傳染性支氣管炎病毒反向遺傳系統(tǒng)的構建策略與應用

趙秀美，張華，賈惠，孫智遠，徐孝宙，余智清，姜逸

(1. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400；2. 江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125)

傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病的暴發(fā)與傳播影響全球養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[1]。IBV主要感染雞呼吸道、腎臟、胃腸道以及生殖系統(tǒng)等，引起感染雞的發(fā)病與組織損傷[2]。各種年齡段的雞都可發(fā)病，以雛雞最為嚴重。病毒可以通過與感染雞的直接接觸傳播，也可以通過氣溶膠和污染的飲水、飼料以及糞便傳播[3]。IBV可在雞體內(nèi)和腸道中存活數(shù)周甚至數(shù)月，并通過呼吸道和糞便排出[4]。IBV的禽類宿主范圍廣泛，家雞和野雞是主要宿主；此外，健康的野生鳥類可能是家雞和野雞之間的傳播媒介[5]。由于IBV缺乏病毒聚合酶校對機制，基因組中可持續(xù)發(fā)生基因突變和重組，導致不斷出現(xiàn)新的變異株。此外，不同遺傳譜系的IBV之間發(fā)生基因重組以及基因的易位和缺失，導致病毒血清型和基因型眾多[6]。不同毒株之間交叉保護作用較弱，傳統(tǒng)商品化疫苗對新型變異株不能產(chǎn)生有效保護，增加了疫病的防控難度[7]。

反向遺傳操作技術通過對病毒全長基因組進行克隆，拯救獲得活病毒，是研究RNA病毒分子生物學的有效方法。通過IBV反向遺傳技術對病毒基因組進行突變、缺失、插入等，可以研究病毒蛋白功能或單個基因在發(fā)病機制中的作用。針對IBV流行株，傳統(tǒng)弱毒疫苗制備過程耗時費力，而且疫苗穩(wěn)定性低，存在毒力返強的風險。借助反向遺傳技術可以對毒力相關基因進行突變或刪除，構建減毒疫苗株，克服疫苗研制的局限性[8]。此外，該技術也可用于研究IBV不同血清型和致病型毒株的感染與發(fā)病機理。IBV基因組較大，而且難以在傳代細胞系上增殖，導致IBV反向遺傳系統(tǒng)的構建較為困難，分子水平的研究工作受到限制。近年來，國內(nèi)外研究團隊突破技術瓶頸，建立了多個IBV反向遺傳系統(tǒng)，為病毒分子水平研究提供了平臺，推動了IBV致病機制研究和新型基因工程疫苗的研發(fā)。

1 IBV基因組結構和功能概述

IBV屬于冠狀病毒科γ冠狀病毒屬，病毒粒子直徑120 nm，冠狀突長20 nm。IBV的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約27.6 kb[9]。基因組結構為5′UTR-1a/1ab-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3′UTR，其兩端包含5′帽子結構和3′多聚腺苷酸尾巴?；蚪M結構5′端2/3的區(qū)域編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白通過自身蛋白酶水解裂解成15個非結構蛋白[10]?；蚪M靠近3′端的1/3區(qū)域編碼結構蛋白和種屬特異性ORF。ORF2編碼S蛋白，該蛋白是目前研究最多的結構蛋白，作為一種跨膜蛋白，S蛋白決定了病毒典型的冠狀結構[11]。在病毒感染宿主過程中，S蛋白裂解為S1和S2兩個亞基，位于S1的受體結合區(qū)是決定病毒宿主和組織嗜性的主要區(qū)域[12]。病毒相關抗原表位主要位于S1蛋白上，S基因可用于IBV變異株的基因型分類，但由于缺乏共同的分類和命名標準，IBV流行病學的研究較為復雜。S2亞基較為保守，包含跨膜結構域，將S蛋白錨定在包膜上[13]，是病毒融合的基礎[14]。S1和S2亞基與宿主之間的相互作用決定了病毒附著的親和性與特異性，從而決定了病毒組織嗜性和宿主范圍[15]。ORF3位于ORF2的下游，是一個多順反子基因，編碼3a、3b和3c蛋白。早期研究表明，3a、3b 蛋白為輔助蛋白，與病毒的復制無關[16]。3c蛋白也稱包膜蛋白或E蛋白，是病毒粒子包膜的重要組成部分[9]。M蛋白是由ORF4編碼的，是病毒粒子中含量最多的結構蛋白，在病毒粒子中以二聚體的形式存在，可能采用兩種不同的構象，促使膜面彎曲并與核衣殼結合[17]。ORF5編碼輔助蛋白5a、5b，5a蛋白與病毒在Vero細胞中的復制無關[18]。研究表明，輔助蛋白3a、3b、5a、5b缺失導致病毒在1日齡雛雞體內(nèi)毒力減弱[19]。ORF6編碼的N蛋白是核衣殼中唯一存在的蛋白，與病毒復制相關，位于核糖核蛋白核心。M蛋白與核衣殼結合，促進了病毒粒子的組裝[20]。

