響應(yīng)面法優(yōu)化六妹羊肚菌原生質(zhì)體的制備條件

李豐碩，冀寶營，韓冰，孫立梅，王洪奇，柴林山，池景良

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽 122000)

羊肚菌[Morchella esculenta(L.)Pers]屬于真菌界子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，是羊肚菌屬的模式種[1]。羊肚菌菌絲易老化，可形成“假菌核”以適應(yīng)不良的環(huán)境條件[2]。 其風(fēng)味獨特，子實體富含維生素、蛋白質(zhì)、類固醇、礦物質(zhì)、多糖和多核苷酸等物質(zhì)，是兼?zhèn)渌幱脙r值和經(jīng)濟效益的食用菌[3]。 自2000 年四川省林業(yè)科學(xué)院首次研發(fā)外營養(yǎng)添加技術(shù)至2015 年技術(shù)逐步成熟，我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)進入了快速發(fā)展時期，最近5 年羊肚菌的人工商業(yè)化栽培發(fā)展十分迅速，栽培區(qū)域從最初的四川、云南等地擴展到遼寧、河北等20 余省(市、自治區(qū))[4-5]。

近年來，借力短視頻，“羊肚菌熱”在全國興起，羊肚菌栽培面積連年增加，產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢頭強勁，但“不確定性”一直是羊肚菌栽培種植過程中的突出問題。 據(jù)統(tǒng)計，約70%種植戶的盈利能力較差，平均每公頃新鮮羊肚菌產(chǎn)量不足1 500 kg。對于有經(jīng)驗、有可靠種源的農(nóng)戶來說，栽培產(chǎn)量可能會高些，小規(guī)模種植時偶爾會超過6 000 kg/hm2，但好收成很難重復(fù)實現(xiàn)，不確定性的關(guān)鍵是缺乏可靠的育種技術(shù)[6]。 同時，羊肚菌作為子囊菌，與擔(dān)子菌相比，菌種容易老化和退化，因而保證羊肚菌的菌種質(zhì)量穩(wěn)定性和培育高品質(zhì)的可栽培菌株是其生產(chǎn)成功的關(guān)鍵因素，這就對羊肚菌育種工作提出許多新的要求[7]。 原生質(zhì)體技術(shù)具有試驗周期短、易于操作、可進行單核體的快速分離等特點，可以在種內(nèi)、種間、屬間和異種間進行融合操作，不僅在高等植物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在野生菌種馴化、品種改良與選育等方面也取得長足發(fā)展。 原生質(zhì)體技術(shù)的有效應(yīng)用離不開高效的原生質(zhì)體分離和再生，因此，優(yōu)化其制備條件是獲得優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體的基礎(chǔ)[8]。

原生質(zhì)體的制備受多種因素的交互影響，如酶解時間、酶解溫度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及穩(wěn)滲劑種類和濃度等，響應(yīng)面法可以對多個因素的組合效應(yīng)進行研究，從而找到最優(yōu)的試驗條件[9]。 孫佳星等[10]利用響應(yīng)面法對香菇原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化得出，在酶解液濃度1.7%、30.49 ℃條件下酶解3.25 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量為14.02×106CFU/mL；婁海偉等[11]發(fā)現(xiàn)在2.06%溶壁酶、26.1 ℃條件下酶解2.57 h，蛹蟲草單核芽生孢子原生質(zhì)體得率可達(dá)(9.17±0.29)×106個/mL。 目前還未見到基于響應(yīng)面法優(yōu)化羊肚菌原生質(zhì)體制備條件的相關(guān)報道，制備條件間的相互作用效應(yīng)也不清晰。 因而本研究結(jié)合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用響應(yīng)面法進一步對羊肚菌原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的原生質(zhì)體，為后續(xù)羊肚菌交配型分析、同核體分離及融合等工作的開展提供優(yōu)良的試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與試劑 六妹羊肚菌菌株(Morchella sextelataZP-01)，由遼寧省微生物科學(xué)研究院食用菌栽培研究室分離保存。 溶壁酶(廣東省微生物菌種保藏中心)和纖維素酶、蝸牛酶(上海源葉生物科技有限公司)，均為生物技術(shù)級。 甘露醇、蔗糖等化學(xué)制劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要溶液及培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g(煮沸30 min，取汁，下同)，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000 mL；PDB 培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；再生培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，胰蛋白胨1 g，酵母浸粉1 g，甘露醇109.3 g(0.6 mol/L)，瓊脂10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。 穩(wěn)滲劑:稱取10.93 g 甘露醇、3.51 g NaCl、7.2 g MgSO4、20.54 g 蔗糖分別溶解于100 mL 無菌水中。 以上培養(yǎng)基以及穩(wěn)滲劑均于1×105Pa 下滅菌20 min。

