重組人生長激素對棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響

張 芳 冉麗媛 張金金 吳英杰，，3

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院模式動(dòng)物研究所，山東 濟(jì)南 250012；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250117

代謝相關(guān)脂肪肝病（metabolic-dysfunctionassociatedfatty liver disease ，MAFLD）又稱非酒精性脂肪肝病，是代謝相關(guān)疾病累及肝臟的表現(xiàn)，患者通常沒有飲酒過量的既往不良生活史，并且伴有一定程度的肥胖或胰島素抵抗[1］。MAFLD 是全球廣泛分布的代謝性疾病，全球發(fā)病率約25%。隨著我國城市化進(jìn)程的加快，MAFLD 發(fā)病率也逐年攀升。在全球范圍內(nèi)，估計(jì)有2 000 萬人最終會(huì)死于MAFLD，同時(shí)MAFLD 會(huì)增加2 型糖尿病和心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[2］。盡管近年來針對MAFLD 的流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)等方面的研究取得了一定進(jìn)展，但目前臨床治療MAFLD 僅僅局限于對患者的生活方式進(jìn)行干預(yù)[3］，尚無有效治療藥物，而前者存在見效慢、易反復(fù)、患者依從性差等缺點(diǎn)，成為MAFLD 干預(yù)治療的瓶頸。因此，開發(fā)一種安全有效的治療藥物，是突破臨床MAFLD 治療瓶頸的首要任務(wù)。

生長激素（growth hormone，GH）是由垂體前葉分泌的由191 個(gè)氨基酸組成的多肽類激素，是調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育和新陳代謝的重要因子[4］。GH 通過與肝臟表面的生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）結(jié)合，刺激肝細(xì)胞合成并分泌胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1），在機(jī)體生長發(fā)育和代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[4］。研究表明，循環(huán)GH 水平降低或GHR 功能缺失會(huì)增加MAFLD 和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的患病風(fēng)險(xiǎn)[5］。本研究擬通過體外高脂誘導(dǎo)建立脂肪肝細(xì)胞系模型，探討重組人生長激素（recombinant human growth hormone ，rhGH）對細(xì)胞系模型中脂質(zhì)代謝的影響，為rhGH用于MAFLD治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

人肝癌HepG2 細(xì)胞系由大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院黃琳教授惠贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基購自美國Biological公司，胎牛血清購自美國Gemini 公司，雙抗、PBS、胰蛋白酶、4%多聚甲醛和蘇木素染液購自中國Biosharp 公司，棕櫚酸（palmitic acid，PA）購自美國Sigma 公司，飽和油紅O染液、RIPA裂解液、PMSF磷酸酶抑制劑均購自北京索萊寶科技有限公司，CCK8 試劑盒購自美國MCE公司，5X蛋白上樣緩沖液、快速封閉液和通用型抗體稀釋液均購自賽文創(chuàng)新（北京）生物科技有限公司，蛋白Marker購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，Tween-20購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，AR 級甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，PVDF 膜和ELC 發(fā)光試劑盒均購自美國Millipore 公司，GAPDH 抗體、ATGL 抗體、FASN 抗體、二抗購自美國ABclonal公司。rhGH由長春金賽藥業(yè)有限公司提供。

1.3 主要儀器

倒置顯微鏡（日本Nikon公司），熒光定量PCR儀（美國Thermo公司），酶標(biāo)儀（美國BIOTK公司），超微量分光光度計(jì)（美國Thermo 公司），電泳儀（BIORAD），電泳槽（BIO-RAD），轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD），熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 脂肪肝細(xì)胞系模型建立及培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素）于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，12 孔板的鋪板濃度為3 × 105個(gè)/mL，每孔補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)基至1 mL，混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%以上時(shí)，實(shí)驗(yàn)組用0.2 mmol/L PA 誘導(dǎo)24 h，對照組用牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 誘導(dǎo)24 h。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞在96孔板培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入不同濃度的待測藥物，孵育24 h 后，向每孔中加入10 μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.6 油紅 O 染色

