竹茹總黃酮超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性分析

劉敏卓，張小月，張靈芝，曹孟君，葉素芳，吳澤華，張 杰，曾志紅

（長(zhǎng)沙學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410022）

竹茹（Bambusae Caulisin Taeniam）為禾本科植物淡竹、大頭典竹或青稈竹的莖稈的干燥中間層，具有清熱化痰、除煩止嘔等功效，是衛(wèi)健委公布的藥食同源類(lèi)物質(zhì)[1]?；瘜W(xué)成分研究表明，竹茹中主要含有黃酮類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、多糖類(lèi)等物質(zhì)[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，竹茹三萜類(lèi)成分具有良好的降脂、降壓、抗炎、抗腫瘤等活性[2-4]。竹茹多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性[5]。竹茹黃酮具有延緩皮膚細(xì)胞衰老的效能，這可能與其具有抗氧化活性有關(guān)[6]。因此，本研究針對(duì)于竹茹中黃酮的提取及其抗氧化活性的分析，對(duì)其資源的開(kāi)發(fā)以及高值化應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)際意義。

天然產(chǎn)物中黃酮類(lèi)成分的提取方法有許多種，較為常見(jiàn)的有回流提取法、超聲波提取法、酶提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[7-10]。其中纖維素酶提取法是利用纖維素酶將植物細(xì)胞壁中的纖維素等成分進(jìn)行降解，提高胞內(nèi)黃酮類(lèi)成分的溶出速度，且具有提取條件溫和、提取黃酮的品質(zhì)高等特點(diǎn)[10-11]；超聲波提取法是利用超聲波的振動(dòng)作用使植物組織結(jié)構(gòu)形成空洞，結(jié)合其具有的熱效應(yīng)能加速胞內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，因而該法具有提取時(shí)間短、黃酮得率高的特點(diǎn)[12-13]。超聲-纖維素酶協(xié)同提取法結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取[14-16]，但采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此本研究以竹茹作為原料，總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹中的總黃酮，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)選出最佳提取工藝條件，同時(shí)利用DPPH 法、ABTS 法和FRAP法評(píng)價(jià)竹茹總黃酮提取物的體外抗氧化活性，為竹茹的深入開(kāi)發(fā)利用以及竹茹總黃酮提取物作為天然抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹茹 購(gòu)自千金大藥房（湖南省長(zhǎng)沙市天心區(qū)），經(jīng)長(zhǎng)沙學(xué)院唐偉卓副教授鑒定為禾本科植物青稈竹Bambusa tuldoidesMunro 莖稈的干燥中間層；蘆丁、VC標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）成都埃法生物科技有限公司；纖維素酶（活力≥400 U/mg）Sigma 公司；ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、DPPH、硝酸鋁、三氯化鐵、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、氫氧化鈉 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

F-040SD 超聲波清洗機(jī) 深圳福洋科技集團(tuán)有限公司；Agilent Cary 60 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 安捷倫科技公司；Bioteck Synergy2 酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；SN-HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海尚儀儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹茹總黃酮的提取 將竹茹干燥、粉碎。精密稱(chēng)取竹茹粉末2.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 60%乙醇溶液（料液比為1:25（g/mL）），在水浴中加熱至60 ℃，用鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5，在如下條件下進(jìn)行提?。豪w維素酶添加量5%（酶與物料的質(zhì)量比）、超聲溫度60 ℃、超聲功率240 W、超聲時(shí)間30 min，提取完成后在100 ℃下加熱5 min使纖維素酶失活，減壓抽濾，得竹茹提取液，用60%乙醇溶液定容至100 mL，備用。