酶解液:質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶液，經(jīng)0.22 μm 無菌濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng) 將PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲連帶培養(yǎng)基切成2～3 mm 小塊，接種5 ～6 塊至PDB 培養(yǎng)基，置于20 ℃黑暗條件靜置培養(yǎng)1 d，再于20 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)3 d，用于羊肚菌原生質(zhì)體的制備。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備及再生 將PDB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的新鮮幼菌絲分別用無菌蒸餾水和0.6 mol/L 甘露醇洗滌3 次，然后用無菌濾紙吸干水分。 稱取菌絲200 ～300 mg 置于2 mL 離心管中，加入3 倍體積的酶解液約1.5 mL，振蕩混勻，置于恒溫金屬浴中酶解，每30 min 振蕩一次，保證酶解液與菌絲充分接觸，得到酶解后的原生質(zhì)體粗提取液；將粗提液用頂端含1 cm 滅菌脫脂棉柱的注射器過濾純化，濾液經(jīng)3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，再經(jīng)穩(wěn)滲劑洗滌2 次，獲得純化后的原生質(zhì)體，立即將沉淀重新懸浮于穩(wěn)滲劑中，400 倍顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，即為原生質(zhì)體產(chǎn)量。

用穩(wěn)滲劑將原生質(zhì)體稀釋至105個/mL。 吸取100 μL 原生質(zhì)體懸浮液均勻涂布至裝有再生培養(yǎng)基的90 mm 培養(yǎng)皿中，20 ℃黑暗培養(yǎng)，一般3 d 能夠看到原生質(zhì)體再生的菌落。 再生率為再生的原生質(zhì)體數(shù)量占涂布原生質(zhì)體數(shù)量的比值。為排除可能存在菌絲碎片的影響，以PDA 培養(yǎng)基為對照計算原生質(zhì)體再生率，公式為:原生質(zhì)體再生率(%)＝(再生培養(yǎng)基萌發(fā)菌落數(shù)-對照PDA培養(yǎng)基萌發(fā)菌落數(shù))/涂布原生質(zhì)體數(shù)×100[12-13]。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，以原生質(zhì)體產(chǎn)量為評價指標(biāo)，選取酶解時間(1、2、3、4、5 h)、酶解溫度(20、25、30、35、40 ℃)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%)、穩(wěn)滲劑種類(NaCl、MgSO4、甘露醇、蔗糖，均為0.6 mol/L)進行單因素試驗，重復(fù)3 次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取酶解時間(A)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、酶解溫度(C)為自變量，原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定自變量的變化區(qū)間，經(jīng)Box-Behnken 設(shè)計17 次試驗。 試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面法因素和水平設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Office 2021 統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS 26.0 對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性及顯著性差異分析，Design-Expert 13.0 設(shè)計響應(yīng)面試驗方案并對結(jié)果進行分析，Origin 2021 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌原生質(zhì)體制備的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同酶解時間條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率 在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、甘露醇作穩(wěn)滲劑、酶解溫度30 ℃條件下，分別進行1、2、3、4、5 h 酶解試驗。 由圖1 可知，羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率先隨時間的延長而升高，均在酶解3 h 達(dá)到最高值，分別為3.96×105個/mL 和1.2%。 再生率對酶解時間的響應(yīng)更為迅速，酶解3 h 與4 h 差異顯著，原生質(zhì)體產(chǎn)量差異不顯著；超過4 h，產(chǎn)量與再生率均快速降低。 選擇2 ～4 h 為酶解時間較為適宜。

圖1 不同酶解時間條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率

2.1.2 不同酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率 由于羊肚菌菌絲壁不能被完全酶解，前人的相關(guān)研究多采用組合酶，故本研究采用以溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶的組合酶系作為水解酶。分別選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%的組合酶進行酶解試驗，結(jié)果如圖2 所示。 在酶解溫度30 ℃、甘露醇作穩(wěn)滲劑、酶解時間3 h 的條件下，2%和3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組合酶作用下的原生質(zhì)體產(chǎn)量差異不顯著，但再生率在2%時達(dá)到最大值；當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過3%時，再生率和原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著降低。 選取1%～3%酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為適宜酶解液濃度。

