肉蓯蓉總苷對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡及Wnt/β-Catenin 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

馮 朵，王 靖，蔣勇軍，周士琦，段 昊，郭 豫，趙 建，閆文杰,

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100023；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081；3.內(nèi)蒙古三口生物科技有限公司，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000）

肉蓯蓉屬于藥食同源物質(zhì)，是列當(dāng)科多年生草本寄生植物，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、保肝護(hù)肝、調(diào)理內(nèi)分泌、提高記憶能力和抗骨質(zhì)疏松等功效[1]，有“沙漠人參”之稱(chēng)。自2018 年確認(rèn)荒漠肉蓯蓉成為藥食同源類(lèi)物質(zhì)后，備受人們關(guān)注，它既可發(fā)揮中草藥臨床應(yīng)用價(jià)值，又會(huì)影響食物營(yíng)養(yǎng)干預(yù)作用，在新型抗肝癌天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)中也顯示出巨大的潛力[2-3]，對(duì)于肉蓯蓉食物的營(yíng)養(yǎng)研究及功能效果越來(lái)越深入[4]。

近幾年，有報(bào)道提出，肉蓯蓉具有抗腫瘤的作用，Ye 等[5]研究發(fā)現(xiàn)從鹽生肉蓯蓉中提取的松果菊苷可以通過(guò)降低TREM2 的表達(dá)和阻滯PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)抑制HepG2 細(xì)胞的增殖；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉苯乙醇苷可以抑制HepG2 細(xì)胞的增殖作用[6]；松果菊苷對(duì)腎癌786-O 細(xì)胞[7]、SW480 結(jié)腸癌細(xì)胞[8]的增殖均有一定的抑制作用；在另一項(xiàng)研究中，肉蓯蓉苯乙醇總苷已被證明可以減少H22 荷瘤小鼠的肝損傷，并通過(guò)降低AFP 水平來(lái)改善免疫功能，從而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[9]。肉蓯蓉煎煮物[10]和多糖[11]均可以通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路改善帕金森大鼠的臨床癥狀，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮抗乳腺癌的作用[12]；另外，它也可以降低人類(lèi)急性白血病THP-1 細(xì)胞中β-catenin 蛋白表達(dá)[13]。一直以來(lái)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路備受人們的關(guān)注[14]，據(jù)報(bào)道，在20%～35%的肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）病例[15]中可觀察到β-catenin 的激活。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[16]，但肉蓯蓉總苷是否通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路起到抗肝癌作用報(bào)道較少。

肉蓯蓉提取物總苷，包括苯乙醇苷類(lèi)和其他苷類(lèi)[17]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究肉蓯蓉總苷（total glycosides ofCistanche deserticola，TG）對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖作用、凋亡、遷移以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響等，探討TG 抑制肝癌的機(jī)制，解釋肉蓯蓉總苷抗肝癌的潛在機(jī)理，為進(jìn)一步充實(shí)肉蓯蓉在肝癌領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌HepG2（human hepatoellular carcinomas）細(xì)胞 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；肉蓯蓉總苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥75%，以松果菊苷和毛蕊花糖苷合計(jì)）內(nèi)蒙古三口生物科技有限公司，用DMEM 培養(yǎng)基溶解至相應(yīng)濃度的TG，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；胎牛血清 美國(guó)Gibco；抗體（青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合液）、DMEM-H 培養(yǎng)基、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/染液、細(xì)胞凋亡-Hoechst 33342/PI 染液 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；0.25%胰蛋白酶消化液（-EDTA）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；兔抗β-catenin 抗體 ABclonal 有限公司；兔抗Dsh（ADAR1）抗體 Bioss 公司；兔抗GSK3β抗體、兔抗AFP 抗體 Affinity 公司。