1.2.2 竹茹總黃酮的含量測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考Liu 等[17]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 蘆丁對(duì)照品，置于50 mL 容量瓶中，加入60%乙醇超聲溶解并定容，搖勻，得到濃度為0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。依次吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于10 mL 具塞比色管中，并加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻后靜置7 min；再加入10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻后靜置7 min；然后再加入4%氫氧化鈉5 mL，搖勻后用60%乙醇定容至10 mL，靜置15 min。以加0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，在510 nm 處分別測(cè)定各溶液的吸光值。以吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=5.9054C+0.0479（R2=0.9993）。結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.06 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 竹茹總黃酮的含量測(cè)定 精密吸取3.0 mL竹茹樣液于10 mL 比色管中，按“1.2.2.1”中的方法測(cè)定其吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程獲得樣品溶液中的總黃酮濃度，并按照公式（1）計(jì)算樣品的總黃酮得率。

式中：M 為竹茹樣品的取樣量，mg；N 為稀釋倍數(shù)；V 為提取液定容的最終體積，mL；C 為測(cè)試液總黃酮濃度，mg/mL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在固定纖維素酶添加量5%、提取溶液pH5、乙醇濃度60%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:25（g/mL）、超聲時(shí)間30 min的條件下，每個(gè)因素設(shè)6 個(gè)水平：纖維素酶添加量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、提取溶液pH（3、4、5、6、7、8）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超聲功率（160、200、240、280、320、360 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）和超聲時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min），考察各單因素對(duì)竹茹總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇3 個(gè)對(duì)竹茹總黃酮得率影響較大的因素：乙醇濃度（A）、提取溶液pH（B）和超聲功率（C）為考察因素，以總黃酮得率為指標(biāo)，采用Design-Expert 10 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology design

1.2.5 竹茹總黃酮體外抗氧化活性分析

1.2.5.1 DPPH 法測(cè)定抗氧化活性 參考IryanaIhsanpuro 等[18]的方法并稍作修改。精密吸取100 μL 不同濃度的竹茹總黃酮溶液（10、20、40、80、160、320 μg/mL）和100 μL 0.3 mmol/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃下避光條件下放置30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光值；采用VC作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH 自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中，A1為100 μL DPPH 無(wú)水乙醇溶液+100 μL樣品液的吸光值；A2為100 μL 無(wú)水乙醇溶液+100 μL樣品液的吸光值；A0為100 μL DPPH 無(wú)水乙醇溶液+100 μL 無(wú)水乙醇溶液的吸光值。

1.2.5.2 ABTS 法測(cè)定抗氧化活性 參考Pablo 等[19]的方法并加以修改。精密吸取100 μL 不同濃度的竹茹總黃酮溶液（10、20、40、80、160、320 μg/mL）和100 μL ABTS 工作液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃下避光條件下放置30 min，于734 nm 處測(cè)定吸光值；采用VC作為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

式中，A1為100 μL ABTS 工作液+100 μL 樣品液的吸光值；A2為100 μL 無(wú)水乙醇溶液+100 μL 樣品液的吸光值；A0為100 μL ABTS 工作液+100 μL無(wú)水乙醇溶液的吸光值。

1.2.5.3 FRAP 法測(cè)定抗氧化能力 參照Wang 等[20]的方法，并稍作修改。將300 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（用40 mmol/L HCl配制）、20 mmol/L 的FeCl3溶液按體積比10:1:1的比例混勻，37 ℃保溫30 min，得FRAP 工作液[9]。精密吸取5 μL 不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）和150 μL FRAP工作液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃避光條件下放置30 min，于593 nm 處測(cè)定吸光值。以FeSO4·7H2O 溶液濃度C（mmol/L）對(duì)吸光值（A）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.329C+0.3461，R2=0.9997，F(xiàn)eSO4·7H2O 線性范圍為0.1～1.0 mmol/L。