2 IBV反向遺傳系統(tǒng)的構建策略

近年來，已成功用于操縱冠狀病毒基因組的反向遺傳學技術包括細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)系統(tǒng)、體外連接系統(tǒng)、痘病毒載體系統(tǒng)、靶向RNA重組系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化相關重組克隆等。盡管各個系統(tǒng)均存在優(yōu)點和不足，但通過反向遺傳操作技術對IBV基因進行有目的地修飾和改造推動了IBV研究的發(fā)展。

2.1 基于BAC系統(tǒng)的感染性cDNA克隆

基于BAC的反向遺傳學系統(tǒng)是目前冠狀病毒研究中最有價值的系統(tǒng)。首個冠狀病毒的全長感染性克隆是基于BAC系統(tǒng)進行病毒基因組構建的[21]。BAC系統(tǒng)可容納較大的外源基因或者DNA片段[22]，外源序列穩(wěn)定性高；在BAC質(zhì)粒中組裝病毒基因組全長cDNA，基因修飾和篩選方法較為成熟。BAC克隆基因組較大，每個細胞中僅有1～2個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，低拷貝數(shù)以及隔離的環(huán)境，限制了細胞內(nèi)BAC分子間的重組[23]。在BAC系統(tǒng)中進行基因操作相對容易，cDNA轉(zhuǎn)染進入哺乳動物細胞并表達的效率高[24]。然而，在誘變過程中，病毒基因?qū)毦幸欢ǖ亩拘?，為防止病毒在細菌增殖過程中產(chǎn)生突變，需要每次對質(zhì)粒中的全基因組序列進行測序鑒定。

針對H120疫苗株，呂晨翡等[25]將其基因組分為4個片段進行擴增，用同源重組方法分別將其構建到 BAC載體中獲得4個片段亞克隆載體，進而完成全長 cDNA 克隆載體的構建。在此基礎上，該課題組進一步構建了嵌合 IBV 野毒S1 基因的重組疫苗株，并對其進行了致病性分析。研究發(fā)現(xiàn)以H120株的4個亞克隆片段為基礎，通過同源重組，獲得了插入IBV全長基因組cDNA的pBAC重組載體[26]。在此基礎上，將H120株的S1基因替換為強毒株的S1基因，將重組病毒轉(zhuǎn)染至BHK細胞，并在雞胚中傳代，拯救重組病毒。針對Beaudette株，Xing等[27]以Beaudette-FUB株的cDNA為模板，通過PCR將基因組分為6個片段進行擴增，分別克隆到pUC18質(zhì)粒中。隨后，將6個片段依次克隆到修飾的BAC載體中，構建全長基因組cDNA。Inayoshi等[28]將弱毒株 C-78E128基因組分為8個連續(xù)片段進行擴增，構建全長cDNA并克隆至BAC載體中。將得到的BAC克隆轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行病毒拯救，通過嵌合表達外源S基因，證實了S基因與血清特異性病毒中和抗體相關。

2.2 基于體外連接的感染性cDNA克隆

體外連接系統(tǒng)是使用限制性核酸內(nèi)切酶將識別位點處的堿基進行分離，分段擴增cDNA片段并在體外順序連接，進行病毒全長cDNA的組裝。全長cDNA包括5′端T7 RNA聚合酶和3′端poly(A)尾巴，體外轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結構的mRNA后，轉(zhuǎn)染到易感細胞內(nèi)進行病毒拯救。體外連接轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)主要依賴T7 RNA聚合酶，可以降低病毒cDNA片段在細菌中的不穩(wěn)定性和毒性[29]。然而，通過該方法獲得病毒需要對所有亞克隆片段進行酶切、連接以及純化全長cDNA，操作過程繁瑣，對于DNA的體外合成技術要求較高。

