蘭州市寵物貓隱孢子蟲(chóng)流行情況調(diào)查及分子生物學(xué)鑒定

李雅琪，王玉桂，鄒揚(yáng)，張?jiān)芦h，馬平平，葉得河，王帥，馬永華*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動(dòng)物寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)是一種重要專性胞內(nèi)寄生且具有人畜共患性的機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，可感染多種脊椎動(dòng)物[1-3]。由隱孢子蟲(chóng)感染導(dǎo)致的隱孢子蟲(chóng)病是人類最常見(jiàn)的6種腹瀉病之一[4]。隱孢子蟲(chóng)主要通過(guò)糞-口途徑和水源傳播[5-6]，其卵囊進(jìn)入宿主體內(nèi)后，定殖在消化道上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行發(fā)育[7-8]。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，隱孢子蟲(chóng)可感染所有脊椎動(dòng)物，且通?；疾?dòng)物會(huì)通過(guò)糞-口途徑和水源途徑感染人類，嚴(yán)重威脅人類健康[9]。免疫力正常人群感染會(huì)出現(xiàn)急性自限性腹瀉，免疫力低下和免疫缺陷人群感染可引起水樣腹瀉，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及患者生命。

研究表明，伴侶動(dòng)物，特別是寵物犬貓，不僅對(duì)寵物主人的心理健康有著正向的影響，同時(shí)對(duì)于部分疾病也有著輔助治療的作用[10]。寵物貓作為常見(jiàn)的隱孢子蟲(chóng)宿主，長(zhǎng)期與寵主接觸增加了人獸共患傳染病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。1979年研究者首次在寵物貓身上發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲(chóng)[11]。對(duì)寵物貓糞便中隱孢子蟲(chóng)的基因研究表明，其感染蟲(chóng)種主要為貓隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumfelis)[12-16]。貓隱孢子蟲(chóng)極易傳染給人類，已有部分亞型在兒童、免疫正常病人、免疫缺陷病人及其他多種動(dòng)物的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)，貓隱孢子蟲(chóng)已被列為感染人類的5個(gè)重要蟲(chóng)種之一[3]，并在大量人隱孢子蟲(chóng)病例中報(bào)道。Meng等[11]將1988—2021年貓隱孢子蟲(chóng)感染全球流行狀況進(jìn)行了系統(tǒng)性回顧分析，整理繪制出全球貓隱孢子蟲(chóng)的流行地圖，發(fā)現(xiàn)全球貓隱孢子蟲(chóng)的感染率在0.6%～40.8%，其中肯尼亞的貓隱孢子蟲(chóng)感染率為40.8%(95%置信區(qū)間：31.4～50.5)，顯著高于其他國(guó)家和地區(qū)，中國(guó)地區(qū)的貓隱孢子蟲(chóng)感染率為3.4%(95%置信區(qū)間：1.8～5.2)。

隱孢子蟲(chóng)基因組已有幾個(gè)遺傳位點(diǎn)被開(kāi)發(fā)并作為分子診斷工具供臨床使用來(lái)鑒定蟲(chóng)種亞型。其中擴(kuò)增小亞基核糖體RNA(SSU rRNA)基因位點(diǎn)的方法使用較廣泛[17-18]。本試驗(yàn)基于SSU rRNA序列采用套式PCR擴(kuò)增調(diào)查蘭州市寵物貓隱孢子蟲(chóng)的感染情況，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定感染蟲(chóng)種亞型，分析易感因素，為預(yù)防控制隱孢子蟲(chóng)感染提供理論依據(jù)[19-23]。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源與保存

2020年1月至2022年6月從蘭州市五大主城區(qū)的寵物醫(yī)院、繁育貓舍及寵物市場(chǎng)獲取寵物貓糞便，保存于一次性無(wú)菌離心管中，記錄寵物貓品種、年齡、性別、來(lái)源等信息。將樣品及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80 ℃冰箱中。各城區(qū)樣品分布情況如圖1所示。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 糞便DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；r-TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、6×Loading Buffer、25 mmol MgCl2、DL1000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；50× TAE購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；溴化乙錠(EB)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

M.相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照；1～10. 糞便樣品。圖2 隱孢子蟲(chóng)SSU rRNA套式PCR擴(kuò)增結(jié)果

1.3 糞便DNA提取

為提高糞便純度，先進(jìn)行預(yù)處理。將糞便置于50 mL燒杯中，加入40 mL ddH2O混勻后，用60目的金屬過(guò)濾篩過(guò)濾，濾液收集在50 mL離心管內(nèi)，8 000 r/min，離心10 min，棄去上清液，沉淀用于后續(xù)試驗(yàn)。取200 mg沉淀于2 mL無(wú)菌離心管中，參照OMRGA E.Z.NVA.?Stool DNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取糞便中的DNA，并于-20 ℃保存。