Innova CO-170 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 New brunswick scientific 公司；3K15 低溫高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma 離心機(jī)公司；INFINITE M NANO 多功能酶標(biāo)儀 TECAN 公司；C-SHG1 熒光顯微鏡、TE2000-U倒置光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD 公司；EN027015 電泳裝置、043BR57802 轉(zhuǎn)膜裝置 美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞傳代 HepG2 細(xì)胞采用含有10%胎牛血清和1%三抗（100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素和慶大霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為80%～90%，用0.25%胰蛋白酶（-EDTA）消化后按1:2～4 傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)2～3 d 后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，接種于24 孔板中，每孔細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁后，加入TG 至終濃度為0、3.5、10.5、21、31.5、42 μg/mL，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組別細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/孔，接種于96 孔板中，每孔加入100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，按照上述1.2.2 進(jìn)行藥物處理，每組六個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。采用CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定吸光度值（OD），并按下式計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率。

式中，空白組只含CCK8 液，對(duì)照組為0 μg/mL處理組，實(shí)驗(yàn)組為3.5、10.5、21、31.5、42 μg/mL 處理組。

1.2.4 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于六孔板中，每孔2 mL 的體系中含有5×105個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中，按上述1.2.2 進(jìn)行藥物處理，培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.5 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移的影響 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞鋪在六孔板中，每孔2 mL 的體系中含有6×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁及細(xì)胞匯合度為90%以上時(shí)，取出六孔板。按上述1.2.2 進(jìn)行藥物處理，0 h 時(shí)在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于光學(xué)顯微鏡下拍照，使用Image J 軟件分析細(xì)胞刮痕，按下述公式（2）計(jì)算24 h 遷移率[18]。

1.2.6 Hoechst 33342/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪在24 孔板中，每孔0.5 mL的體系中含有3×104個(gè)細(xì)胞，按上述1.2.2 進(jìn)行藥物處理，加入1 mL 細(xì)胞染色緩沖液，之后加入5 μL Hoechst 33342 染液和5 μL PI 染液進(jìn)行染色。37 ℃避光孵育7～10 min，取出24 孔板，PBS 潤(rùn)洗后利用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)HepG2 細(xì)胞的凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪在六孔板中，每孔2 mL 的體系中含有2×105個(gè)細(xì)胞，按上述“1.2.2”進(jìn)行藥物處理，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作，加入5 μL Annexin V-FITC 和5μL PI 染液，4 ℃避光孵育后置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.8 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 取按2×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿按照上述1.2.2 進(jìn)行藥物處理，采用80 μL 裂解液（RIPA:PMSF=100:1）裂解蛋白質(zhì)，然后利用SDS-PAGE 電泳分離各蛋白樣品（每孔上樣量為50 μg），在冰浴中完成蛋白至PVDF 膜的轉(zhuǎn)移，用1×TBST 緩沖液清洗條帶，BSA 室溫?fù)u床慢速封閉1 h，按比例加入一抗（AFP、GSK3-β、β-catenin、Dsh），4 ℃孵育過(guò)夜，之后將PVDF 膜與二抗（按1:1000 的比例采用5% BSA 稀釋?zhuān)┰谑覝叵聹赜?～2 h，GAPDH 作為內(nèi)參，PVDF 膜經(jīng)過(guò)顯影、定影后觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)變化[6]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANONA 單因素顯著性分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Flowjo 分析；使用Graphpad prism 8.0.2 作圖。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示存在極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響

在發(fā)生凋亡的過(guò)程中，首先其體積會(huì)慢慢變小，發(fā)生變形，然后貼壁細(xì)胞會(huì)慢慢發(fā)生皺縮、變圓、脫落以及胞內(nèi)染色體固縮等過(guò)程，部分細(xì)胞核出現(xiàn)斷裂、邊緣化和凋亡小泡的形成。由圖1 觀察到，3.5 和10.5 μg/mL TG 處理的HepG2 細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞體積逐漸變??；之后直觀地觀察到21 μg/mL 時(shí)細(xì)胞核開(kāi)始皺縮，體積變?。?1.5 μg/mL 時(shí)細(xì)胞伴有漂浮及細(xì)胞碎片的出現(xiàn)；42 μg/mL 時(shí)細(xì)胞膜徹底破裂，細(xì)胞發(fā)生裂解，出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，邊界不清，處在即將崩裂、死亡的狀態(tài)。

