提高解淀粉芽胞桿菌PHODG36 芽胞耐熱性的技術(shù)研究

張曉云, 叢 蓉, 趙衛(wèi)松, 曲遠(yuǎn)航, 蘇振賀,鹿秀云, 郭慶港, 李社增, 馬 平

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

芽胞是芽胞桿菌Bacillusspp.在生長發(fā)育后期形成的一種抗逆性很強(qiáng)的休眠體，可耐受多種不良環(huán)境條件，如熱、干旱和紫外線等，常被用作有效成分研制微生物殺菌劑，其劑型有可濕性粉劑、水分散片劑、粉塵劑、干懸浮劑和微粉劑等，其中以可濕性粉劑居多[1-6]。干粉原藥是研發(fā)上述微生物殺菌劑的核心原料，通常是由發(fā)酵濃縮液通過噴霧干燥而獲得。噴霧干燥是將制備好的發(fā)酵濃縮液霧化成細(xì)微的霧滴，并進(jìn)入干燥室內(nèi)與高溫空氣接觸，通過熱空氣交換，使水分氣化，最終獲得固態(tài)粉末的過程[7]。雖然芽胞抗逆性強(qiáng)，但噴霧干燥過程中的瞬時(shí)高溫度氣流會對芽胞造成多重脅迫，造成部分芽胞死亡，從而導(dǎo)致回收率降低。因此，噴霧干燥過程中，如何提高芽胞存活率，成為當(dāng)前微生物殺菌劑研發(fā)過程中干粉原藥高效生產(chǎn)亟需解決的問題，其中提高芽胞耐熱性是解決該問題的關(guān)鍵所在。

芽胞耐熱性的提高，可以通過菌株自身耐熱性提高來完成，但微生物自然突變率極低，可采用人工手段誘導(dǎo)其發(fā)生突變。微生物誘變育種，是利用物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)基因產(chǎn)生突變，并結(jié)合高效快速的篩選方法，獲得性狀優(yōu)良的突變菌株的一種誘變方法，包括紫外誘變、超聲波誘變、溫度誘變和亞硝酸誘變等[8]。微生物生長需要一定的溫度，改變溫度必然會影響其體內(nèi)的多種生物化學(xué)反應(yīng)。吳明霞等[9]采用變溫方式對獸疫鏈球菌進(jìn)行誘變處理，獲得了透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高48.0%的誘變菌株；李瑾[10]對炭樣小單孢菌進(jìn)行熱誘變，篩選獲得1 株抗生素產(chǎn)生能力提高98.5%的誘變菌株。但目前尚未見利用溫度誘變選育芽胞耐熱性提高菌株的研究報(bào)道。

抗熱保護(hù)劑的篩選與應(yīng)用，是提高芽胞耐熱性的另一關(guān)鍵途徑。保護(hù)劑能夠減少噴霧干燥過程中的細(xì)胞損傷，從而提高存活率[11]。肖懷秋等[12]研究表明，海藻糖、蔗糖及脫脂奶粉對枯草芽胞桿菌Prob1822 菌株的保護(hù)效果較好，菌體存活率均高于80%以上；Agudelo 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖與海藻糖能提高保加利亞乳桿菌的菌體存活率；張凱[14]通過在枯草芽胞桿菌Bs-208 發(fā)酵濃縮液中添加熱保護(hù)劑 (0.1% PEG4000 + 0.3%蔗糖 + 0.2%NaCl)，能將該菌株芽胞存活率提高18.1%。

解淀粉芽胞桿菌PHODG36 是本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的一株具有廣譜抑菌作用的生防菌株[15]，對多種土傳病害防效較好。本研究以該菌株為研究對象，通過熱處理誘變與變溫誘變，獲得該菌株芽胞耐熱性提高的誘變菌株，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)，研究了多種保護(hù)劑在濕熱條件下的保護(hù)性能及其發(fā)揮最佳保護(hù)效果的用量與處理?xiàng)l件，旨在為該菌株干粉原藥的噴霧干燥生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料及儀器