1.4 套式PCR擴(kuò)增

基于SSU rRNA序列，引用參考文獻(xiàn)[19]中擴(kuò)增引物。擴(kuò)增第1輪上游引物為：5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′，下游引物為：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′；第2輪擴(kuò)增上游引物為：5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，下游引物為：5′-GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG-3′。引物由西安擎科澤西生物有限公司負(fù)責(zé)合成。對(duì)所提取的DNA樣品進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，套式PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)共進(jìn)行2輪，第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物作為第2輪的模板。

1.5 核酸電泳及測(cè)序分析

取終輪PCR產(chǎn)物5 μL與1 μL DNA Loading Buffer混勻后加入含有溴化乙錠(EB)的1.2%瓊脂糖凝膠中，160 V電泳15 min，置于成像系統(tǒng)中拍照檢測(cè)，將有目的條帶的PCR樣品原液送至西安擎科澤西生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件編輯和校準(zhǔn)序列，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)來(lái)確定蟲(chóng)種亞型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以蘭州市寵物貓的年齡、品種、性別、季節(jié)、采樣地區(qū)及樣品來(lái)源作為試驗(yàn)相關(guān)因素，利用SPSS 25.0分析軟件中的風(fēng)險(xiǎn)因素和χ2檢驗(yàn)，分析寵物貓隱孢子蟲(chóng)的感染率和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，通過(guò)計(jì)算其感染率的優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)和95%置信區(qū)間，分析貓隱孢子蟲(chóng)在不同來(lái)源、地區(qū)、季節(jié)、年齡、品種及性別之間是否存在顯著差異，當(dāng)P<0.05或P<0.01時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 遺傳進(jìn)化及發(fā)育分析

從NCBI網(wǎng)站的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載部分貓隱孢子蟲(chóng)的序列作為參考序列，并將本試驗(yàn)中的基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取基因號(hào)，運(yùn)用MRGA 11軟件中的最大似然(Maximum Likelihood)法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭州市寵物貓隱孢子蟲(chóng)感染情況

運(yùn)用套式PCR擴(kuò)增法，對(duì)隱孢子蟲(chóng)的SSU rRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，在655份樣品中，成功擴(kuò)增出了26份陽(yáng)性樣品，總感染率為3.97%(26/655)。部分樣品的凝膠電泳圖如圖1所示，擴(kuò)增出的目的片段大小約為380 bp。

2.2 不同年齡組寵物貓感染情況

對(duì)寵物貓年齡進(jìn)行分組，分別計(jì)算隱孢子蟲(chóng)感染率，結(jié)果顯示，3～10月齡的寵物貓感染率最高為6.16%，1～3月齡寵物貓感染率次之為3.85%，不同年齡段的感染情況詳見(jiàn)表1。感染組中年齡最小為2月齡，最大為4歲3月齡，由此可見(jiàn)，隱孢子蟲(chóng)可以感染各個(gè)年齡段的寵物貓，且各年齡段之間感染情況并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同年齡、性別、品種寵物貓隱孢子蟲(chóng)感染情況

2.3 不同性別寵物貓感染情況

在收集的655份樣品中，雄性樣品占47%，雌性樣品占53%，不同性別的寵物貓感染情況詳見(jiàn)表1。通過(guò)計(jì)算可知，不同性別之間的感染率無(wú)顯著差異。

2.4 不同品種寵物貓感染情況

本試驗(yàn)共涉及21個(gè)常見(jiàn)寵物貓品種，包括中華田園貓、美國(guó)短毛貓、英國(guó)短毛貓、加菲貓、布偶貓、藍(lán)貓、銀點(diǎn)貓、銀漸層貓、金漸層貓、斯芬克斯無(wú)毛貓、阿比西尼亞貓等，其中有6個(gè)品種檢出隱孢子蟲(chóng)，各品種感染情況詳見(jiàn)表1，在本次試驗(yàn)中，金漸層貓的感染率最高為18.18%，且不同品種之間的感染率存在顯著的差異(P<0.05)。由此推斷，寵物貓的品種是影響隱孢子蟲(chóng)感染的主要因素之一。

2.5 不同地區(qū)寵物貓感染情況

本試驗(yàn)采樣區(qū)域?yàn)樘m州市五大主城區(qū)(城關(guān)區(qū)、七里河區(qū)、安寧區(qū)、西固區(qū)、紅谷區(qū))，主城區(qū)中，僅有城關(guān)區(qū)與七里河區(qū)檢出陽(yáng)性樣品，各地區(qū)的感染情況如表2所示，城關(guān)區(qū)與區(qū)七里河區(qū)的感染率分別為7.52%和3.35%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)可知，不同地區(qū)之間感染率并無(wú)顯著差異。