準(zhǔn)確配制不同濃度的竹茹總黃酮溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。實(shí)驗(yàn)組加入5 μL不同濃度樣品和150 μL FRAP 工作液，空白組加入5 μL 無(wú)水乙醇與150 μL FRAP 工作液，對(duì)照組加入5 μL 不同濃度樣品和150 μL 醋酸緩沖液（pH3.6）。避光放置30 min，于593 nm 處測(cè)定吸光值，空白組吸光值為A0，實(shí)驗(yàn)組吸光值為A1，對(duì)照組吸光值為A2。然后根據(jù)FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的實(shí)際吸光值（即A1-A2-A0）換算為FeSO4·7H2O 的濃度值（FRAP，mmol/L），F(xiàn)RAP 值越大，表示其抗氧化活性越強(qiáng)。另取VC作為陽(yáng)性對(duì)照，同法測(cè)定其總抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)；采用Origin 2021、Excel 2021 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理、制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1A可知，纖維素酶添加量為5%時(shí)，竹茹總黃酮得率最大，為0.68%±0.01%。當(dāng)纖維素酶添加量在1%～5%范圍時(shí)，隨纖維素酶添加量的增加，竹茹總黃酮的得率呈上升趨勢(shì)，這可能是由于隨著纖維素酶含量的增加，其對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用增強(qiáng)，促進(jìn)了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出。當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)5%時(shí)，竹茹總黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槊附獠糠掷w維素和過(guò)多的酶附著在竹茹顆粒表面，阻塞了黃酮類(lèi)成分的溶出，導(dǎo)致總黃酮得率下降[21]。因此，選擇最佳纖維素酶添加量為5%。

圖1 纖維素酶添加量（A）、提取溶液pH（B）、乙醇濃度（C）、超聲功率（D）、超聲溫度（E）、料液比（F）和超聲時(shí)間（G）對(duì)竹茹總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of amount of cellulase added (A),pH of extraction solvents (B),ethanol concentration (C),ultrasonic power (D),ultrasonic temperature (E),material-liquid ratio (F) and ultrasonic time (G) on the total flavonoids yield of Bambusae Caulis in Taeniam

2.1.2 提取溶液pH 對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1B可知，當(dāng)pH 在3～5 范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)pH 大于5 時(shí)，總黃酮得率顯著（P<0.05）下降。這可能是因?yàn)槔w維素酶的最適pH 在5 附近，在最適pH 下，該酶的活力最強(qiáng)。當(dāng)大于或小于最適pH 時(shí)，纖維素酶的活性都會(huì)降低，從而導(dǎo)致酶作用于提取竹茹總黃酮的效果受到影響，得率降低[22]。因此，選擇提取溶液pH（4、5、6）三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1C 可知，乙醇濃度為60%時(shí)，竹茹總黃酮的得率最高，為0.57%±0.01%。當(dāng)乙醇濃度在40%～50%范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)；乙醇濃度在50%～60%范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)顯著（P<0.05）上升趨勢(shì)，這可能是因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物大多為醇溶性成分，在一定范圍內(nèi)，其溶出率隨著醇濃度的增加而提高[23]。當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)橐掖紳舛却笥?0%時(shí)，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，另外，乙醇濃度過(guò)高會(huì)使纖維素酶活性降低，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[24]。因此，選擇乙醇濃度50%、60%、70%三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1D 可知，超聲功率為240 W 時(shí)，竹茹總黃酮得率最高，為0.71%±0.01%。當(dāng)超聲功率在160～200 W 范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)；超聲功率在200～240 W 時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)顯著（P<0.05）上升趨勢(shì)；當(dāng)超聲功率超過(guò)240 W 時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)楫?dāng)超聲功率較低時(shí)，產(chǎn)生的機(jī)械及空化效應(yīng)對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度較小，故總黃酮得率不高。隨著超聲功率不斷增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，細(xì)胞壁破碎程度加大，總黃酮得率升高。當(dāng)超聲功率超過(guò)240 W 時(shí)，總黃酮得率隨著超聲波功率的增加而減少，是因?yàn)槌暡üβ蚀螅趶?qiáng)大的機(jī)械振動(dòng)作用下，提取劑的流動(dòng)加快，導(dǎo)致超聲波的停留時(shí)間減少，同時(shí)空化作用增強(qiáng)后，將產(chǎn)生大量的無(wú)用空化泡，會(huì)增加超聲波的散射衰減，同時(shí)超聲波功率增大，也會(huì)加快黃酮的氧化作用，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[25]。因此，選擇超聲功率200、240、280 W 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.5 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1E 可知，超聲溫度為60 ℃時(shí)，竹茹總黃酮的得率最高，為0.66%±0.01%。當(dāng)超聲溫度在30～60 ℃范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率隨超聲溫度的升高而增大，這可能是因?yàn)闇囟壬哂欣诩涌旆肿舆\(yùn)動(dòng)速度和提高纖維素酶的活性，使黃酮類(lèi)成分更易于從細(xì)胞內(nèi)溶出，從而提高總黃酮得率。當(dāng)超聲溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，總黃酮的得率隨超聲溫度的升高而下降，這可能是因?yàn)闇囟瘸^(guò)一定極限后，黃酮類(lèi)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)易被破壞，且溫度過(guò)高會(huì)使纖維素酶活力下降，另外，溫度過(guò)高時(shí)，超聲所產(chǎn)生的氣泡中蒸汽壓增大，氣泡閉合時(shí)增強(qiáng)了緩沖作用而使空化作用減弱，從而導(dǎo)致總黃酮得率降低[26]。因此，超聲溫度選擇60 ℃為最佳。

