無顯著差異，薊馬對黃花草木樨、紅豆草和紅三葉的選擇反應率分別為63.6%（χ2＝3.273，P＝0.07）、43.5%（χ2=0.783，P=0.376）和59.6%（χ2=1.923，P=0.166）（圖1）。

圖1 單項選擇條件下牛角花齒薊馬對4 種豆科牧草花的嗅覺行為反應Fig.1 Single-choice olfactory behavioral responses of Odontothrips loti females to floral volatiles emitted by four tested plants

兩兩嗅覺行為選擇表明，牛角花齒薊馬對紫花苜蓿的選擇趨性顯著高于紅豆草和紅三葉，選擇反應率分別為紫花苜蓿78.3%，紅豆草21.7%（χ2=14.696，P<0.001）；紫花苜蓿68.7%，紅三葉31.3%（χ2=6.75，P=0.009）。牛角花齒薊馬對紫花苜蓿（R=56.8%）的選擇趨性與草木樨（R=43.2%）相比無顯著差異（χ2=0.818，P=0.366）。與紅豆草和紅三葉比較，牛角花齒薊馬對草木樨的選擇趨性與這兩種牧草均無顯著差異，選擇反應率分別為草木樨60.5%，紅豆草39.5%（χ2=1.684，P=0.194）；草木樨59.5%，紅三葉40.5%（χ2=1.324，P=0.25）。牛角花齒薊馬對紅三葉的選擇趨性與紅豆草相比無顯著差異，選擇反應率為紅三葉60.0%，紅豆草40.0%（χ2=1.6，P=0.206）（圖2）。

圖2 兩兩選擇條件下牛角花齒薊馬對4 種豆科牧草花的嗅覺行為反應Fig.2 Dual-choice olfactory behavioral responses of Odontothrips loti females to floral volatiles emitted by four tested plants

2.2 4 種寄主花的揮發(fā)物組分及含量分析

4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物共鑒定到40 種化合物（表1），包括烷烴1 種，醇類9 種，酮類2 種，醛類5 種，酯類9 種，萜烯類13 種，酚類1 種。紫花苜?；ㄡ尫诺膿]發(fā)物組分有32 種，其中14 種物質(zhì)為紫花苜蓿特有組分，分別為α-松油醇、2-茨醇、綠花白千層醇、柏木腦、3,4-二甲基苯乙酮、苯甲醛、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂酸甲酯、甲酸芳樟酯、月桂酸甲酯、十五烷酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、檜烯、白菖烯。草木樨花釋放的揮發(fā)物組分有24 種，其特有組分有5 種，分別是喇叭茶醇、馬兜鈴烯、α-律草烯、β-石竹烯和香橙烯。紅豆草花的揮發(fā)物組分有14 種，月桂烯是其特有物質(zhì)。紅三葉花釋放的揮發(fā)物組分最少，有7 種，癸醛是其特有物質(zhì)。庚烷、肉桂酸芳樟酯、5-甲基-1-己烯和α-衣蘭油烯這4 種物質(zhì)僅存在于紫花苜蓿和草木樨花的揮發(fā)物中。

表1 4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物組分和含量Table 1 The component and content of floral volatiles released from four different tested plants (ng/g)

2.3 4 種寄主花釋放的揮發(fā)物含量的因子分析

4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物含量因子分析表明（表2），以主成分方法提取的前3 個因子累計解釋了總方差的96.75%。構(gòu)成因子1 的揮發(fā)物組分對總方差的解釋概率為52.65%，貢獻率較大（絕對值＞0.7）的物質(zhì)有22 種，分別是十五烷酸甲酯、鄰甲氧基肉桂醛、3,4-二甲基苯乙酮、2-茨醇、α-松油醇、檜烯、肉桂酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、綠花白千層醇、白菖烯、柏木腦、月桂酸甲酯、藍桉醇、苯甲醛、甲酸芳樟酯、α-蒎烯、δ-杜松烯、3-異丙基苯甲醛、棕櫚酸甲酯、肉桂酸芳樟酯、5-甲基-1-己烯和庚烷。構(gòu)成因子2的揮發(fā)物組分對總方差的解釋概率為24.47%，貢獻率較大的組分有7 種，分別是α-衣蘭油烯、馬兜鈴烯、α-律草烯、香橙烯、β-石竹烯、1-甲氧基-2-茚醇和喇叭茶醇。構(gòu)成因子3 的揮發(fā)物組分對總方差的解釋概率為15.63%，貢獻率較大的組分有肉桂醛、百里酚、癸醛、4-乙基苯甲酸甲酯、4-異丙基苯甲醇、月桂烯和萜品-4-醇7 種物質(zhì)。每個因子中揮發(fā)物組分的因子得分在4 種豆科牧草間均存在顯著差異，對因子1、2、3 得分貢獻最高的分別是紫花苜蓿、草木樨，以及紅豆草和紅三葉的揮發(fā)物組分。

表2 4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物含量的因子分析Table 2 Factor analysis of the content of floral volatiles released from four different tested plants

根據(jù)組成因子1 和因子2 的揮發(fā)物的因子得分繪制的主成分圖（圖3）表明，紫花苜蓿分布在二維圖的右下部，草木樨分布在左上部，兩者分布位置較遠，說明紫花苜蓿和草木樨之間的揮發(fā)物組分構(gòu)成和含量存在較大差異。紅豆草和紅三葉分布在二維圖的左下部，兩者之間分布位置較近，說明這兩種牧草的揮發(fā)物在組分構(gòu)成和含量上差異較小，但他們均與紫花苜?；虿菽鹃氐膿]發(fā)物在組成和含量上存在較大差異。

圖3 以4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物含量的因子得分構(gòu)成的主成分圖Fig.3 Principal component analysis of floral volatile contents of four different tested plants