圖2 不同酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率

2.1.3 不同酶解溫度條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率 如圖3 所示，在甘露醇作穩(wěn)滲劑、2%組合酶液、酶解3 h 條件下，當(dāng)酶解溫度30 ℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率均達(dá)到最大值，分別為4.67×105個/mL 和1.44%，酶解溫度20 ℃與25 ℃再生率差異不顯著，30 ℃與35 ℃原生質(zhì)體產(chǎn)量差異不顯著。 40 ℃時由于酶活性的變化，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率均顯著下降，因此選擇適宜酶解溫度范圍為25～35 ℃。

圖3 不同酶解溫度條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率

2.1.4 不同穩(wěn)滲劑條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率 以30 ℃、2%組合酶液酶解3 h 為基本條件，不同種類穩(wěn)滲劑中原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率結(jié)果如圖4。 用甘露醇作為穩(wěn)滲劑的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，蔗糖作為穩(wěn)滲劑再生率最高，但兩者再生率差異不顯著。 故選用甘露醇為羊肚菌原生質(zhì)體制備的穩(wěn)滲劑。

圖4 不同穩(wěn)滲劑條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率

2.2 羊肚菌原生質(zhì)體制備的響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計17 組試驗，結(jié)果如表2。 采用Design-Expert 13.0 軟件對試驗結(jié)果進行分析，如表3 所示。 該模型的F 值為39.11，P＜0.0001，失擬項P值為0.685、不顯著，故該模型高度顯著；決定系數(shù)R2＝0.9805，校正決定系數(shù)Adjusted R2＝0.9554，說明擬合度較好，誤差小，模型有效可靠，可充分體現(xiàn)自變量與羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量間的相互關(guān)系，可做預(yù)測應(yīng)用。 A、B、C、BC、A2、B2、C2均達(dá)極顯著水平，AC 達(dá)顯著水平，即酶解時間、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度及酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解溫度間的交互作用對羊肚菌原生質(zhì)體的制備有極顯著影響，酶解時間與酶解溫度的交互作用有顯著影響。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸方程的方差分析

為預(yù)測最優(yōu)點，以酶解時間(A)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、酶解溫度(C)為自變量，原生質(zhì)體產(chǎn)量(Y)為因變量，剔除不顯著項，得到最終擬合方程:

Y ＝-59.86575＋9.69225A＋5.15275B＋2.8694C-0.0685AC-0.0935BC-1.2235A2-0.5985B2-0.04024C2。

對各因子的顯著性和F 值分析可知，制備條件對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響程度:酶解時間＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解溫度。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 為了更好地評價三因素之間的交互作用效果，建立了三維響應(yīng)曲面和二維等高線圖，如圖5 至圖7 所示。 圖5A、B顯示，在固定酶解溫度30 ℃條件下，酶解時間從2 h延長至4 h，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)由1%增加到3%，原生質(zhì)體產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，等高線近似圓形，結(jié)合P值為0.3151＞0.05，說明兩者的交互作用不顯著；圖6A、B 顯示了固定酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%條件下，酶解時間從2 h 延長至4 h，酶解溫度由25 ℃升至35 ℃，原生質(zhì)體產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，等高線橢圓但接近圓形，結(jié)合P值為0.021＜0.05，說明兩者存在較弱的交互作用；圖7A、B 顯示，固定酶解時間3 h 條件下，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解溫度交互作用的曲面最陡，從等高線圖可看出，兩者交互作用極顯著(P＜0.01)。 三組交互作用對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響表現(xiàn)為BC＞AC＞AB，其中AB 之間的交互作用不顯著。

圖5 酶解時間與酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用的響應(yīng)面圖(A)與等高線圖(B)

圖6 酶解時間與酶解溫度的交互作用響應(yīng)面圖(A)與等高線圖(B)

圖7 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解溫度交互作用的響應(yīng)面圖(A)與等高線圖(B)

2.2.3 最適條件和回歸模型的驗證 基于上述回歸方程，預(yù)測六妹羊肚菌原生質(zhì)體最適制備條件，如圖8 所示，在酶解時間3.23 h、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.28%、酶解溫度30.26 ℃條件下，產(chǎn)量可達(dá)5.07×105個/mL。 考慮試驗的可操作性，驗證試驗選取條件為酶解時間3.2 h、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.3%、酶解溫度30 ℃，穩(wěn)滲劑選擇0.6 mol/L 的甘露醇，重復(fù)3次，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到(5.13±0.13)×105個/mL，與預(yù)測結(jié)果的差異不顯著，說明響應(yīng)面法用于羊肚菌原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化可行。