2.1.6 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1F 可知，料液比為1:30（g/mL）時(shí)，竹茹總黃酮得率最大，為0.75%±0.02%。當(dāng)料液比在1:10～1:30（g/mL）范圍時(shí)，竹茹總黃酮得率隨料液比的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比超過(guò)1:30（g/mL）時(shí)，繼續(xù)提高料液比竹茹總黃酮得率差異不顯著（P>0.05）。原因?yàn)榱弦罕冗^(guò)低，原料與提取溶劑接觸不充分，黃酮未被有效溶出；增大料液比，原料被充分浸沒(méi)在提取溶劑中，在超聲波作用下黃酮被充分溶出，得率提高；料液比過(guò)大時(shí)，體系中的可溶性物質(zhì)會(huì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，影響黃酮提取，另外，過(guò)高的料液比會(huì)造成纖維素酶的稀釋?zhuān)蛊浠盍ο陆?，?dǎo)致總黃酮得率降低[27]。因此，選擇最佳料液比為1:30（g/mL）。

2.1.7 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 如圖1G 所示，超聲時(shí)間在20～30 min 范圍時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，竹茹總黃酮的得率最高，為0.69%±0.01%。當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min 時(shí)，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。原因可能是在提取黃酮的最開(kāi)始階段，溶劑內(nèi)外存在較大的濃度差，因此隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮會(huì)迅速進(jìn)入提取溶劑中，從而提高黃酮得率；但隨著超聲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，樣品中其他醇溶性物質(zhì)被浸提出來(lái)，導(dǎo)致總黃酮得率有所下降[28]。綜合考慮時(shí)間和成本問(wèn)題，超聲時(shí)間選擇30 min 為最佳。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化竹茹總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由以上幾組單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇濃度、提取溶液pH 和超聲功率對(duì)工藝的影響較大，而料液比、超聲時(shí)間、纖維素酶添加量和超聲溫度則可分別固定為1:30（g/mL）、30 min、5%和60 ℃。根據(jù)三因素三水平的原則，將乙醇濃度定為50%、60%、70%；提取溶液pH 定為4、5、6；超聲功率定為200、240、280 W，設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn)（表2）。

表2 竹茹總黃酮提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology of extracting total flavonoids of Bambusae Caulis in Taeniam