1.1.1 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉5g，水1000mL，pH7.0～7.5。LB 固體培養(yǎng)基：每1000mLLB 液體培養(yǎng)基中，加入15g 瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉30g，豆餅粉20g，NaH2PO44g，KH2PO40.3g，Na2CO31g，MgSO40.5g，CaCO32g，水1000mL，pH 7.0～7.5。低谷氨酸鹽甘油(minimalsaltsglycerol glutamate，MSGG)培養(yǎng)基：3-(N-嗎啡啉)丙磺酸10mmol/L，甘油0.5%，谷氨酸0.5%，K3PO45mmol/L，色氨酸50μg/mL，苯丙氨酸50μg/mL，硫胺素2μmol/L，MgCl22mmol/L，CaCl2700 μmol/L，F(xiàn)eCl350μmol/L，MnCl250μmol/L，ZnCl21μmol/L。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA) 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 mL。

1.1.2病原菌 大麗輪枝菌Verticillium dahliae和立枯絲核菌Rhizoctonia solani，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離并保存。

1.1.3儀器 DK-8D 恒溫水浴鍋(常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)；LC-MSB-HD 變溫發(fā)酵裝置：磁力攪拌器(上海力辰儀器科技有限公司)+具擋板三角搖瓶(1L，四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司)；SZX16 體視顯微鏡(OlympusCorporation)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽胞懸浮液的制備 挑取活化的供試菌株單菌落，接種于盛有100mLLB 液體培養(yǎng)基的三角瓶(容量300mL)中，于30℃、180r/min 條件下培養(yǎng)12h，得到種子液；吸取種子液，以2%的接種量接種于盛有100mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶(容量300mL)中，于30℃、180r/min 條件下培養(yǎng)48h，得到供試菌株發(fā)酵液；80℃水浴15min，去除其中殘留的營養(yǎng)體[16]，即為供試菌株的芽胞懸浮液。

2.2每周一設(shè)為消毒供應(yīng)中心開放日,由護(hù)士長和帶教老師負(fù)責(zé)接待和講解,參觀人員必須在指導(dǎo)下做好自我防護(hù)。

1.2.2 芽胞耐熱性的檢測 采用稀釋平板涂布法[17]。首先，測定上述芽胞懸浮液中的芽胞含量作為初始芽胞含量；然后，量取適量芽胞懸浮液，置于滅菌離心管中，100℃水浴30min，測定其芽胞含量作為存活芽胞含量。按照公式(1)計(jì)算芽胞存活率。以芽胞存活率為指標(biāo)評價(jià)其耐熱性。

式中：Sr為芽胞存活率；Sc為存活芽胞含量，CFU/mL；Ic為初始芽胞含量，CFU/mL。

1.2.3 PHODG36 菌株芽胞耐熱性提高菌株的篩選

1.2.3.1 PHODG36 菌株的熱處理誘變 取5 mL PHODG36 菌株芽胞懸浮液于滅菌離心管中，100 ℃水浴60 min，取出，采用稀釋平板涂布法[17]涂平板，在存活的芽胞中隨機(jī)挑選10 株，轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中，按1.2.1 節(jié)方法制備各菌株芽胞懸浮液，檢測芽胞耐熱性。以野生型菌株P(guān)HODG36為對照，篩選芽胞耐熱性提高的誘變菌株。

1.2.3.2 PHODG36 菌株的變溫發(fā)酵誘變 從1.2.3.1 節(jié)試驗(yàn)結(jié)果中，選取芽胞存活率較好的菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行變溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間及其對應(yīng)的培養(yǎng)溫度如表1 所示，轉(zhuǎn)速800 r/min，通氣量0.6 L/min。發(fā)酵結(jié)束后采用稀釋平板涂布法[17]涂平板，從每株出發(fā)菌株后代中隨機(jī)挑選4 株，轉(zhuǎn)至LB 液體培養(yǎng)基中，按1.2.1 節(jié)方法制備各誘變菌株芽胞懸浮液，檢測芽胞耐熱性。以野生型菌株P(guān)HODG36 為對照，篩選芽胞耐熱性提高的誘變菌株。

表1 發(fā)酵時(shí)間及相應(yīng)培養(yǎng)溫度Table 1 Fermentation time and corresponding culture temperature