冠狀病毒首個體外連接系統(tǒng)是針對豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)構建的全長感染性cDNA克隆[30]。將病毒基因組體外克隆的cDNA片段進行順序連接，組裝成全長cDNA。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒mRNA，電轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中，成功拯救重組病毒。該研究證明同時表達N蛋白有助于提高重組病毒的拯救效率。研究表明，磷酸化的N蛋白比非磷酸化或部分修飾的N蛋白能更有效地拯救獲得感染性IBV[31]。針對H120疫苗株，周生等[32]采用RT-PCR方法將其基因組分為10個片段進行擴增，克隆至pMD19-T載體，將各DNA片段進行體外連接，獲取H120株的基因組全長cDNA。通過T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成病毒基因組RNA，轉(zhuǎn)染BHK-21細胞并進行病毒拯救。此外，該團隊以相同的方法對QX型毒株IBYZ全基因組分為10個片段擴增，成功構建了QX型強毒株的反向遺傳系統(tǒng)[33]。Zhou等[34]體外擴增H120株13個病毒基因組片段，克隆到pMD19-T載體中。在T4連接酶作用下，體外連接病毒的全長cDNA，將全長基因組cDNA轉(zhuǎn)錄子與N基因轉(zhuǎn)錄子共同電轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，收獲細胞并接種到SPF雞胚中成功拯救了H120的感染性克隆。魏衍全等[35]利用RT-PCR技術擴增得到H120株S基因胞外域，置換到Beaudette株全長cDNA克隆相應區(qū)段，構建了含有上述區(qū)段的重組cDNA克隆BeauR-H120(S1)。李然等[36]將M41株全基因組分為14段分段擴增，體外拼接成基因組全長cDNA，成功構建了IBV經(jīng)典毒株M41株的感染性克隆。許紀剛等[37]分13個片段擴增H52株全長cDNA，采用改進的No see’m連接技術和多片段同時連接的方法，成功體外連接出病毒的全長cDNA，拯救并獲得了H52株的反向遺傳株。翁文蓮[38]等以 IBV 細胞適應株 Beaudette-R為研究對象，通過體外連接技術，構建并拯救獲得Nsp15核酸內(nèi)切酶活性缺陷型重組病毒，探討Nsp15在IBV感染和復制過程中的作用。

2.3 基于痘病毒載體的感染性cDNA克隆

痘病毒作為一種基因組大的DNA病毒有以下優(yōu)點：痘病毒可容納大的外源基因片段，并且病毒本身的感染性和復制能力不受影響；插入的外源基因片段可在痘病毒基因組中穩(wěn)定復制并表達，不需要依賴原核表達系統(tǒng)；痘病毒作為全長cDNA的載體，可以通過同源重組對痘病毒進行基因修飾，便于對冠狀病毒基因組克隆進行基因突變、插入或缺失[39]。

基于痘病毒載體的反向遺傳系統(tǒng)最先用于重組HCoV-229E的構建，研究人員將病毒基因組克隆至痘病毒中，在體外以cDNA為模板轉(zhuǎn)錄生成感染性RNA，拯救獲得重組病毒[40]。IBV首個反向遺傳系統(tǒng)是針對Beaudette株痘病毒載體的感染性克隆的構建。首先，在T7 RNA聚合酶啟動子下游組裝IBV基因組cDNA，克隆到痘病毒基因組中，構建重組痘病毒。隨后，將重組痘病毒與表達T7 RNA聚合酶的雞痘病毒共同轉(zhuǎn)染到CK細胞中，拯救獲得感染性克隆[41]。在IBV痘病毒反向遺傳操作系統(tǒng)基礎上，Bickerton等[42]進一步優(yōu)化方法，使用瞬時顯性選擇法在IBV cDNA中引入修飾，感染表達T7 RNA聚合酶的重組痘病毒，共轉(zhuǎn)染CK細胞，拯救獲得重組病毒。針對強毒株YN株，Zhao等[43]建立了基于痘病毒的反向遺傳系統(tǒng)。將YN株全基因組分為10個片段進行擴增，通過同源重組克隆到痘病毒中。體外轉(zhuǎn)錄全長基因組cDNA，將轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達N蛋白的BHK-21/N細胞中，進行病毒拯救。48 h后收獲細胞培養(yǎng)物并接種到10日齡SPF雞胚中進行病毒增殖。