2.2.2 方差分析 采用Design-Expert 10 軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次多元回歸方程為Y=0.84+3.125×10-3A-9.625×10-3B+1.000×10-3C-2.500×10-3AB-3.750×10-3AC+3.750×10-3BC-0.035A2-0.017B2-0.030C2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3 可知，回歸模型方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該回歸模型顯著（P<0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.9132>0.05），表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型的決定系數(shù)R2=0.9916，說(shuō)明該模型擬合度好，相關(guān)性好，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9866，說(shuō)明該回歸模型能較好地反應(yīng)出因素和因變量的關(guān)系，可信度高，可用于超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮工藝參數(shù)的初步分析和預(yù)測(cè)。由表3 中P值可知，其中一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)竹茹總黃酮得率有極顯著影響（P<0.01）；一次項(xiàng)B 對(duì)竹茹總黃酮得率有顯著影響（0.010.05）。由F值可知，各因素對(duì)竹茹總黃酮得率的影響的大小順序?yàn)槌暪β剩–）>乙醇濃度（A）>提取溶液pH（B）。

2.2.3 交互作用分析 乙醇濃度（A）、提取溶液pH（B）和超聲功率（C）兩兩交互作用對(duì)竹茹總黃酮得率的影響結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 可知，乙醇濃度（A）和超聲功率（C）交互作用的曲面有極大值，坡度較陡峭，說(shuō)明這一組交互作用對(duì)竹茹總黃酮得率的影響顯著，而乙醇濃度（A）與提取溶液pH（B）交互作用、提取溶液pH（B）與超聲功率（C）交互作用的曲面坡度較平緩，說(shuō)明這兩組交互作用對(duì)竹茹總黃酮得率的影響不顯著，這與表3中交互項(xiàng)P值分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，得到竹茹總黃酮的最佳提取工藝條件為超聲功率239.8 W、乙醇濃度60.54%、提取溶液pH4.72，該條件下竹茹總黃酮的理論得率為0.84%。根據(jù)實(shí)際情況，將提取工藝調(diào)整為纖維素酶添加量5%、提取溶液pH4.7、乙醇濃度61%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時(shí)間30 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到竹茹總黃酮的得率為0.83%±0.02%，這與理論估計(jì)值0.84%非常接近，表明該模型準(zhǔn)確可靠，能對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，因此將此提取工藝作為竹茹總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。此外，利用本研究建立的總黃酮含量測(cè)定方法對(duì)所得竹茹提取物中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為16.21%±0.42%。

2.3 不同提取方法的比較

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)及“1.2.3”項(xiàng)單因素實(shí)驗(yàn)和“1.2.4”項(xiàng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置回流提取法、超聲波提取法、纖維素酶提取法和超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的工藝參數(shù)，考察不同提取方法對(duì)竹茹總黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。與超聲波提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了53.70%，原因可能是使用纖維素酶后，細(xì)胞壁上的纖維素有部分降解，甚至有些細(xì)胞會(huì)破裂，促進(jìn)了黃酮類(lèi)成分的釋放，所以總黃酮得率會(huì)提高[29]。與纖維素酶提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了72.92%，原因可能是使用超聲波，可以產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)及攪拌作用，促進(jìn)了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，所以總黃酮得率會(huì)提高[29]。與回流提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了45.61%，原因可能是使用了纖維素酶和超聲波，兩者都能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的釋放，所以總黃酮得率會(huì)更高，而且超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法還具有提取條件溫和、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[29]。綜上所述，與其他幾種提取方法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法更適合于竹茹總黃酮的提取。

表4 不同提取方法對(duì)竹茹總黃酮得率的影響Table 4 Effects of different extraction methods on the total flavonoids yield of Bambusae Caulis in Taeniam