2.2 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖影響

由圖2 可知，不同濃度的TG 處理24 h 后，HepG2細(xì)胞的增殖受到不同程度的限制，與對(duì)照組細(xì)胞存活率相比，加藥處理組隨著濃度升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別為96.95%、92.59%、92.78%、77.24%、31.04%，濃度為3.5、10.5、21 μg/mL 沒(méi)有顯著性差異，且下降幅度較小，而31.5 和42 μg/mL 時(shí)具有極顯著差異（P<0.01），經(jīng)TG 處理的IC50為37.77 μg/mL。CCK8試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明當(dāng)TG 濃度為21 μg/mL 以上時(shí)，對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制效果更佳。

圖2 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖影響Fig.2 Effect of TG on the proliferation of HepG2 cells

2.3 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

如圖3 所示，經(jīng)不同濃度TG 處理24 h 之后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，G0/G1期逐漸減小，占比分別為59.9%、56.7%、56%、54%、33.4%、29.1%，均顯著下降；S 期占比分別為14.3%、15.8%、16.8%、18.7%、25.1%、27.6%，均有不同程度的上升；與對(duì)照組（23.88%）相比，3.5～21 μg/mL 時(shí)，G2/M 期變化不大，占比分別為25.85%、24.92%、25.33%，當(dāng)TG 為31.5和42 μg/mL 時(shí)顯著升高（P<0.05），分別為37.89%、39.42%。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TG 在低濃度（3.5～21 μg/mL）時(shí)，不以影響細(xì)胞周期的主要方式抑制細(xì)胞分裂增殖，在高濃度（31.5 和42 μg/mL）時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于S 期和G2/M 期，從而抑制細(xì)胞的增殖。同時(shí)當(dāng)TG 為31.5 和42 μg/mL 時(shí)，subG1也有所增加，這與Sun 等[19]研究發(fā)現(xiàn)青蒿素衍生物在高濃度可以提高HepG2 細(xì)胞subG1峰的結(jié)果一致，他還發(fā)現(xiàn)隨著青蒿素濃度的提高，G2/M 期細(xì)胞比例升高。細(xì)胞周期結(jié)果說(shuō)明TG 可能是促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of different concentrations of TG on the cell cycle of HepG2 cells

2.4 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移的影響

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的關(guān)鍵之一，癌癥的復(fù)發(fā)也與之有密切聯(lián)系，為了探討TG 是否可以抑制HepG2 細(xì)胞的遷移，采用劃痕法來(lái)觀察細(xì)胞遷移情況。如圖4 所示，隨著TG 濃度的升高，24 h 遷移率逐漸降低，抑制遷移效果越明顯，遷移率分別為14.82%、13.42%、12.66%、10.11%、8.46%、7.24%，21 μg/mL 呈顯著性差異（P<0.05），31.5 和42 μg/mL呈極顯著差異（P<0.01）。該試驗(yàn)結(jié)果表明TG 可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移，從而限制癌癥轉(zhuǎn)移至其他組織。

圖4 不同濃度TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effects of different concentrations of TG on HepG2 cell migration

2.5 Hoechst 33342/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用Hoechst 33342 進(jìn)行核染色，檢測(cè)染色質(zhì)凝結(jié)[20]，正常細(xì)胞顯低藍(lán)色，凋亡細(xì)胞顯高藍(lán)色/低紅色，壞死細(xì)胞顯低藍(lán)色/高紅色，由圖5 可知，與對(duì)照組相比，TG 處理組細(xì)胞染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞核碎片化，同時(shí)，觀察到當(dāng)TG 處在3.5～21 μg/mL 范圍內(nèi)，藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)，推測(cè)TG 在低濃度時(shí)主要以細(xì)胞凋亡方式來(lái)抑制細(xì)胞的增殖；而高于21 μg/mL 時(shí)，紅色熒光增強(qiáng)，推測(cè)TG 在較高濃度時(shí)主要以損傷、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)殺死細(xì)胞。該試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明經(jīng)TG 處理，可以使HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡直至壞死。