1.2.4 不同恒溫發(fā)酵培養(yǎng)中誘變菌株芽胞耐熱性提高的效果 按照1.2.1 節(jié)方法制備野生型菌株P(guān)HODG36 及誘變菌株BBW-11 種子液，將種子液以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于30℃與37℃下，180r/min 培養(yǎng)48h，制備2 菌株的芽胞懸浮液，檢測其芽胞耐熱性，對誘變菌株BBW-11 提高芽胞耐熱性的效果進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.6 野生型菌株與誘變菌株生物學(xué)特性的比較

將野生型菌株P(guān)HODG36 及誘變菌株BBW-11 分別接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)12～15h，離心收集菌體并用超純水懸浮，調(diào)整至濃度相同(OD600=1.0)，得到兩菌株的菌體懸浮液，備用。

1.2.6.1 菌落形態(tài)比較 各取2 個(gè)供試菌株的菌懸液1 μL，接種到 LB 固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，顯微觀察兩菌株的菌落形態(tài)。每個(gè)菌株3 次重復(fù)[18]。

1.2.6.2 生物膜形成情況比較 采用結(jié)晶紫法[19]。分別取2 個(gè)供試菌株的菌懸液50 μL，加至裝有2 mL MSGG 培養(yǎng)基的離心管中，用移液器吹吸混勻，轉(zhuǎn)入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別于24 h 和48 h 觀察兩菌株生物膜的形成情況。觀察完后，吸出培養(yǎng)孔中的MSGG 培養(yǎng)液，保留表層生物膜，用無菌水清洗2 次，自然風(fēng)干2 h，用2 mL0.1%結(jié)晶紫 (W/V) 染液染色30 min，之后將結(jié)晶紫染液吸出，用無菌水清洗培養(yǎng)孔和生物膜2 次，然后加入2 mLV(乙醇) :V(丙酮) =4 : 1 混合液，溶解吸附在生物膜上的結(jié)晶紫，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定OD570。每個(gè)菌株3 次重復(fù)。

1.2.6.3 生長動態(tài)比較 分別取兩個(gè)供試菌株的菌懸液2 mL，接種于100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)48 h，每隔4 h 取樣測定發(fā)酵液中的菌體濃度，并繪制生長曲線[18]。

1.2.6.4 抑菌作用比較 采用對峙培養(yǎng)法[20]比較野生型菌株P(guān)HODG36 及誘變菌株BBW-11 對大麗輪枝菌和立枯絲核菌的抑菌活性。在直徑9 cm的PDA 平板中央，分別接種新培養(yǎng)的直徑5 mm的大麗輪枝菌和立枯絲核菌菌盤；在距離菌盤2 cm處，用滅菌牙簽接種新活化的野生型菌株P(guān)HODG36及誘變菌株BBW-11，以不接種兩菌株的病原菌平板為對照，每個(gè)供試菌株3 次重復(fù)。25 ℃ 培養(yǎng)3～10 d，測量對照病原菌的菌落半徑和兩菌株處理后的菌落半徑，按公式 (2) 計(jì)算抑菌率。

式中：Ir為抑菌率；Cr為對照菌落半徑,mm；Tr為處理菌落半徑, mm。

1.2.7 芽胞熱保護(hù)劑種類、用量及處理?xiàng)l件的篩選 采用四因素五水平的正交試驗(yàn)，對芽胞熱保護(hù)劑的種類、用量與處理?xiàng)l件進(jìn)行篩選，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。按照1.2.1 節(jié)的方法制備誘變菌株BBW-11 芽胞懸浮液，在其中添加不同濃度的保護(hù)劑并混合均勻，然后在不同溫度下水浴處理不同時(shí)間，檢測不同處理的芽胞耐熱性(以未處理的誘變菌株BBW-11 芽胞含量為初始芽胞含量)，篩選提高誘變菌株BBW-11 芽胞耐熱性的最適保護(hù)劑及其用量與處理?xiàng)l件組合。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 2 The factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2010 和Origin 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖。利用IBM SPSS 19.0 軟件，通過單因素方差分析 (利用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較) 與獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHODG36 菌株芽胞耐熱性提高菌株的篩選