2.4 竹茹總黃酮的體外抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH 自由基能力 由圖3 可知，在10～320 μg/mL 范圍內(nèi)，竹茹總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力弱于同濃度的VC。隨著濃度的增加，兩者對(duì)DPPH 自由基的清除作用均增大，在320 μg/mL時(shí)竹茹總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率為70.33%±1.21%，低于VC的73.68%±2.25%。另外，在10～320 μg/mL 范圍時(shí)，VC及竹茹總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率與其濃度相關(guān)性較好。由回歸方程求得VC和竹茹總黃酮提取物的IC50值分別為123.5 和150.1 μg/mL。以上結(jié)果表明，雖然竹茹總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力弱于VC，但也具有較強(qiáng)的清除能力，且與濃度具有量效關(guān)系。

圖3 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radicals by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

2.4.2 清除ABTS+自由基能力 由圖4 可知，樣品濃度在10～320 μg/mL 范圍時(shí)，竹茹總黃酮提取物和VC對(duì)ABTS+自由基清除率隨著濃度的增加均逐漸增強(qiáng)，兩者之間的差距也逐漸縮小。當(dāng)樣品濃度在80～320 μg/mL 范圍時(shí)，竹茹總黃酮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力高于VC，濃度達(dá)到320 μg/mL時(shí)，竹茹總黃酮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除率為76.97%±1.86%，略高于VC的76.77%±2.14%。另外，在10～320 μg/mL 范圍時(shí)，VC及竹茹總黃酮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除率與其濃度相關(guān)性較好。由回歸方程求得竹茹總黃酮提取物和VC的IC50值分別為44.6 和35.1 μg/mL。以上結(jié)果表明，雖然竹茹總黃酮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力弱于VC，但也具有較強(qiáng)的清除能力，且與濃度具有量效關(guān)系。竹茹中的黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化作用可能是由于其結(jié)構(gòu)上存在羥基，其能夠通過(guò)與自由基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生，從而產(chǎn)生抗氧化作用[30]。

圖4 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS+ free radicals by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

2.4.3 鐵離子還原能力 在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被樣品中抗氧化物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ，并呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，在593 nm 處有強(qiáng)吸收。當(dāng)體系中的Fe3+-TPTZ 過(guò)量時(shí)，檢測(cè)Fe2+-TPTZ 的生成量可評(píng)價(jià)樣品的還原能力，即鐵離子還原能力（總抗氧化能力）[31]。鐵離子還原能力以FRAP 值衡量，F(xiàn)RAP 值越大，還原能力越強(qiáng)[31]。由圖5 可知，樣品濃度在0.1～1.0 mg/mL 范圍時(shí)，隨著濃度的增加，竹茹總黃酮提取物和VC的FRAP 值均有所提高。當(dāng)樣品濃度在0.1～0.4 mg/mL 范圍時(shí)，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值與VC相比，相差不大，當(dāng)樣品濃度在0.4～1.0 mg/mL 范圍時(shí)，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值與VC相差較大，且竹茹總黃酮提取物的FRAP 值大于VC，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值為2.63 mmol/L，高于VC的1.75 mmol/L。以上結(jié)果表明竹茹總黃酮提取物具有良好的鐵離子還原能力，且與濃度具有量效關(guān)系。

圖5 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 的鐵離子還原能力Fig.5 Ferric reducing ability by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

3 結(jié)論

本研究采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同法提取竹茹總黃酮，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選出竹茹總黃酮的最佳提取工藝條件為：纖維素酶添加量5%、提取溶液pH4.7、乙醇濃度61%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時(shí)間30 min。在此條件下，竹茹總黃酮的得率為0.83%±0.02%，回歸模型的實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值0.84%接近（<0.03%），表明該模型可靠。該結(jié)果可為今后的相關(guān)研究提供技術(shù)支持和工藝參考，加快竹茹資源的開(kāi)發(fā)與利用。

體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，竹茹總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，其對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基的IC50值分別為150.1 μg/mL 和44.6 μg/mL，同時(shí)還具有較好的鐵離子還原能力（強(qiáng)于VC）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了竹茹總黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可為其今后作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品等領(lǐng)域提供數(shù)據(jù)支撐。