圖5 不同濃度TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞Hoechst 33342/PI 的影響Fig.5 Effects of different concentrations of TG on Hoechst 33342/PI in HepG2 cells

2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步確定TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，采用Annexin V-FITC/PI 雙染法對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色。如圖6 所示，隨著濃度的升高，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，0、3.5、21、42 μg/mL 的凋亡率分別是5.63%、7.65%、10.93%、32.44%，具有劑量依賴(lài)性，結(jié)果表明TG 可通過(guò)破壞HepG2 細(xì)胞的膜完整性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與齊鑫鑫等[6]討論肉蓯蓉苯乙醇苷對(duì)于HepG2 細(xì)胞的AV/PI 染色結(jié)果一致。

圖6 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞AV/PI 雙染的影響Fig.6 Effect of TG on AV/ PI double staining of HepG2 cells

2.7 TG 對(duì)HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

α-甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）作為原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物，用于肝癌的診斷及療效檢測(cè)[21]。由圖7 可知，與對(duì)照組相比，AFP 在處理組中表達(dá)水平均有所降低，推測(cè)TG 一定程度上可以抑制肝癌的發(fā)生，但逆轉(zhuǎn)肝癌的概率微乎其微。另外，Dsh、βcatenin 水平隨藥物濃度的升高呈下降水平，且呈線(xiàn)性關(guān)系；GSK-3β逐漸升高，但不具有劑量依賴(lài)性。因此推測(cè)TG 可以調(diào)節(jié)Dsh、β-catenin 和GSK-3β相對(duì)表達(dá)情況，通過(guò)Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡。

圖7 不同濃度TG 處理HepG2 細(xì)胞蛋白表達(dá)情況Fig.7 Protein expression in HepG2 cells treated with different concentrations of TG

3 討論與結(jié)論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是死亡率位列前三的疾病[2]，肝癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、化放療和免疫治療等[22-24]。有報(bào)道表明，2016 年中國(guó)肝癌發(fā)病率為9.57%，死亡率高達(dá)13.92%[25]。由于早期肝癌癥狀無(wú)特異性，一旦出現(xiàn)癥狀多為中、晚期，所以對(duì)于肝癌，人們更積極的采用中醫(yī)治療[26]。人們認(rèn)為天然化合物的分子毒性最小，并證明對(duì)肝癌的治療有益處，所以積極地篩選新的抗肝癌天然化合物。近幾年，肉蓯蓉的多種功效備受人們的關(guān)注，逐漸成為保健食品開(kāi)發(fā)和藥物研究的熱點(diǎn)之一，細(xì)胞形態(tài)和CCK-8 試驗(yàn)證實(shí)，一定濃度的TG 可以破壞細(xì)胞形態(tài)、抑制HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力，濃度與細(xì)胞抑制率成正比關(guān)系。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次有絲分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期和分裂期兩個(gè)階段。流式細(xì)胞儀利用熒光染料區(qū)分G0/G1期、S 期和G2/M 期，通過(guò)細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度TG 處理之后，發(fā)現(xiàn)TG 在高濃度（31.5 μg/mL和42 μg/mL）時(shí)，可以阻滯細(xì)胞處在S 期和G2/M 期影響HepG2 細(xì)胞活性，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而抑制細(xì)胞的增殖。

在癌癥進(jìn)展過(guò)程中，來(lái)自原發(fā)腫瘤的癌細(xì)胞侵襲鄰近的正常組織，轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處，并形成新的菌落。據(jù)估計(jì)，總共有90%的癌癥相關(guān)死亡率是由于轉(zhuǎn)移性[27]。Wnt 信號(hào)通路參與了上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程，以促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移，在HCC 進(jìn)展過(guò)程中，高水平的β-catenin 與轉(zhuǎn)移增強(qiáng)和預(yù)后不良相關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TG 處理24 h 后的HepG2 細(xì)胞遷移率隨濃度的升高逐漸下降，具有濃度依賴(lài)性。這表明TG 可以控制癌細(xì)胞的遷移，阻止癌癥的進(jìn)一步擴(kuò)散，可能是通過(guò)Wnt 信號(hào)通路降低β-catenin 的表達(dá)。