2.4 靶向RNA重組

冠狀病毒基因組較大，復制酶區(qū)域存在不穩(wěn)定性，使冠狀病毒基因組作為cDNA克隆在大腸桿菌中增殖較為困難。為了克服這些障礙，Masters等[44]在尚不清楚能否構建全長感染性cDNA克隆的情況下，建立了靶向RNA重組技術。靶向RNA重組系統(tǒng)基于S基因的交換，可將不同宿主依賴性的冠狀病毒S基因進行交換，便于對不同物種的易感細胞進行選擇。靶向RNA重組最先應用于小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)[45]，構建MHV感染性克隆分為兩步，首先構建攜帶MHV S基因并具有嚴格小鼠細胞親和力的嵌合冠狀病毒，隨后在病毒特異性適應細胞上拯救靶向重組病毒?；虿倏v主要集中在IBV基因組結構3′端區(qū)域。靶向RNA重組構建方便，可用于拯救高度變異的毒株。由于該系統(tǒng)是基于細胞水平上的冠狀病毒增殖，因此不適用于致病性IBV。 但是，可以將IBV基因組RNA轉(zhuǎn)染到非易感細胞中，用MHV的S基因替換IBV S基因，在轉(zhuǎn)染細胞中拯救重組病毒。van Beurden等[46]以弱毒株H52株為研究對象，構建了IBV靶向RNA重組系統(tǒng)。首先，將IBV基因組 RNA和攜帶MHV S基因的嵌合IBV轉(zhuǎn)錄子共轉(zhuǎn)染到非易感細胞中，以生成重組嵌合鼠化IBV中間體(mIBV)，此時，由于IBV編碼S蛋白外胞外域的基因組被MHV基因組取代，可在小鼠細胞內(nèi)進行增殖；隨后，mIBV作為受體，通過引入完整的IBV S基因，構建包含IBV基因組3′端的重組RNA，在雞胚中拯救獲得重組毒株。重組病毒在雞胚以及1日齡雛雞體內(nèi)的表型特征與野毒株相似。

大多數(shù)IBV毒株，包括田間分離株，只能在雞胚中增殖，不能在連續(xù)傳代的細胞系中感染和增殖。靶向RNA重組技術為這類毒株感染性克隆的構建提供了可能。應用靶向RNA重組技術修飾IBV基因組3′端編碼結構蛋白和輔助蛋白的基因，可以對強毒株結構蛋白和輔助蛋白基因進行研究[46]。通過引入特定突變，為IBV減毒活疫苗的構建和生物學特性研究打下基礎。但是，靶向RNA重組技術有嚴格的限制性，它不能在編碼復制酶的基因上進行操作。

3 IBV反向遺傳系統(tǒng)的應用

IBV反向遺傳系統(tǒng)通過替換、缺失或插入核苷酸等定點突變產(chǎn)生重組病毒，是研究病毒分子生物學和致病機制的重要方法。目前IBV反向遺傳系統(tǒng)主要用于病毒基因組結構和功能研究、新型疫苗研發(fā)和病毒表達載體研究等。

3.1 病毒基因組結構和功能研究

為研究IBV S蛋白與病毒致病性的關系，Hodgson 等[47]利用反向遺傳技術將Beaudette株的S蛋白基因替換為致病型M41株的S蛋白，研究發(fā)現(xiàn)表達M41株的S蛋白的Beau-R仍是非致病性的，但免疫雞后可對M41株產(chǎn)生保護作用。試驗發(fā)現(xiàn)，利用BAC反向遺傳系統(tǒng)將H120株的S1基因替換為野毒株SC021202的S1基因，可拯救獲得重組毒株rH120/SCS1[26]。雛雞致病性試驗表明，雛雞免疫rH120/SCS1可對SC021202產(chǎn)生免疫，但重組毒株rH120/SCS1不具有致病性，說明S1蛋白可能不是SC021202高致病性的關鍵因素。針對QX型強毒株YN株，Zhao等[48]借助反向遺傳技術，將YN株的S基因或5a基因替換為弱毒株aYN株的相應區(qū)域，構建并拯救獲得重組病毒rYN-S-aYN 和 rYN-5a-aYN。重組病毒在雞胚中表現(xiàn)為減毒表型，感染雛雞表現(xiàn)為死亡率降低、體內(nèi)病毒滴度下降、組織損傷程度降低，從而證明了S基因和5a基因是強毒株毒力減弱的主要原因。