2.1.1 PHODG36 菌株的熱處理誘變 結(jié)果(圖1)表明：經(jīng)100℃水浴處理30min 后，各誘變菌株與野生型PHODG36 菌株的芽胞存活率(1.2%)無顯著性差異，因此選擇芽胞存活率提高較多的B1、B2、B3、B8 與B9 這5 個(gè)誘變菌株(芽胞存活率分別提高7.5%、4.0%、4.9%、3.3%和9.8%)進(jìn)行下一步的研究。

圖1 100 ℃處理30 min 后解淀粉芽胞桿菌PHODG36菌株后代菌系的芽胞存活率Fig.1 The spore survival rate of the progeny isolates of B.amyloliquefaciens PHODG36 after heat-treating at 100 ℃ for 30 min

2.1.2 PHODG36 菌株的變溫發(fā)酵誘變 將B1、B2、B3、B8 與B9 這5 個(gè)菌株進(jìn)行變溫發(fā)酵培養(yǎng)后，從每個(gè)菌株的后代菌株中隨機(jī)挑選4 株制備芽胞懸浮液，檢測芽胞耐熱性。結(jié)果(圖2)表明：誘變菌株BBW-11 的芽胞存活率最高，達(dá)到1.6%，與誘變菌株BBW-12(1.5%)無顯著性差異；其次為誘變菌株BBW-14，芽胞存活率為1.4%；這3 株菌的芽胞存活率均顯著高于野生型菌株P(guān)HODG36(1.1%)。其中，誘變菌株BBW-11的芽胞存活率比野生型菌株P(guān)HODG36 提高55.0%，因此，選擇該誘變菌株繼續(xù)進(jìn)行下一步的研究。

圖2 變溫培養(yǎng)處理后解淀粉芽胞桿菌PHODG36 菌株后代菌系的芽胞存活率Fig.2 The spore survival rates of the progeny isolates of B.amyloliquefaciens PHODG36 after variable temperature culture

2.2 不同恒溫發(fā)酵培養(yǎng)對誘變菌株BBW-11 芽胞耐熱性提高的效果

結(jié)果 (圖3) 表明：在30 和37℃培養(yǎng)溫度下，同一個(gè)供試菌株的芽胞存活率無顯著性差異；但在相同培養(yǎng)溫度下，誘變菌株BBW-11 的芽胞存活率顯著高于野生型菌株P(guān)HODG36，30 ℃和37 ℃時(shí)其芽胞存活率比野生型菌株P(guān)HODG36分別提高51.7%和52.3%。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下野生型PHODG36 及其誘變菌株BBW-11 的芽胞存活率Fig.3 The spore survival rates of wild-type strain PHODG36 and the mutant isolate BBW-11 cultured at different temperatures

2.3 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性測定結(jié)果

結(jié)果 (圖4) 表明：傳代7 代后，野生型菌株P(guān)HODG36 和誘變菌株BBW-11 的芽胞存活率均有所下降 (下降率分別為17.1%和8.9%)，但誘變菌株BBW-11 的芽胞存活率仍顯著高于野生型菌株P(guān)HODG36，說明誘變菌株BBW-11 的芽胞耐熱能力具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 野生型菌株P(guān)HODG36 與誘變菌株BBW-11 的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 The genetic stability of wild-type strain PHODG36 and the mutant isolate BBW-11

2.4 野生型菌株P(guān)HODG36 與誘變菌株BBW-11的生物學(xué)特性比較

2.4.1 菌落形態(tài)比較 在LB 固體培養(yǎng)基平板上比較了野生型菌株P(guān)HODG36 和誘變菌株BBW-11 的菌落形態(tài)，結(jié)果(圖5)表明：兩個(gè)菌株在LB 固體培養(yǎng)基上均能形成表面褶皺的、具有立體結(jié)構(gòu)的菌落形態(tài)，沒有明顯的區(qū)別。

圖5 野生型菌株P(guān)HODG36 與誘變菌株BBW-11菌落形態(tài)比較Fig.5 Comparison of the colony morphologies between wild-type strain PHODG36 and mutant isolate BBW-11