表2 不同地區(qū)、季節(jié)、來(lái)源寵物貓隱孢子蟲(chóng)感染情況

2.6 不同季節(jié)寵物貓感染情況

試驗(yàn)樣品采集耗時(shí)1.5年，根據(jù)采樣季節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行劃分，各季節(jié)寵物貓隱孢子蟲(chóng)感染情況如表2所示，各季節(jié)采集的樣品均有檢出隱孢子蟲(chóng)，夏季共采集樣品235個(gè)，占樣本總數(shù)的36%，感染率為7.66%，感染率顯著高于其他3個(gè)季節(jié)，不同季節(jié)感染率之間也存在顯著的差異(P<0.05)。因此季節(jié)因素也是影響寵物貓感染隱孢子蟲(chóng)的主要因素之一。

2.7 不同來(lái)源寵物貓感染情況

樣品分別來(lái)自寵物市場(chǎng)、繁育貓舍及寵物醫(yī)院，不同來(lái)源地的感染情況詳見(jiàn)表2。寵物市場(chǎng)的感染率(7.96%)遠(yuǎn)高于繁育貓舍(4.56%)及寵物醫(yī)院(1.93%)。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采樣場(chǎng)所之間感染率的差異也較為顯著(P<0.05)。樣品來(lái)源地也是影響隱孢子蟲(chóng)感染的因素之一。

2.8 隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定及遺傳進(jìn)化發(fā)育分析

對(duì)26份PCR陽(yáng)性樣品測(cè)序鑒定，結(jié)果均為貓隱孢子蟲(chóng)。使用MEGA 11軟件采用最大似然(Maximum Likelihood)法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。測(cè)序樣品與已鑒定出的貓隱孢子蟲(chóng)(基因登記號(hào)為KY882321.1)的相似性為99%以上。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，所有陽(yáng)性樣品均與中國(guó)上海地區(qū)鑒定出的貓隱孢子蟲(chóng)(基因登記號(hào)為MT458670)位于同一分支上，且發(fā)育樹(shù)中的Bootstrap值較高，提示兩種分離珠遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。本研究中鑒定的貓隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了基因登記號(hào)為OP345050～OP345056。

▲為本試驗(yàn)陽(yáng)性樣品。圖3 基于SSU rRNA基因位點(diǎn)得到的貓隱孢子蟲(chóng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)

3 討論

3.1 不同來(lái)源地感染率差異分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，不同來(lái)源地的寵物貓感染隱孢子蟲(chóng)的情況有所不同，這可能與飼養(yǎng)方式和生活環(huán)境有關(guān)。分析采樣信息可知，46.9%的樣品來(lái)自于繁育貓舍，這些貓舍大多存在于居民住宅區(qū)中，飼養(yǎng)密度大，空間相對(duì)局限，且存在共用貓砂盆、食碗、水碗等現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)個(gè)體感染，極易引起群體暴發(fā)感染。繁育貓舍寵物貓數(shù)量過(guò)多，寵主難免會(huì)照顧不周，忽視其健康問(wèn)題。建議繁育貓舍控制飼養(yǎng)密度，加強(qiáng)環(huán)境的清潔，定期對(duì)貓砂盆進(jìn)行消毒清潔，更換貓砂，及時(shí)對(duì)食碗、水碗進(jìn)行清洗消毒。

在本試驗(yàn)中，來(lái)自寵物市場(chǎng)的寵物貓隱孢子蟲(chóng)的感染率也較高，這些寵物貓與外界環(huán)境接觸較為頻繁，部分寵物貓是從外地引進(jìn)，對(duì)之前的生活飼養(yǎng)史了解甚少，有可能之前已經(jīng)感染了隱孢子蟲(chóng)，但由于沒(méi)有明顯癥狀出現(xiàn)，無(wú)法進(jìn)行判斷。對(duì)于寵物醫(yī)院樣本，調(diào)查寵物貓病史可知，有超過(guò)30%的寵物貓就診前出現(xiàn)過(guò)不同程度的腹瀉，平時(shí)散養(yǎng)在家，偶有誤飲生活用水和啃食盆栽的習(xí)慣，這也有可能造成隱孢子蟲(chóng)感染。