為研究IBV S蛋白高變區(qū)(hypervariable region，HVR)在病毒致病性和組織嗜性中的作用，Shan等[49]利用反向遺傳技術將IBV Beaudette株的3個HVR分別或同時替換為QX型腎型毒株ck/CH/LDL/091022的相應片段，構建并拯救獲得7株重組IBV。通過細胞和雞胚增殖試驗、SPF雛雞體內(nèi)致病性試驗探索HVR的功能。為研究病毒S蛋白與細胞嗜性的相關性，Bickerton等[50]通過反向遺傳技術將 Beaudette株的S蛋白膜外片段與強毒株M41-CK的相應區(qū)域替換，得到了具有M41-CK的體外細胞嗜性的重組毒株BeauR-M41(S)。研究表明，S2亞基決定病毒在Vero細胞中的親嗜性，S2裂解位點附近的3個氨基酸突變與Beaudette株適應Vero細胞相關。姜逸等[51-52]借助反向遺傳操作技術，以H120疫苗株、QX型毒株IBYZ和YZ120毒株的基因組為骨架，分別對S、S1或S2基因進行嵌合表達，確定了V617I的突變是YZ120毒株適應原代CK細胞的關鍵位點。

IBV反向遺傳系統(tǒng)還可以應用于輔助蛋白的功能研究。Laconi等[19]基于靶向RNA重組系統(tǒng)缺失H52株的輔助基因3a、3b、5a和5b，通過雞胚接種試驗和1日齡SPF雛雞感染試驗，證明缺失輔助基因?qū)е轮亟M病毒產(chǎn)生減毒表型。針對QX型強毒株，在IBYZ株反向遺傳系統(tǒng)的基礎上，拯救獲得IBYZ株輔助蛋白3a、3b沉默表達的重組病毒。1日齡SPF雛雞攻毒試驗表明，輔助蛋白缺失的重組病毒在雛雞體內(nèi)的致病性減弱，其中輔助蛋白3b缺失的致病性減弱作用較為明顯[33]。

3.2 新型疫苗研究

疫苗免疫是預防IBV感染的有效途徑。市售疫苗大多為滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗雖然安全性好，但是制備成本較高，且免疫效果不理想；弱毒疫苗是由病毒在雞胚中連續(xù)傳代產(chǎn)生的毒力減弱但保留免疫原性的活毒株，在雞體內(nèi)有一定的致病性，且存在毒株變異與毒力返強的風險。根據(jù)S1基因的系統(tǒng)進化分析，目前我國的主要流行毒株為QX型毒株[53]，與Mass型毒株的核苷酸同源性較低[54]，傳統(tǒng)弱毒疫苗如H120屬于Mass型毒株，針對QX型毒株的保護性差。反向遺傳學技術在RNA病毒疫苗研發(fā)中起重要作用，通過反向遺傳技術開發(fā)基因型匹配疫苗、減毒活疫苗、廣譜疫苗載體或基因標記重組疫苗等，能夠針對不同血清型或基因型毒株產(chǎn)生免疫，比滅活疫苗或弱毒疫苗更為安全高效。

現(xiàn)有疫苗的交叉保護效果較差，為闡明S1蛋白在免疫保護中的作用，Ellis等[55]借助反向遺傳操作系統(tǒng)，以Beaudette株為基礎，用重組IBV進行同源疫苗接種試驗。結果表明，S1蛋白與不同血清型產(chǎn)生交叉保護作用有關。因此，針對致病性Beaudette株設計減毒活疫苗可以誘導免疫保護。Bickerton等[56]以Beaudette株為骨架，借助反向遺傳技術將H120或QX型強毒株的S1基因替換Beaudette株S1基因，構建并拯救獲得重組病毒BeauR-H120(S1)和 BeauR-QX(S1)，獲得的重組病毒能夠在原代雞腎細胞和Vero細胞中復制，為研發(fā)能在 Vero細胞中有效復制的IBV疫苗奠定基礎。Ting等[57]借助反向遺傳技術，將Beaudette-p65株S1基因替換為QX型KC分離株的S1基因，拯救了嵌合S1基因的rIBV-Beaudette-KC(S1)，該重組病毒免疫雛雞可產(chǎn)生較高水平的免疫應答反應，并能夠?qū)41株和QX型毒株產(chǎn)生較好的交叉保護效果，可作為疫苗候選株。Jiang等[58]利用體外連接反向遺傳技術，以疫苗株H120為骨架，將S1基因替換替換為QX型強毒株的S1，構建并拯救獲得重組病毒rH120-S1/YZ。重組病毒對1日齡雛雞的安全性好且能夠產(chǎn)生針對強毒株的免疫保護力，可作為QX型流行毒株的候選疫苗。van Beurden等[59]以H52為研究對象，建立了基于靶向RNA重組技術的反向遺傳系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)刪除了IBV基因組中輔助基因3和基因5，構建并拯救獲得重組病毒。重組毒株在雞胚中的復制與親本株相似，證實了基因3和基因5不是病毒復制必需的。病毒缺失基因3或基因5后毒力降低，對M41株的攻毒具有保護作用，為新型減毒疫苗株的研發(fā)打下基礎。Keep 等[60]建立了致病性毒株 M41株的反向遺傳系統(tǒng)，通過對復制酶基因進行特異性修飾，確定了毒力致弱的靶向基因，為IBV減毒活疫苗的開發(fā)提供新的方向。