3 討論

薊馬類害蟲對寄主植物的花表現(xiàn)出不同程度的選擇偏好性。如曹宇等[10]發(fā)現(xiàn)西花薊馬對花的選擇偏好為黃花美人蕉＞黃花槐Sophoraxanthantha＞鳳尾蘭Yuccagloriosa＞夾竹桃Neriumoleander；黃胸薊馬Thripshawaiiensis對花的嗅覺行為選擇為洋桔梗Eustomagrandiflorum＞杜鵑Rhododendronsimsii＞百合Liliumbrownie＞菊花Dendranthemamorifolium[26]。薊馬的這種嗅覺選擇偏好性不僅影響對寄主植物的定位和取食行為，還與薊馬的產(chǎn)卵選擇、生長發(fā)育以及存活情況等密切相關(guān)。如西花薊馬對不同寄主花的嗅覺偏好性（玫瑰＞康乃馨＞非洲菊＞天竺葵）與害蟲在田間的取食選擇趨性表現(xiàn)一致[9]。西花薊馬和煙薊馬對紫花苜蓿的花表現(xiàn)極強的趨向性，蔥和絲瓜花的揮發(fā)物對這兩種薊馬也有較強的吸引作用，但這兩種薊馬對羅勒和裂葉荊芥的花表現(xiàn)明顯的忌避性，這種選擇行為與兩種薊馬在寄主上的種群數(shù)量趨勢保持一致[13]。黃胸薊馬對寄主花的嗅覺反應為康乃馨＞郁金香Tulipagesneriana＞繡球Hydrangeamacrophylla＞玫瑰，薊馬從卵到成蟲的發(fā)育歷期在這4 種寄主上依次為9.58 d、9.92 d、10.35 d、10.75 d，存活率分別為76.33%、71.33%、64.00%和59.00%[27]。本試驗表明牛角花齒薊馬對紫花苜蓿的花表現(xiàn)極強的正趨性，對草木樨、紅豆草和紅三葉無明顯的行為選擇趨性，這和田間觀察的牛角花齒薊馬偏好在紫花苜?；ㄉ暇奂潭雀叩默F(xiàn)象一致。牛角花齒薊馬的這種嗅覺選擇行為與其在不同寄主花上的產(chǎn)卵、生長發(fā)育及存活率等的關(guān)系還需進一步探究。

薊馬在嗅覺選擇過程中，部分關(guān)鍵寄主揮發(fā)物組分發(fā)揮重要作用[17]。Cao 等[28]發(fā)現(xiàn)黃胸薊馬的偏嗜寄主梔子花釋放的順-3-己烯醇-2-甲基-2-丁烯酸酯、芳樟醇和（E3,E7）-4,8,12-三甲基-1,3,7,11-十三碳四烯對該薊馬有明顯的引誘效果。豇豆Vignaunguiculata花對普通大薊馬Megalurothripsusitatus的引誘作用顯著高于四季豆Phaseolusvulgaris花，豇豆花中的植醇和棕櫚酸乙酯對普通大薊馬具有引誘活性，羅勒烯對普通大薊馬有顯著的驅(qū)避效果[29]。目前，已報道對薊馬有引誘活性的植物揮發(fā)物有46 種，多為苯環(huán)類、萜烯類、吡啶類和酯類；表現(xiàn)驅(qū)避作用的有38 種，多為苯環(huán)類和萜烯類[30]。本試驗中，苯甲醛是紫花苜?；〒]發(fā)物的特有組分，研究表明10-4體積比濃度的苯甲醛對西花薊馬[31,32]和花薊馬[33]表現(xiàn)較強的引誘活性；草木樨花的特有組分β-石竹烯，10-4濃度對西花薊馬[11]和普通大薊馬[29]具有引誘作用；α-蒎烯作為紫花苜蓿和草木樨共有的特異組分，0.1 μg/mL 和1.0 μg/mL 濃度對棕櫚薊馬具有很強的引誘效果[14]。月桂烯僅在紅豆草花揮發(fā)物中鑒定到，月桂烯10-2濃度對西花薊馬[32]和花薊馬[33]具有顯著的引誘效果。棕櫚酸甲酯和百里酚是普遍存在于豆科牧草花中的揮發(fā)性組分，普通大薊馬[29]和煙薊馬[34]對這兩種物質(zhì)表現(xiàn)明顯的忌避趨性。據(jù)此推測，苯甲醛、β-石竹烯、α-蒎烯、月桂烯對牛角花齒薊馬可能具有吸引作用，棕櫚酸甲酯和百里酚對牛角花齒薊馬表現(xiàn)驅(qū)避作用。

本研究明確了牛角花齒薊馬偏好選擇紫花苜蓿的花，對草木樨、紅豆草和紅三葉的花選擇趨性較弱。4 種豆科牧草花釋放的揮發(fā)物共鑒定到40 種化合物，其中紫花苜蓿32 種，草木樨24 種，紅豆草和紅三葉較少，分別有14 種和7 種，根據(jù)因子分析結(jié)果推測牛角花齒薊馬的嗅覺選擇偏好與寄主揮發(fā)物的化學組成及含量密切相關(guān)。通常植食性昆蟲對寄主的定位是通過多種揮發(fā)物組分形成的化學指紋圖譜識別和判斷[35,36]。因此，明確關(guān)鍵揮發(fā)物組分對牛角花齒薊馬的吸引或驅(qū)避作用的最佳濃度，探討多種化合物的復配對薊馬行為反應的具體作用是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。這對闡明牛角花齒薊馬寄主選擇的嗅覺感受機制，研發(fā)和應用植物源引誘劑進行害蟲監(jiān)測和防治具有重要意義。