一般來(lái)說(shuō)，受影響的細(xì)胞核顯得較??；一些染色質(zhì)在外圍濃縮或聚集，而另一些則有核染色質(zhì)碎片化、凋亡小體形成等典型特征[29-30]。Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Hoechst 33342 染色的HepG2細(xì)胞中觀察到凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，包括核凝結(jié)和碎裂[31]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)TG 處理24 h 后，具有染色質(zhì)凝結(jié)和熒光核碎片的細(xì)胞比例以濃度依賴(lài)的方式增加，這與Yang 等[32]研究姜辣素誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡結(jié)果一致。利用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)TG 處理HepG2 細(xì)胞24 h 后，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率逐漸上升。

Dsh、β-catenin 和GSK-3β是典型Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)因子，Dishevelled（Dvl/Dsh）是Wnt 信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白，它能將Wnt 信號(hào)傳遞到下游的效應(yīng)因子上[33]。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路中，Dsh 被受體Frizzled 召集到細(xì)胞膜上，它作為一種原癌基因，與體軸抑制因子（Axin）、結(jié)直腸腺瘤性息肉基因（adenomatous polyposis coli gene，APC）、GSK-3β結(jié)合形成降解復(fù)合物，抑制GSK-3β對(duì)β-catenin的磷酸化降解作用，從而使得β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用[33-35]。β-catenin 在正常細(xì)胞中主要在細(xì)胞膜中表達(dá)，與細(xì)胞黏附有關(guān)，它還參與Wnt 信號(hào)通路的信息傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、分化，當(dāng)Wnt 信號(hào)通路異常激活后，β-catenin 發(fā)生了重新分布，這可能是腫瘤發(fā)生的原因之一[36]。據(jù)報(bào)道，在20%～35%的HCC 病例[15]中可觀察到β-catenin 的激活。同時(shí)，還可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活自噬抑制HepG2 細(xì)胞的增殖[37]。該研究發(fā)現(xiàn)，TG 處理后的HepG2 細(xì)胞，Dsh、β-catenin 水平隨藥物濃度的升高呈下降水平，且呈線(xiàn)性關(guān)系；GSK-3β逐漸升高，但不具有劑量依賴(lài)性。因此可以推斷TG 通過(guò)Wnt/βcatenin 信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡。

世界范圍內(nèi)最廣泛使用的原發(fā)性肝癌生物標(biāo)志物是AFP[38]。AFP 在原發(fā)性肝癌患者的早期監(jiān)測(cè)、病理分類(lèi)、治療選擇和預(yù)后中具有重要作用。無(wú)論哪種治療方式，當(dāng)AFP 水平高于400 ng/mL 時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致較差的存活率[39]。通過(guò)檢測(cè)TG 處理細(xì)胞后AFP 蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TG 可以有效減弱AFP 的表達(dá)量，表明TG 可以在肝癌早期時(shí)就起到抑制肝癌細(xì)胞的作用。

綜上所述，肉蓯蓉總苷通過(guò)影響細(xì)胞周期進(jìn)展、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、限制細(xì)胞遷移來(lái)抑制HepG2 細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，激活GSK-3β 降解β-catenin來(lái)實(shí)現(xiàn)肝癌抑制作用的，但需要進(jìn)一步的深入研究。未來(lái)，專(zhuān)家學(xué)者可以深入探索肉蓯蓉在Wnt/β-catenin信號(hào)通路上游及下游蛋白分子，驗(yàn)證作用靶基因，進(jìn)一步探討肉蓯蓉總苷抗HepG2 細(xì)胞的作用機(jī)制。另外，肉蓯蓉作為藥食同源物質(zhì)[40]，日常飲食中食用可以起到預(yù)防和治療同時(shí)兼顧的作用，也為踐行大食物觀，推進(jìn)“健康中國(guó)”建設(shè)，提高人民健康水平提供一定的理論依據(jù)。