細(xì)胞用4 ℃ 預(yù)冷的PBS 洗滌2次，每次30 s；然后用4%多聚甲醛固定30 min；油紅染液避光染色15 min；吸走染液，PBS洗滌2遍；60%乙醇溶液將樣本分化至間質(zhì)清晰，PBS 洗滌2 遍；蘇木素復(fù)染核5 min，PBS 洗滌至不變色后用蘇木素分化液分化2～ 3 s，PBS清洗；顯微鏡觀察，拍片。

1.7 RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）

收集待檢測細(xì)胞，使用試劑盒提取總RNA，檢測RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此作為模板，進(jìn)行RT-qPCR，所用的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.8 Western Blot

收集待檢測細(xì)胞，加入RIPA 裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。使用10%的SDS-PAGE 凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。膜用快速封閉液封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜。TBST 洗膜3 次后，二抗室溫孵育2 h，結(jié)束后TBST洗膜3次，加入顯影液，顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（mean ± SEM），組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 成功建立脂肪肝細(xì)胞系模型

使用不同濃度的PA（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L）誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h，油紅O 染色后，查看細(xì)胞質(zhì)中脂質(zhì)沉積的狀況。與BSA組相比，加入0.1 mmol/L PA 即可引起HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)積聚，且隨著PA濃度升高，脂質(zhì)含量逐漸增加；0.2 mmol/L PA 誘導(dǎo)條件下，HepG2 細(xì)胞形態(tài)變圓，胞漿內(nèi)脂質(zhì)積聚更加明顯，見圖1。本研究選擇了0.2 mmol/L PA作為誘導(dǎo)條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PA及rhGH藥物毒性的驗(yàn)證

通過CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的PA 和rhGH 對HepG2細(xì)胞存活率的影響。PA具有一定的細(xì)胞毒性，當(dāng)PA 濃度 ＞ 0.2 mmol/L 后，細(xì)胞存活率降低30%以上。加入rhGH后，加速了HepG2細(xì)胞的生長繁殖，當(dāng)rhGH濃度 ＞ 320 μg/L時(shí)，P＜ 0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。當(dāng)不同濃度的rhGH與0.2 mmol/L PA混合處理細(xì)胞時(shí)，可降低PA對細(xì)胞的毒性作用。

圖2 不同濃度PA和rhGH對HepG2細(xì)胞存活率的影響

2.3 rhGH對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積聚的影響

為了驗(yàn)證rhGH對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響，在0.2 mmol/L PA 誘導(dǎo)脂肪肝細(xì)胞模型的同時(shí)，給予不同濃度（5，10，20，40，60，80，100 μg/L） rhGH處理細(xì)胞24 h ，油紅O染色觀測細(xì)胞內(nèi)脂滴積聚情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhGH 處理可導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚減少，并且呈劑量依賴性，rhGH 給藥濃度大于40 μg/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚明顯減少，見圖3。

2.4 rhGH 對HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

如表2 所示，rhGH 0 μg/L 組（即脂肪肝細(xì)胞模型組）與BSA 組相比，脂質(zhì)合成基因FAS、SCD1、ACC1表達(dá)量顯著升高；脂肪酸β 氧化相關(guān)基因CPT1A和脂質(zhì)分解相關(guān)基因ATGL表達(dá)量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；脂質(zhì)分解相關(guān)基因HSL表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。給予不同濃度rhGH 刺激后，與rhGH 0 μg/L 組相比，脂質(zhì)合成基因表達(dá)量呈下降趨勢，脂質(zhì)分解及脂肪酸β 氧化相關(guān)基因表達(dá)無明顯變化。