2.4.2 生物膜形成能力比較 在MSGG 培養(yǎng)基中定性比較了野生型菌株P(guān)HODG36 和誘變菌株BBW-11 的生物膜形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)24h后，兩個(gè)菌株均已形成具有明顯褶皺的生物膜；培養(yǎng)48h 后，兩個(gè)菌株均在液體表面形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)(圖6A)。兩個(gè)菌株表觀上無明顯差異。采用結(jié)晶紫染色法[19]定量測定了兩個(gè)菌株的生物膜形成能力，結(jié)果表明，在培養(yǎng)24h 與48h 這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩個(gè)菌株生物膜形成能力均無顯著性差異(圖6B)。

2.4.3 生長動態(tài)比較 在發(fā)酵培養(yǎng)基中比較了野生型菌株P(guān)HODG36 和誘變菌株BBW-11 的生長動態(tài)，結(jié)果 (圖7) 表明：在所有取樣階段，兩個(gè)菌株均生長旺盛，生長速率沒有明顯區(qū)別，8 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，24 h 時(shí)菌體濃度達(dá)到最大值且無顯著性差異。2.4.4 抑菌作用比較 采用平板對峙法[20]比較了野生型菌株P(guān)HODG36 和誘變菌株BBW-11 的抑菌作用。結(jié)果 (圖8) 表明：兩個(gè)菌株對立枯絲核菌的抑菌率分別為81.3%和80.9%，無顯著性差異；對大麗輪枝菌的抑菌率分別為86.7%和87.5%，也無顯著性差異。

圖7 野生型菌株P(guān)HODG36 與誘變菌株BBW-11 的生長動態(tài)曲線Fig.7 Comparison of the growth curves between wildtype strain PHODG36 and mutant isolate BBW-11

圖8 野生型菌株P(guān)HODG36 與誘變菌株BBW-11 的抑菌作用比較Fig.8 Comparison of antifungal activities between wildtype strain PHODG36 and mutant isolate BBW-11

2.5 芽胞熱保護(hù)劑種類、用量及處理?xiàng)l件的篩選

以BBW-11 菌株的芽胞存活率為指標(biāo)，對保護(hù)劑的種類、用量、處理溫度及時(shí)間進(jìn)行了篩選。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素水平組合間芽胞存活率差異較大。直觀分析結(jié)果表明，處理15(A3B5C2D4) 的芽胞存活率最高，達(dá)到4.8%；而正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明，因素C 處理溫度的delta 值最大，說明處理溫度對芽胞存活率的影響最大，其次為因素A 保護(hù)劑，因素D 處理時(shí)間的影響最小 (表3)，因此最佳組合應(yīng)為A1B4C2D5。正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析 (表4) 表明，因素C 的P< 0.05，即處理溫度對芽胞存活率的影響顯著(P= 0.05)；因素A 的P< 0.10，即保護(hù)劑對芽胞存活率存在一定的影響；因素B 與D 的P>0.10，即保護(hù)劑濃度與處理時(shí)間對芽胞存活率無顯著性影響。因此，綜合直觀分析與方差分析的結(jié)果，再加上成本因素考慮，選擇A3B1C2D1 為最佳組合。將A 3 B 5 C 2 D 4、A 1 B 4 C 2 D 5 和A3B1C2D1 這3 個(gè)組合進(jìn)行芽胞耐熱性的驗(yàn)證，結(jié)果表明，組合A3B5C2D4 的芽胞存活率最高，達(dá)到5.0%；組合A3B1C2D1 的芽胞存活率為4.9%，與組合A3B5C2D4 無顯著性差異；組合A1B4C2D5 的芽胞存活率最低，為4.5%，與組合A3B1C2D1無顯著性差異，但顯著低于組合A3B5C2D4。綜上，選擇A3B1C2D1 為最優(yōu)組合，即保護(hù)劑為蔗糖，濃度為0.5%，處理溫度為55 ℃，熱處理時(shí)間為0.5 h，此時(shí)的芽胞存活率比未處理的誘變菌株BBW-11 提高了2.3 倍，比野生型菌株P(guān)HODG36 提高了2.8 倍 (圖9)。