3.2 不同季節(jié)感染差異分析

據(jù)統(tǒng)計(jì)，夏季隱孢子蟲(chóng)的感染率偏高，這可能與當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境因素有關(guān)。蘭州市位于我國(guó)西北部，甘肅省的中部，屬于溫帶大陸性氣候，年平均氣溫10.3 ℃，降水主要集中在6至9月，溫暖潮濕的環(huán)境十分適合寄生蟲(chóng)病的發(fā)生與傳播。很多寵主認(rèn)為寵物貓平常不出門，沒(méi)有必要進(jìn)行體內(nèi)外驅(qū)蟲(chóng)，但從本試驗(yàn)結(jié)果可知，寵物貓感染體內(nèi)寄生蟲(chóng)的現(xiàn)象還是普遍存在的，尤其在夏季多發(fā)，因此做好體內(nèi)外驅(qū)蟲(chóng)是十分重要的。

3.3 不同年齡段感染差異分析

分析發(fā)現(xiàn)，3～10月齡的寵物貓隱孢子蟲(chóng)感染率為6.16%(9/146)，顯著高于其他年齡組。此結(jié)論與委磊等[20]在蘭州市流浪犬蠕蟲(chóng)感染情況調(diào)查中的結(jié)論一致。對(duì)于3月齡的幼貓幼犬，可以進(jìn)行初次免疫，整個(gè)免疫過(guò)程長(zhǎng)達(dá)42～56 d。免疫疫苗屬于弱毒疫苗，注射后，會(huì)造成機(jī)體抵抗力下降，在此期間極易感染其他疾病。本試驗(yàn)中感染隱孢子蟲(chóng)的寵物貓?jiān)?月齡至4歲不等，可見(jiàn)隱孢子蟲(chóng)可以感染不同年齡段的寵物貓，且成貓感染后癥狀不明顯，往往不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，故更要引起重視。

3.4 不同動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)的感染情況

在我國(guó)，隱孢子蟲(chóng)已在多種動(dòng)物及人類身上檢出，但感染率之間差距較大。國(guó)內(nèi)對(duì)于飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及寵物的隱孢子蟲(chóng)感染報(bào)道較為多見(jiàn)，詳見(jiàn)表3。飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)類動(dòng)物如馬、山羊、豬等可感染不同種類的隱孢子蟲(chóng)。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道均表明寵物貓僅感染貓隱孢子蟲(chóng)，且暫未發(fā)現(xiàn)其他種類。值得注意的是，犬貓隱孢子蟲(chóng)亞型均為人獸共患，需引起高度重視。

表3 中國(guó)不同地區(qū)不同動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)感染情況

3.5 寵物貓隱孢子蟲(chóng)防治建議

隱孢子蟲(chóng)作為重要的介水傳播病原微生物，其卵囊在水中可存活數(shù)月，故被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)列為規(guī)定的飲用水必檢病原微生物。寵物貓飲用自來(lái)水或誤飲生活廢水也會(huì)增加感染隱孢子蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)[9]。張曉等[6]在2014年檢測(cè)了我國(guó)部分地區(qū)的水源水和末梢水中隱孢子蟲(chóng)，結(jié)果顯示，水源水及末梢水中均有隱孢子蟲(chóng)的蟲(chóng)卵存在，因此本試驗(yàn)中的寵物貓隱孢子蟲(chóng)極有可能是介水傳播感染。建議條件允許的情況下，勿用未加熱的自來(lái)水喂養(yǎng)寵物貓，可以選用涼開(kāi)水或者純凈水喂養(yǎng)[6]。同時(shí)盡量避免喂食生肉，可加工煮熟后飼喂。在家中無(wú)人時(shí)圈養(yǎng)寵物貓，避免誤食和誤飲。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)展中國(guó)家人的隱孢子蟲(chóng)感染率在4%～20%，鑒于本試驗(yàn)寵物貓感染率較高，且貓隱孢子蟲(chóng)屬于可感染人類的5種隱孢子蟲(chóng)種之一[3]，人貓接觸頻繁，關(guān)系密切，人畜共患的風(fēng)險(xiǎn)也隨之升高。目前為止還沒(méi)有針對(duì)隱孢子蟲(chóng)的疫苗或者預(yù)防性藥物，因此需要引起重視。在實(shí)際臨床病例中，醫(yī)生有責(zé)任和義務(wù)對(duì)寵主進(jìn)行知識(shí)普及，通過(guò)糞便檢查對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療，從而避免人畜共患病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甘肅省蘭州市寵物貓存在感染隱孢子蟲(chóng)的情況，感染率為3.97%，且感染率與寵物貓品種、樣品來(lái)源地、采樣季節(jié)這幾個(gè)因素有關(guān)。鑒于隱孢子蟲(chóng)為人畜共患寄生蟲(chóng)，寵物與寵主接觸頻繁，需引起高度重視。