3.3 病毒表達載體研究

為探討IBV作為載體表達外源基因的可行性，周生等[61]利用反向遺傳技術，將H120株基因組中的5a基因編碼區(qū)替換為增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因，拯救獲得重組病毒H120-5a/EGFP株。該重組毒株在雞胚中能有效復制和傳代，并表達綠色熒光蛋白，證實通過替換IBV基因組中的5a基因來表達外源基因是可行的。Bentley 等[62]利用反向遺傳學技術制備了表達EGFP和人源化海腎熒光素酶的感染性重組病毒。姜逸等[63]以H120為載體，將雞IFN-γ(ChIFN-γ)基因替換了5a基因編碼區(qū)，拯救獲得H120-cIFNγ/5a病毒株，并對其感染雞胚的能力以及在雞胚中的傳代穩(wěn)定性進行了評估，為以IBV為載體的新型基因重組疫苗的研制奠定基礎。Yang等[64]借助反向遺傳系統(tǒng)，以H120株為載體，構建并拯救獲得表達新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白的重組病毒R-H120-HN/5a。重組病毒接種SPF雞胚后，其增殖曲線、致病性和病毒滴度與H120親本株相似，而且具有NDV的血凝活性。重組病毒接種SPF雞后，誘導產(chǎn)生的IBV特異性IgG抗體水平與市售二價疫苗LaSota/H120相當，對IBV致病性毒株M41和NDV強毒株感染提供了有效保護。因此，IBV可作為二價疫苗的載體，通過表達外源基因預防IBV與其他病原體的感染。

病毒作為載體表達外源基因取決于多種因素，包括病毒的遺傳背景、插入外源基因在病毒基因組中的位置，以及替換基因是否影響病毒復制等[62]。重組IBV的穩(wěn)定性取決于外源基因組位置、基因表達所需的病毒基因組修飾水平以及插入外源基因后IBV結構蛋白的表達效果。IBV輔助基因不是病毒復制所必需的，因此可以對輔助基因進行刪除或替換，成為表達載體的靶點。

4 小結

反向遺傳操作技術通過構建病毒感染性分子克隆，在cDNA分子水平上進行基因操作，進一步產(chǎn)生具有生物活性的RNA分子，解決了RNA病毒基因組難以操作的困難。通過反向遺傳操作技術可以在病原學基礎上研究RNA病毒的結構、基因以及氨基酸位點的功能，有助于RNA病毒的生物學特性研究。

冠狀病毒的基因組大，全長cDNA的構建較為困難。使用傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA克隆技術不能確保大片段cDNA的穩(wěn)定性。一些冠狀病毒的基因序列對于大腸桿菌具有毒性，不能克隆到傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體中，或者不能在真核載體系統(tǒng)中傳代。直到21世紀初，才成功構建IBV全長感染性克隆。大部分IBV反向遺傳操作系統(tǒng)是基于Beaudette株或者Mass型毒株建立的。Beaudette株是細胞適應株，能在Vero細胞上增殖，但在雞體內(nèi)沒有致病性。Mass型毒株與我國流行的QX型毒株的基因型差距較大。近年來，研究人員針對QX型毒株建立了多個反向遺傳操作系統(tǒng)，并進行了QX型毒株的免疫學和體內(nèi)致病性的研究，為IBV發(fā)病機理研究和疫病防控打下了基礎。IBV反向遺傳技術不斷發(fā)展成熟，在病毒致病機制研究和基因工程類疫苗研發(fā)等方面取得了突破性進展，是病毒的分子生物學研究、致病機制研究以及新型疫苗研發(fā)的重要途徑。