圖9 不同處理因子組合對誘變菌株BBW-11芽胞存活率的影響Fig.9 The effects of different treatment factor combinations on the spore survival rate of mutant isolate BBW-11

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 The results of different treatments in orthogonal experimental design

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal design results

3 結(jié)論與討論

目前，芽胞桿菌微生物殺菌劑的粉劑工業(yè)化生產(chǎn)仍存在諸多問題，如成本高、貨架期短等。其中，干粉原藥生產(chǎn)成本高是導(dǎo)致制劑加工成本高的最重要的直接原因。干粉原藥生產(chǎn)過程中，作為有效成分的芽胞，由液體懸浮狀態(tài)經(jīng)過噴霧干燥或沸騰干燥等干燥過程轉(zhuǎn)化為干粉狀態(tài)時(shí)死亡率過高[5,21]，進(jìn)而造成生產(chǎn)成本高。提高菌株自身的芽胞耐熱性是提高芽胞存活率的重要途徑。由于微生物自發(fā)突變的概率較低，誘變育種技術(shù)因具有突變率高、誘變手段簡單等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于高產(chǎn)抗生素或酶的微生物菌株誘變領(lǐng)域[10,22]。但目前尚未見到將溫度誘變應(yīng)用于選育芽胞耐熱性提高菌株的研究報(bào)道。本研究通過熱處理誘變和變溫誘變，獲得一株芽胞耐熱性顯著提高的誘變菌株BBW-11，其芽胞存活率相比野生型菌株P(guān)HODG36 提高了55.0%，且其在菌落形態(tài)、生物膜形成、生長動態(tài)和抑菌作用方面的生物學(xué)特性未發(fā)生明顯改變；傳代培養(yǎng)的結(jié)果表明，誘變菌株BBW-11 的芽胞耐熱能力具有較好的遺傳穩(wěn)定性。表明變溫誘變是選育芽胞耐熱性提高菌株的一條有效途徑。

熱保護(hù)劑的使用是研制高活性微生物殺菌劑制劑的關(guān)鍵[23]。在噴霧干燥前加入載體/保護(hù)劑，可以通過形成含水量低的結(jié)晶性粉末，達(dá)到提高微生物回收率或酶活性的目的[24]。肖懷秋等[12]發(fā)現(xiàn)，添加脫脂奶粉 (5%)、海藻糖 (8%) 和蔗糖(5%) 后，枯草芽胞桿菌Prob1822 的菌體存活率均高于80%以上；趙越[25]研究報(bào)道，10%和25%的蔗糖均可顯著提高嗜熱脂肪芽胞桿菌ATCC7953的耐熱性。本研究同樣篩選出BBW-11 菌株的適宜保護(hù)劑為0.5%的蔗糖，經(jīng)55 ℃熱處理0.5 h，此時(shí)的芽胞存活率為4.9%，比未處理的誘變菌株BBW-11 提高了2.3 倍，比野生型菌株P(guān)HODG36提高了2.8 倍，表明通過保護(hù)劑和芽胞懸浮液熱儲存聯(lián)合應(yīng)用是提高芽胞耐熱性一條高效措施。糖類通過化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基與細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵或水化層，從而保護(hù)細(xì)胞膜或生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，達(dá)到保護(hù)菌體抗熱的目的[26]。而本研究中蔗糖對提高芽胞耐熱性的作用機(jī)制，還需要更深層的研究。還有研究表明，保護(hù)劑之間存在協(xié)同增效作用。如范娜等[27]選取海藻糖、明膠和甘油作為復(fù)合保護(hù)劑，對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌混合菌體的抗熱保護(hù)效果較好，菌體存活率可達(dá)16.6%，活菌數(shù)為1.7 × 108CFU/mL；張雯等[28]研究報(bào)道，以明膠、阿拉伯膠和海藻糖作為復(fù)合保護(hù)劑，枯草芽孢桿菌BS08 微生態(tài)制劑的活菌數(shù)最高可達(dá)6.0 × 1014CFU/g。而本研究僅針對單一保護(hù)劑進(jìn)行了研究，保護(hù)劑復(fù)配是否具有協(xié)同作用還需要進(jìn)一步研究。