圖8 六妹羊肚菌原生質(zhì)體最適制備條件

2.3 羊肚菌原生質(zhì)體的顯微觀察

在上述最優(yōu)條件下制備羊肚菌原生質(zhì)體，將純化后的原生質(zhì)體稀釋至105個/mL，在1 000 倍油鏡的明場顯微鏡下觀察，共觀察到67 個原生質(zhì)體，直徑大小分布如圖9 所示，個體大小以2 ～7 μm 居多；10 μm 以下的原生質(zhì)體形態(tài)如圖10，可供后期融合等操作參考。

圖9 原生質(zhì)體直徑分布

圖10 1 000 倍油鏡下原生質(zhì)體形態(tài)

3 討論

羊肚菌菌絲壁不能被完全酶解，部分細(xì)胞壁困住了原生質(zhì)體，使其難以全部釋放出來，本研究也觀察到類似現(xiàn)象。 無論是真菌還是高等植物，在進行原生質(zhì)體分離時，組合酶相比單一酶能更加有效地溶解細(xì)胞壁中的纖維素、角質(zhì)等物質(zhì)，因而在預(yù)試驗期間，選用單一溶壁酶、溶壁酶＋蝸牛酶、溶壁酶＋蝸牛酶＋纖維素酶三種形式的酶系進行原生質(zhì)體制備試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶壁酶＋蝸牛酶＋纖維素酶的組合酶效果最佳，同時要選用針對食用菌菌絲壁有強破壁效果的溶壁酶，否則效果會大打折扣[14-17]。

本研究綜合單因素試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗，探究各影響因素對六妹羊肚菌原生質(zhì)體制備的影響，結(jié)果表明，酶解時間對羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量影響最大。 這可能與羊肚菌菌絲細(xì)胞壁中有大量S-葡聚糖有關(guān)，需要更長的酶解時間以破壞菌絲壁，釋放原生質(zhì)體；隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并且在超過3%后急劇下降，這可能是因為細(xì)胞膜的完整性和原生質(zhì)體的生理活性受到酶的影響，濃度過高的酶液對原生質(zhì)體膜產(chǎn)生了毒性作用[18-20]。 適當(dāng)?shù)拿附鉁囟韧瑯臃浅Ｖ匾?，可以提高酶活性，但過高的酶解溫度會導(dǎo)致酶失活，本研究也驗證了此現(xiàn)象，即在酶解溫度40 ℃時原生質(zhì)體產(chǎn)量下降明顯，并且酶解溫度與酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)交互作用顯著，因此，試驗過程要保證酶解溫度充分可控，偏差不超過±1 ℃。

由于不同物種的細(xì)胞壁組成不同，因此不同物種細(xì)胞對滲透壓的選擇是不同的[21]。 本研究選擇0.6 mol/L 甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備原生質(zhì)體的效果最佳，這與王珂[22]制備羊肚菌原生質(zhì)體穩(wěn)滲劑的選擇結(jié)果相一致；但與陳芳草等[13]以0.3 mol/L KCl 和0.3 mol/L 環(huán)己六醇配合使用再生率高的結(jié)果不一致。 分析其原因，可能與所用菌株的特性相關(guān)，本研究使用的六妹羊肚菌子實體中等至稍大，菌蓋呈圓錐形，成熟期菌蓋為褐色至黑褐色，子實體長8 ～15 cm，為商品化栽培菌種。本研究原生質(zhì)體再生率最高的穩(wěn)滲劑為0.6 mol/L蔗糖溶液，這與崔宗強等[15]的研究結(jié)果一致，考慮兼顧原生質(zhì)體產(chǎn)量，本研究最終選擇0.6 mol/L甘露醇為原生質(zhì)體制備和再生過程中的穩(wěn)滲劑。但本研究中羊肚菌原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率均偏低，遠(yuǎn)低于香菇、蛹蟲草、玉木耳等，還需進一步研究探索。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化獲得羊肚菌原生質(zhì)體制備的最佳條件:酶解時間3.2 h、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.3%、酶解溫度30 ℃、穩(wěn)滲劑0.6 mol/L 甘露醇，在此條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)(5.13±0.13)×105個/mL；酶解條件對原生質(zhì)體得率的影響程度為:酶解時間＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶解溫度。 本研究結(jié)果可為后續(xù)羊肚菌原生質(zhì)體融合、單核自交、雜交等優(yōu)良菌種的選育提供技術(shù)支撐。