表2 RT-qPCR檢測不同濃度rhGH對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積聚的影響

2.5 rhGH 對HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白水平的影響

如圖4 所示，rhGH 0 μg/L 組與BSA 組相比，脂合成蛋白FASN 表達(dá)量顯著升高，脂質(zhì)分解蛋白ATGL沒有變化。隨著rhGH濃度升高，脂合成蛋白FASN表達(dá)量逐漸降低，脂質(zhì)分解蛋白ATGL沒有顯著變化。以上結(jié)果表明，rhGH可能通過抑制脂質(zhì)從頭合成途徑來改善PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積聚。

圖4 不同濃度rhGH對HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

近年來脂代謝紊亂相關(guān)疾病發(fā)病率逐年攀升，MAFLD 在全球患病率已達(dá)到25% 左右，我國MAFLD患病率亦高達(dá)15%，對醫(yī)療衛(wèi)生帶來很大的壓力。相對于急速增長的患病率，目前針對MAFLD治療尚無理想藥物，因此，積極探索MAFLD防治的新手段和治療的新藥物迫在眉睫。

肝臟是人體最大的腺體，在脂類的消化吸收、分解、合成和運(yùn)輸中起重要作用。肝臟中脂質(zhì)的產(chǎn)生和積累在很大程度上取決于脂質(zhì)從頭合成以及氧化代謝之間的平衡[6］。健康個(gè)體的肝細(xì)胞可利用飲食中的碳水化合物，通過脂質(zhì)從頭合成形成甘油三酯（triglyceride，TG）在肝臟中積累，肝臟中的TG可以極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的形式從肝臟輸出到脂肪組織，在營養(yǎng)和胰島素缺乏時(shí)，重新分解成脂肪酸并提供給包括肝臟在內(nèi)的多個(gè)組織利用。但是當(dāng)機(jī)體攝入過多營養(yǎng)物質(zhì)和肥胖的情況下，會(huì)使得肝臟脂質(zhì)從頭合成增加，線粒體β-氧化減少，大量TG 在肝細(xì)胞中積累，導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、胰島素抵抗等一系列與MAFLD 相關(guān)的病理表型[7］。本研究使用PA 模擬營養(yǎng)過剩條件，體外構(gòu)建模擬MAFLD的脂肪肝細(xì)胞系模型，研究結(jié)果顯示，HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚與PA 濃度正相關(guān)。

rhGH 在臨床上用于治療生長激素缺乏癥（growth hormone deficiency，GHD）已有30多年歷史，取得了良好的療效。近年來還發(fā)現(xiàn)，rhGH在治療非生長激素缺乏癥的身材矮小、抗衰老和減肥等方面也有一定的效果。對肥胖兒童[8］、患有肥胖癥和MAFLD的年輕成人[9］、健康的老年女性和男性進(jìn)行rhGH 治療[10］，可有效降低患者血脂水平，改善患者的身體健康狀況。臨床數(shù)據(jù)表明，肥胖患者的GH分泌減少，肝臟IGF1 分泌水平相應(yīng)降低[11］，且患者GH/IGF1軸異常后，其肝脂肪變性向NASH、肝硬化和終末期肝病的轉(zhuǎn)變速度加快[12］。成人GHD 患者通常伴隨腹型肥胖、血脂異常、胰島素抵抗及MAFLD[13］。對成人GHD 患者給予GH 補(bǔ)充治療可顯著改善其肝臟脂質(zhì)沉積、纖維化及炎癥等病理指標(biāo)[14］。肝臟敲除GHR 增加小鼠肝臟的脂肪合成和堆積，促使肝臟發(fā)生纖維化和炎癥[15］。本研究結(jié)果顯示，rhGH 處理可顯著減少高脂誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞模型中脂質(zhì)積累，且呈劑量依賴性。這主要是由于肝細(xì)胞中脂質(zhì)從頭合成途徑被抑制導(dǎo)致的。以上臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果充分表明，GH 信號通路在肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用，rhGH 具有直接用于MAFLD 治療的潛力。但由于目前將rhGH 直接用于MAFLD 治療的報(bào)道還較少，依然需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)分析，對rhGH的使用時(shí)間和劑量等進(jìn)行研究和論證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突